Name: Pirinç Patlaması Hastalığının (Magnaporthe oryzae) Erken Enfeksiyon Bölgelerinin Arpa (Hordeum vulgare) Üzerinde Temel Bir Mikroskop ve Akıllı Telefon Kullanarak Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Keşfedin, arpa yaprak kılıfı yöntemiyle Magnaporthe oryzae'nin erken enfeksiyon aşamalarını temel mikroskop ve akıllı telefon kullanarak görselleştirme tekniğini. Bu basit yöntem, maliyetli ekipman olmadan fungal mutantların hızlı taramasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, USDA-NIFA ödülü 2016-67013-24816'dan fon sağladığını kabul etmektedir.

1. Deney malzemelerinin hazırlanması
<ol><li>Yulaf ezmesini ince bir toz haline gelene kadar karıştırarak yulaf ezmesi agarını (OMA) hazırlayın. 500 mL ddH2O'ya 25 g yulaf ezmesi tozu ve 15 g agar ekleyin ve ortam döngüsünde otoklav ekleyin (alternatif olarak 20 dakika kaynatın). Ortamı steril 60 mm Petri kaplarına dökün. NOT: V8 agar gibi sporülasyona neden olan diğer ortam türleri bu protokol için kabul edilebilir.</li>
	<li>Plaka M. oryzae filtresi, steril forseps kullanarak doğrudan OMA plakalarına stoklar ve tüm plakayı (9-12 gün) kaplamalarına izin verir. Plakaları, sporülasyonu indüklemeye yardımcı olmak için 12:12 saat gündüz: gece döngüleri ile 25 ° C'de bir büyüme inkübatörüne yerleştirin. NOT: Bazı mutantlar daha yavaş büyür ve ek bakım gerektirir (örneğin, önce medyayı tamamlayın, sonra OMA'ya aktarın) ve yeterli konidia üretmek için bir hafta daha sürebilir.</li>
	<li>Arpa (Hordeum vulgare Lacey) tohumlarını doğrudan nemli bir büyüme ortamında (örneğin, topraksız saksı ortamı) 6 inç saksı başına 10-15 tohumla ekin. Saksıları 1-2 inç su içeren tepsilere yerleştirin.</li>
	<li>Arpa büyüme odası koşullarını %60 bağıl nemde 12 saat (gün ışığı) için 22 °C ve 12 saat (karanlık) için 19 °C olarak ayarlayın. Tohumları rahatsız etmemek için alttan sulamaya devam edin.</li>
	<li>Arpaları ikinci yaprak aşamasına kadar, yaklaşık 14 gün boyunca büyütün. Steril makas kullanarak, arpa bitkisini toprak çizgisinin hemen üzerinde kesin. Forseps ve bir tıraş bıçağı / neşter kullanarak, uzunlamasına açık olan ilk yaprağın yaprak kılıfını dikkatlice kesin ve forsepsleri kullanarak ikinci yaprağın tabanından çıkarın. NOT: Kullanmadan önce aletleri (forseps, neşter vb.) %75-%80 etanol ile temizleyiniz. Kılıf, birinciden ikinci yaprağa (ikinciden üçüncü yaprağa vb.) bağlanmayı sağlayan ince epidermis tabakasıdır; bkz. Şekil 1).</li>
	<li>İlk yaprağı düz bir şekilde, plakanın içindeki nemi korumak için ıslak bir kağıt havlu içeren steril bir 60 mm Petri kabına yerleştirin. Neşteri kullanarak, ilk yaprağın çoğunluğunu kılıftan uzaklaştırın ve montaj için yaprak dokusunun sadece 0,5'ini bırakın.</li>
	<li>Yaprak dokusunu Petri plakasının altına bantlayın. NOT: Kılıf kıvrılır, ancak kıvrılmış bir kılıf konidiyal damlacığı daha kolay tuttuğu için bu kabul edilebilir.</li>
