Name: Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Öğrenin, pirinç dokularında PAMP tetiklemeli immün yanıtta reaktif oksijen türlerinin L-012 bazlı kemilüminesans ile gerçek zamanlı tespiti için optimize edilmiş bu standart yöntemi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Şangay Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe Numarası: 21ZR1429300 / BS1500016), Şangay Jiao Tong Üniversitesi (Agri-X programı, Hibe Numarası: AF1500088/002), Şangay İşbirlikçi Tarım Tohumları İnovasyon Merkezi (Hibe Numarası: ZXWH2150201/001) tarafından Jiangbo Fan'a ve Shanghai Jiao Tong Üniversitesi Tıp-Mühendislik İşbirliği Projesi (hibe numarası: 21X010301734) tarafından Can Li'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

NOT: Protokol farklı bitki dokularına uygulanabilir. Bu protokolde PAMP inisitümü üzerine ROS tespiti için pirinç kılıfı ve yaprak diskleri kullanılmıştır. Farklılıklar esas olarak örnekleme yönteminden kaynaklandığından, aşağıda yalnızca ortak prosedürler açıklanmış ve gerektiğinde belirli adımlardan bahsedilmiştir.
1. Bitki kültürü
<ol><li>Kabuğu çıkarılmış pirinç tohumlarını 1 dakika boyunca% 70 etanol, daha sonra 1 saat boyunca% 40 sodyum hipoklorit (NaClO) ile sterilize edin. Ardından, kalan kloru gidermek için tohumları 5 kat steril suyla durulayın.</li>
	<li>Tohumları aseptik olarak 1/2 MS ortamında (2.37 g / L Murashige ve Skoog (MS) ortamı, 30 g / L sakaroz, 2.1 g / L fitajel, pH 5.7, otoklavlanmış) kaplayın.<ol><li>Pirinç kılıfı yönteminde, tohumları doğrudan steril cam kapta MS ortamı ile kaplayın.</li>
		<li>Yaprak disk yönteminde, tohumları MS plakalarında 5-7 gün bekletin ve büyüme matrisine veya toprağa nakledin (Şekil 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Fideleri 12 saat ışık / 12 saat karanlık fotoperiyot ile bir büyüme odasında büyütün.</li>
</ol>2. Doku hazırlama ve ön tedavi
<ol><li>Pirinç kılıfı<ol><li>10 günlük pirinç fidelerinin kılıfını, ROS tahlilinden 1 gün önce ön işlem için keskin bir tıraş bıçağı veya cerrahi bıçakla 3 mm'lik parçalara ayırın (Şekil 1B).</li>
		<li>Beş kılıf segmentini, 10-12 saat boyunca 100 μL ddH 2 O içeren 96 delikli bir mikrotitre plakasınınbireysel bir kuyucuğuna, karanlıkta 25 ° C'de yerleştirin, bu da yara yaralanmasına bağlı iyon sızıntısının ve savunma tepkilerinin azalmasına izin verir (Şekil 2). NOT: Elimitasyon çözeltisine maruz kalan tutarlı bir kesme yüzeyi alanı sağlamak için kesimlerin dikey tutulmasına özen gösterilmesi, yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için önemli bir adımdır. Segmentleri yavaşça hareket ettirin. Segmentlerde, veri varyasyonu kaynağı olabilecek fazladan kesikler veya yaralar yapmayın. Prensip olarak, ROS değerinin değişimi büyük olduğu için her test en az beş çoğaltma içermelidir. Ne kadar çok çoğaltma kümesi olursa, veriler o kadar güvenilir olur.</li>
	</ol></li>
	<li>Yaprak disk<ol><li>4-6 haftalık pirinç bitkilerinden yaprak disklerini (4 mm çapında) bir pistonla biyopsi zımba kullanarak kesin. Veri varyasyonunu azaltmak için yaprak disklerini her zaman ana yeke makinesinin ikinci yaprağının orta üçte birinden (üstten numaralandırılmış) kesin (Şekil 1C).</li>
		<li>Bir yaprak diskini, ön işlem için 10-12 saat boyunca 100 μL ddH 2 O içeren 96 deliklibir mikrotitre plakasının bireysel bir kuyucuğuna yerleştirin, bu da PAMP'ler tarafından ROS'un indüksiyonuna müdahale edebileceğinden yaralanma ile ilgili tepkilerin azalmasına izin verir (Şekil 2). NOT: Yaprak diskleri yavaşça çalıştırın. Deneydeki disklerde veri varyasyonuna neden olabilecek fazladan kesikler veya yaralar açmayın. ROS'un indüksiyonu çoğunlukla kesilmiş kenarın hücrelerinden meydana gelir, çünkü pirinç dokularının yüzeyleri (yapraklar veya kılıflar) hidrofobik tabakalarla kaplıdır. Sadece kesilmiş kenarların hücreleri uyarılma çözeltisi ile temas halindedir (tartışma bölümüne bakınız).</li>
		<li>Tüm yaprak disklerini, abaksiyel yüzey yukarı bakacak şekilde, yaprak tarafı ile ilişkili varyasyonları önlemek için su ön arıtımı için bir mikrotitre plakasının kuyularında yüzer halde tutun.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig01.jpg"> Şekil 1: Kılıf örneklemesi için pirinç fidelerinin büyüme durumu ve aşamaları ve tahlilde kullanılan pirinç kılıfı ve pirinç yapraklarının parçaları. (A) 10 gün boyunca steril koşullarda 1/2 MS ortamında yetiştirilen pirinç fideleri ROS testi için örneklenebilir. Sterilize edilmiş pirinç tohumları 1/2 MS ortamında kültürlendi ve 8,5 cm çapında ve 15 cm yüksekliğinde şeffaf cam şişede 12 saat ışık/12 saat karanlık fotoperiyotta yetiştirildi. (B) Yaprak kılıflarının örnekleme kısımlarının şematik diyagramı. Yaprak kılıfları 10 günlük pirinç fidelerinden kesildi. Yaprak kılıflarının pozisyonları köklerin üstünde ve ilk yaprağın altındaydı. (C) Yaprak disklerin örnekleme konumunun şematik diyagramı. Yaprak diskleri, herhangi bir büyüme aşamasında sağlıklı pirinç bitkilerinin ana yeke makinesinin ikinci yaprağının orta üçte birinden (üstten sayım) kesilebilir. Kısaltmalar: ROS = reaktif oksijen türleri; MS = Murashige ve Skoog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig02.jpg"> Resim 2: Farklı Oryza sativa hatları ile ROS üretimini ölçmek için plaka kurulumunun şematik diyagramı. 96 delikli bir plaka kullanarak pirinç dokularının ön işlemi ve testi. Satır 1, Satır 2 ve Satır 3 (bir plakada sekiz satıra kadar) ilgilenilen herhangi bir malzeme, farklı çeşitler, mutantlar veya transgenik çizgiler olabilir. ROS yanıtını ölçmek için dokular PAMP (PAMP, beyaz) veya PAMP olmadan (ddH2O, gri) uyarılma solüsyonları ile uyarıldı. Test edilecek numuneler ne kadar fazla olursa, okumalar arasındaki zaman aralığının o kadar uzun olduğu belirtilmelidir. Kısaltmalar: ROS = reaktif oksijen türleri; PAMP = patojenle ilişkili moleküler patern; ddH2O = çift damıtılmış su. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. Uyarma çözeltisinin hazırlanması
<ol><li>L-012 tozunu stok çözeltisini yapmak için ddH2O ile 20 mM (6.23 mg / mL) sulu çözelti halinde çözün. Daha sonra, çalışma çözeltisini 500 μM L-012'nin son konsantrasyonunda yapmak için stok çözeltisini 50 mM Tris HCl tamponu (pH 7.5) ile seyreltin. Stok çözeltisini donmuş halde tutun ve kullanmadan önce çalışma çözeltisine seyreltin.</li>
	<li>PAMP, L-012 ve yaban turpu peroksidaz (HRP; ddH2O'da 10 mg / mL) içeren elimitasyon çözeltisini hazırlayın. 10 mL'lik bir uyarılma çözeltisi için, 9,4 mL'lik 50 mM Tris HCl (pH 7,5) çözeltisini, 400 μL'lik L-012 çözeltisini, 100 μL'lik HRP'yi ve 100 μL'lik flg22'yi (PAMP;ddH2O'da 10 mM) karıştırın. Negatif kontrol için, PAMP yerine 100 μL ddH2O ekleyin. NOT: Pirinç dokularında soğuk stresi önlemek için hazırlanan uyarma çözeltilerini oda sıcaklığında tutun. Diğer PAMP'ler de kitin (nihai konsantrasyonda 20 ng / mL) gibi gerektiğinde tedavi için kullanılabilir. L-012 ışığa duyarlı olduğundan, L-012 çözeltisi içeren tüm tüpleri alüminyum folyo ile örtün.</li>
</ol>4. Yazılımı başlatmak ve protokolü referans verilen mikroplaka okuyucu ile kurmak (bkz.
NOT: Mikroplaka okuyucu yazılımının parametrelerinin ayarlanması biraz zaman alır. Uyandırma çözeltisini eklemeden önce makineyi ve protokolü hazırlamanız önerilir (devam etmek için tek bir tıklama).
<ol><li>Yazılımı başlatın. Yeni bir protokol oluşturmak veya mevcut bir protokolü kullanmak için Denemeler düğmesini tıklayın.</li>
	<li>Plakayı ayarlamak için açılır pencerede Prosedür'ü tıklayın. İzlenecek plakadan kuyucukları seçin.</li>
	<li>Toplam çalışma süresini ve okuma aralığını ayarlamak için Kinetic'i Başlat'ı tıklatın. Deneme süresini, deneysel gereksinimlere bağlı olarak 35 dakika veya daha uzun bir süreye ayarlayın. Okumaları mümkün olduğunca sık elde etmek için Minimum Aralık'ı seçin. Entegrasyon süresi için, sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 1 s veya daha uzun bir süre seçin. NOT: Okuma aralığı, numune sayısına ve sinyal entegrasyon süresine bağlıdır.</li>
	<li>Doğrula'ya tıklayın | Tamam ayarları onaylamak için.</li>
	<li>Açılır pencerede Yeni plakayı algıla'ya tıklayın ve yazılımın yükleme plakası iletişim kutusunu sormasını bekleyin. Test edilecek plakayı taşıyıcıya yerleştirin.</li>
	<li>Uyandırma sisteminin kurulmasını beklemek için burada durun (bir sonraki bölümde). Uyandırma sistemi hazır olur olmaz, okumaya başlamak için Çalıştır'a tıklayın.</li>
</ol>5. Uyandırma sisteminin kurulması ve gerçek zamanlı ROS üretiminin ölçülmesi
<ol><li>ddH2O'yu önceden işlenmiş dokuları içeren kuyucuklardan dikkatlice çıkarın, herhangi bir doku hasarı veya kurumasını önleyin.</li>
	<li>Dokuları içeren kuyucuklara 200 μL uyarma çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
	<li>Karıştırmak için hafifçe sallayın. Algılamayı başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın. NOT: PAMP tedavisi ile bitki dokuları çok hızlı bir şekilde yanıt verir ve ROS üretir. Bu nedenle, birden fazla tedavinin olduğu durumlarda, ameliyat süresini azaltmak için öncelikle PAMP'sız negatif kontrolün tedavi edilmesi önerilmektedir. Tedaviler arasındaki uyarılma gecikmesini azaltmak için mümkün olduğunca çabuk çalışın. Uyarma çözeltisinin eklenmesi ile tespitin başlaması arasındaki süre ne kadar kısa olursa, önemli deneysel verilerin yakalanması o kadar iyi olur.</li>
</ol>

<ol><li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li>
<li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+are+good%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li>
<li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+calcium%2C+and+electric+signals%3A+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li>
<li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+gene+network+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li>
<li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+burst+of+plant+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+oxidases%3A+the+engines+of+ROS+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li>
<li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li>
<li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li>
<li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li>
<li>Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li>
<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu çalışmanın amacı, pirinç dokularında PAMP'a yanıt olarak erken ROS üretimini ölçmek için oldukça etkili bir yöntem oluşturmaktır. Bu yöntem, işlenmiş pirinç dokularından üretilen apoplast ROS'un gerçek zamanlı olarak belirlenmesi için standartlaştırılmış bir prosedür sağlar. Bu yöntem kullanımda basit, düşük maliyetli, bileşimde berrak ve ticari kitlerden bağımsızdır. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar bitkiler biyotik veya abiyotik streslere maruz kaldıklarında apoplast ROS'un gerçek zamanlı üretimini inceleyebili...

Reaktif oksijen türleri (ROS), süperoksit anyon radikalleri (O2-) ve türevleri, hidroksil radikalleri (OH-), hidrojen peroksit ve plastitlerde ve kloroplastlarda, mitokondrilerde, peroksizomlarda ve diğer hücre altı konumlarda sürekli olarak üretilen singlet oksijen veya oksidasyon-indirgeme reaksiyonlarının ürünleri dahil olmak üzere bir dizi kimyasal olarak aktif oksijen türevini içerir1 . ROS birçok biyolojik süreçte önemli rol oynar ve tüm bitkiler için gereklidir 2,3,4. ROS fonksiyonlarının geniş spektrumu, büyüme ve gelişmenin düzenlenmesinden abiyotik ve biyotik streslerin algılanmasına kadar değişir 5,6,7,8.
Bitki bağışıklık sisteminde, bitki hücresi plazma zarı-lokalize reseptörler-sözde örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) - patojen kaynaklı kimyasalları-patojenle ilişkili moleküler paternleri (PAMP'ler) algılar. Bu tanıma, kalsiyum akışı, ROS patlaması ve MAPK kaskadı dahil olmak üzere bir dizi hızlı bağışıklık tepkisini tetikler; Bu nedenle, bu bağışıklık katmanı PAMP ile tetiklenen bağışıklık (PTI) olarak adlandırılır. ROS patlaması, PTI ileilgili çalışmalara yaygın olarak uygulanan 9,10 numaralı ayırt edici bir PTI yanıtıdır. PAMP'ler tarafından tetiklenen ROS üretimi, süperoksit dismutaz 8 tarafından kendiliğinden hidrojen peroksite (H2 O2) dönüştürülen süperoksit (O2-) üretmek için elektronları sitozolik NADPH veya NADH'den hücre dışı oksijene aktaran plazma zarında yerleşik NADPH oksidaz veya solunum patlaması oksidaz homolog(RBOH) ailesi proteinlerine atfedilir . PAMP tarafından tetiklenen ROS patlaması oldukça hızlıdır, PAMP tedavisinden sadece birkaç dakika sonra ortaya çıkar ve ~ 10-12 dakikada zirveye ulaşır. ROS moleküllerinin büyük çoğunluğu, bir kemilüminesans testi ile kolayca ve istikrarlı bir şekilde tespit edilebilen hidrojen peroksit (H2O2) içerir.
Kemilüminesansta, kemilüminesans reaktifi, uyarılmış durum ara ürünlerini üretmek için bir katalizörün etkisi altında aktif oksijenle reaksiyona girer. Daha sonra, üründeki elektronlar ışınımsal olmayan geçiş yoluyla zemin durumuna geri döner ve fotonlar yayar. Yaygın kemilüminesans reaktifleri luminol ve L-012'yi içerir ve luminol uygulamaya 11,12,13 hakimdir. Bununla birlikte, daha fazla araştırmacı ROS üretimini tespit etmek için L-012'yi seçmektedir, çünkü L-012, luminol'e kıyasla nötr veya nötr pH koşullarına yakın koşullar altında çok daha yüksek bir ışık emisyon verimliliğine sahiptir.
Bu yazıda, pirinç (Oryza sativa) doku-yaprak diskleri ve kılıfında PAMP'lerin ortaya çıkarılmasından sonra ROS üretiminin gerçek zamanlı tespiti için L-012'ye dayanan optimize edilmiş bir kemilüminesans yöntemi açıklanmaktadır. Burada sağlanan yöntem basit, kararlı ve standartlaştırılmıştır ve farklı deneysel ihtiyaçları karşılamak için oldukça uyarlanabilir. Bu yöntemle elde edilen veriler, sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>96 oyuklu mikrotitre plakası</td><td>WHB</td><td>WHB-96-01</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>Innochem</td><td>A43543</td><td></td></tr><tr><td>flg22</td><td>Sangon Biotech</td><td>p20973</td><td>PAMP</td></tr><tr><td>Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td>yazılımı</td></tr><tr><td>L-012</td><td>FUJIFILM</td><td>120-04891</td><td>8-amino-5-kloro-7-fenil-2,3-dihidropirido [3,4-d] piridazin-1,4-dion, CAS #:143556-24-5</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>MS Medium</td><td>Solarbio</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCLO</td><td>Aladdin</td><td>S101636</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpundan Peroksidaz (HRP)</td> <td>Sigma</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Örnekleyici</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>15110-40</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sangon Biyoteknoloji</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon Biyoteknoloji</td><td>A610195</td><td></td></tr></tbody></table>

kemilüminesans testi ile pirinçte İmmün yanıtta reaktif oksijen türleri Üretiminin gerçek zamanlı tespiti

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reaktif oksijen türleri (ROS), abiyotik ve biyotik streslerin algılanması da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde hayati roller oynamaktadır. Patojen enfeksiyonu veya patojenle ilişkili kimyasallarla (patojenle ilişkili moleküler desenler [PAMP'ler]) meydan okuması üzerine, bir ROS patlaması da dahil olmak üzere bir dizi bağışıklık tepkisi, PAMP ile tetiklenen bağışıklık (PTI) olarak adlandırılan bitkilerde hızla indüklenir. Bir ROS patlaması, bir grup plazma zarı lokalize NADPH oksidaz-RBOH ailesi proteinleri tarafından katalize edilen ayırt edici bir PTI yanıtıdır. ROS'un büyük çoğunluğu, luminol bazlı bir kemilüminesans yöntemiyle kolayca ve istikrarlı bir şekilde tespit edilebilen hidrojen peroksit (H2O2) içerir. Kemilüminesans, luminolün veya türevinin (L-012 gibi), bir katalizörün etkisi altında ROS ile bir redoks reaksiyonuna maruz kaldığı foton üreten bir reaksiyondur. Bu makalede, pirinç dokularında PAMP inisitümü üzerine apoplast ROS üretimini gerçek zamanlı olarak tespit etmek için optimize edilmiş bir L-012 tabanlı kemilüminesans yöntemi açıklanmaktadır. Yöntem kolay, istikrarlı, standartlaştırılmış ve sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir.

Burada, flg22 işlemi ile üretilen ROS'u belirlemek için pirinç malzemesini örnek olarak alıyoruz. Uyarılmadan sonra ROS oluşumu geçicidir. Pirinçte, ROS üretimindeki artış ilk olarak 1-2 dakika içinde tespit edilmiş, 10-12 dakikada zirveye ulaşmış ve ~ 30-35 dakika içinde taban çizgisine geri dönmüştür (Şekil 3). PAMP'ın elicitation çözeltisinde bulunmadığı ve belirgin bir ROS indüksiyonu ile sonuçlanmadığı kontrol testi ile karşılaştırıldığında, spesifik bir ROS patlaması sadece flg22 veya ...

Burada, patojenle ilişkili moleküler paternle tetiklenen immün yanıtta pirinç dokularında apoplastik reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin gerçek zamanlı tespiti için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem basit, standartlaştırılmış ve kontrollü koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar üretir.

Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Bu protokol, pirinç dokularında PAMP uyarılması üzerine ROS üretimini gerçek zamanlı olarak tespit etmek için optimize edilmiş bir L-012 tabanlı kemilüminesans yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem kolay, standartlaştırılmış ve sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan On Ying olacak.Başlamak için, kabuğu çıkarılmış pirinç tohumlarını bir dakika boyunca% 70 etanol, daha sonra bir saat boyunca% 40 sodyum hipoklorit ile sterilize edin. Artık kloru gidermek için tohumları steril suyla beş kez durulayın. Pirinç kılıfı yönteminde, tohumları steril cam kapta doğrudan Murashige ve Skoog veya MS ortamı ile kaplayın.Tohumları yaprak diski yönteminde kaplamak için, onları beş ila yedi gün boyunca MS plakalarına yapıştırın ve daha sonra büyüme matrisine veya toprağa nakledin. Fideleri 12 saat ışıklı, 12 saat karanlık fotoğraf periyoduna sahip bir büyüme odasında büyütün. 10 günlük pirinç fidelerinden kılıfı, ROS tahlilinden bir gün önce ön işlem için keskin bir tıraş bıçağı veya cerrahi bıçakla üç milimetrelik parçalara ayırın.Beş kılıf segmentini, 10 ila 12 saat boyunca 100 mikrolitre çift damıtılmış su içeren 96 kuyucuklu bir mikrotitrek plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin. Yaprak disklerini dört ila altı haftalık pirinç bitkilerinden bir pistonla biyopsi zımba kullanarak kesin. Veri varyasyonunu azaltmak için yaprak disklerini her zaman ana yeke makinesinin ikinci yaprağının orta üçte birinden kesin.Daha sonra, bir yaprak diskini, ön işlem için 10 ila 12 saat boyunca 100 mikrolitre çift damıtılmış su içeren 96 kuyucuklu bir mikrotitrek plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin. Yaprak tarafı ile ilişkili varyasyonları önlemek için tüm yaprak disklerini su ön arıtımı için bir mikrotiter plakasının kuyularında yüzer ve yukarı bakacak şekilde tutun. 9.4 mililitre 50 mikromolar Tris Hcl, 400 mikrolitre L012 çözeltisi, 100 mikrolitre at turpu peroksidaz ve 100 mikrolitre Flg22'yi birleştirerek ekstraksiyon çözeltisi hazırlayın.Kuyucuklara 200 mikrolitre çıkarma çözeltisi ekleyin. Yazılımı başlatın ve yeni bir protokol oluşturmak veya mevcut bir protokolü kullanmak için deneyler düğmesine tıklayın. Plakayı ayarlamak için açılır penceredeki prosedürü tıklayın ve izlenecek plakadan kuyucukları seçin.Kinetik başlat'ı tıklatın ve deneysel gereksinimlere bağlı olarak çalışma zamanını 30 dakika veya daha uzun bir süreye ayarlayın. Okumaları mümkün olduğunca sık elde etmek için minimum aralığı seçin. Entegrasyon süresi için, sinyal yoğunluğuna bağlı olarak bir saniye veya daha uzun bir süre seçin.Ayarları onaylamak için doğrula'ya, ardından Tamam'a tıklayın, ardından açılır pencerede yeni plakayı algıla'ya tıklayın ve yazılımın yükleme plakası iletişim kutusunu sormasını bekleyin. Çift damıtılmış suyu, önceden işlenmiş dokuları içeren kuyucuklardan dikkatlice çıkarın, herhangi bir doku hasarını veya kurumasını önleyin. Dokuları içeren kuyucuklara 200 mikrolitre uyarma çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.Test edilecek plakayı taşıyıcıya yerleştirin ve algılamaya başlayın. Flg22 ile ROS'u indüklemek için yaprak diskler ve üç milimetre uzunluğunda kılıflar kullanıldı. ROS üretimi 35 dakika boyunca izlenir.Çubuklar, beş teknik tekrardan hesaplanan standart sapmaların araçlarını gösterir. Pirinçte, ROS üretimindeki artış ilk olarak bir ila iki dakika içinde tespit edildi, 10 ila 12 dakikada zirveye ulaştı ve yaklaşık 30 ila 35 dakika içinde taban çizgisine geri döndü. Toplam ROS miktarı eğriden hesaplandı.ROS değerlerinin toplam miktarını elde etmek için, oluşturulan toplam miktarı hesaplamak üzere formül toplamı uygulanarak birleştirilebilen her zaman aralığında oluşturulan ROS'u hesaplamak üzere formülü ilgili veri kümelerine uygulayın. Bir yaprak diskin tek bir deliği veya iki yarısı, 10 ila 12 saat boyunca 100 mikrolitre çift damıtılmış su ile önceden işlenmiş 96 kuyucuklu bir mikrotitrek plakanın kuyucuklarına yerleştirildi ve daha sonra ROS indüksiyonu için Flg22 ile muamele edildi. İki yarım disk örneğinden elde edilen okuma değerleri, tüm yaprak diskinden çok daha yüksektir.Ortalama olarak, iki yarım disk örneğinden elde edilen toplam değerler, numunelerin alanıyla değil, kenar uzunluğuyla orantılı olan tüm yaprak diskinden neredeyse 1,6 katıdır. Bu sonuç, ROS'un esas olarak yara bölgesindeki hücrelerde üretildiğini desteklemektedir. Bu prosedürü denerken, dokularla nazikçe çalışın ve bir veri varyasyonunun kaynağı olabilecek ekstra kesikler yapmayın.Bu yöntem, bitki dokularındaki diğer ROS üreten fizyolojik işlemlere uygulanabilir.

real-time-detection-reactive-oxygen-species-production-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada hücreler reaktif oksijen türlerinin varlığını test etmek ve değerlendirmek için basit yöntemler öneriyoruz.

Kanserler Üretim ve reaktif oksijen türlerinin (ROS Algılama)

Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Bu video, immün elisyon üzerine Arabidopsis yapraklarındaki oksidatif patlamayı ölçmek için yapılan bir testi göstermektedir. Bitki yapraklarından kesilen yaprak diskleri, mikropla ilişkili moleküler desenler veya MAMP'lar olarak işlev gören bakteriyel peptitlerle inkübe edilir. MAMP'ların tespiti üzerine, bitki hücreleri, bir kemilüminesans testi kullanılarak tespit edilen hücre dışı ROS üretimini indükler.

İmmün Ortaya Çıkarma Üzerine Arabidopsis Yaprak Disklerinde Oksidatif Patlamayı Tespit Etmek İçin Bir Test

Bu video, patojenle ilişkili moleküler model (PAMP) ortaya çıkarılması üzerine pirinç dokularında reaktif oksijen türleri (ROS) üretiminin gerçek zamanlı tespiti için bir testi göstermektedir. Kesilen kılıf segmentleri ve yaprak diskleri, bir PAMP olarak işlev gören bakteriyel flagella türevi bir peptit işlemine maruz bırakılır. Peptitin bitki hücreleri üzerindeki örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) yoluyla tanınması üzerine, bir kemilüminesans testi ile tespit edilen hızlı ve geçici bir ROS...

İmmün Ortaya Çıkarma Üzerine Pirinç Dokularında Reaktif Oksijen Türleri Üretimini Tespit Etmek İçin Bir Test

Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Burada, toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (DCFH-DA) kullanarak tespit etmek için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel ROS lokalizasyon görselleştirmek ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu ölçmek. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir.

2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti

Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Burada, geliştirilmiş bir kemotaksi test protokolü sunuyoruz. Bu protokolün amacı, geleneksel bakteriyel kemotaksi yöntemlerinin adımlarını ve maliyetlerini azaltmak ve bitki-mikrop etkileşimlerini anlamak için değerli bir kaynak olarak hizmet etmektir.

Kök Eksüdalarında Rhizobacterial Kemoattractants'ın Hızlı Tanımlanması için Geliştirilmiş Bir Kemotaksi Tahlili

Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.

Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi

Öğrenin, pirinç dokularında PAMP tetiklemeli immün yanıtta reaktif oksijen türlerinin L-012 bazlı kemilüminesans ile gerçek zamanlı tespiti için optimize edilmiş bu standart yöntemi.

Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Daha fazla video keşfet