	<li>9-12 günlük M. oryzae plakalarını toplayın ve plakalara 0.5-2 mL steril su ekleyin. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, ekli konidiayı serbest bırakmak için miseli yavaşça kazıyın. Konidiyal süspansiyondan büyük miselyum parçalarını filtrelemek için konidiyal süspansiyonu küçük bir tülbent parçası içeren bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice pipetin. NOT: Sporlar, istenen spor konsantrasyonuna ulaşmak için büyüme ve sporülasyon yeterliyse, 7 gün kadar erken bir sürede toplanabilir. Yavaş büyüyen bir genetik mutant ile çalışıyorsa, toplama 14 günden fazla gecikemez</li>
	<li>İstenilen spor konsantrasyonu mL başına 5 x 10 4 spordur, ancak bir aralık (1 x 10 4-1 x 10 5) kabul edilebilir. Bir konsantrasyonun çok yüksek olması, bireysel enfeksiyon bölgelerinin görüntülenmesini zorlaştırır; Gerekirse spor konsantrasyonunu steril suyla seyreltin.</li>
	<li>Haddelenmiş yaprak kılıfının içindeki konidiyal süspansiyonu dikkatlice pipetin. 25 μL ile başlayın (damlacık boyutu, kılıfın boyutuna bağlı olarak 50 μL'ye kadar artırılabilir). NOT: Her mutant suşun veya arpa hattının üç ila beş kopyasının yapılması önerilir. Boyama işlemi sırasında hasarın meydana gelmesi yaygındır, bu nedenle ek kılıf kopyaları önerilir.</li>
	<li>Dört veya beş adet 500 mL beheri ddH2O ile doldurun ve buharlaşana kadar ısıtın (mikrodalga fırın veya ocak plakası kullanarak). Sıcak su kaplarını hareket ettirirken dikkatli olun. Petri kabının kapağını, tabağın içindeki nemi hapsetmek için buharda pişirilen beherlerden birinin üzerinde tutun.</li>
	<li>Enfekte yaprak kılıf plakalarını istifleyin ve kalan sıcak beherlerle çevreleyin. Bu, sporların çimlenmesi için gerekli olan nemli, nemli bir ortam yaratır. NOT: Kapakları buharda pişirirken kılıflara sıcak su veya buhar temas etmemesi için dikkatli olun.</li>
	<li>Yaprak kılıflarını ışıktan koruyun, düz renkli (siyah tercihli) bir kauçuk veya plastik kutu ile örtün ve 48 saat veya görüntüleme için istenen zaman noktasında bekletin. NOT: Bir karton kutu uygun değildir, çünkü nemi / nemi kilitlemez ve sıcak su kaplarından buharı emer. Kilitlenen, plastik bir küvet nemi içermek için iyi çalışır ve ışığı engellemek için siyah kumaş veya daha büyük koyu bir kapla kaplanabilir.</li>
</ol>2. Boyama işlemi
<ol><li>Lekeyi aşağıdaki gibi hazırlayın:% 45 asetik asitten taze bir seyreltme hazırlayın ve% 0.1 v / v tripan mavisi ekleyin. Boya çözeltisinin 1 mL'sini mikrosantrifüj tüplerine aliquot. Bir ısı bloğunu veya su banyosunu 40 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Dikkatlice, bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak, yaprak kılıfını banttan uzaklaştırın. Forseps kullanarak, kılıfı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve boya çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun. Boyanın yaprağa nüfuz etmesi için 2 saat bekleyin. Boyanın penetrasyonunu artırmak için boyama işlemi sırasında numuneleri bir ısı bloğunda veya su banyosunda 40 °C'de ısıtın. NOT: Kılıflar mikro santrifüj tüpünde yüzmeye çalışır; lekesiz yaprak dokusu ceplerini önlemek için tüpleri doldurun, kılıfları batırın ve tüpü kapatın. Aynı mikro santrifüj tüpüne birden fazla kılıf koymayın.</li>
	<li>Ekstra boyayı çıkarmak için yaprak kılıflarını% 60 gliserol içinde dikkatlice durulayın. Üç durulama (her biri taze gliserolde) genellikle yeterlidir. Kılıfı slaytlara monte etmeye hazır olana kadar gliserol içinde tutun.</li>
</ol>3. Montaj ve görüntüleme işlemi
<ol><li>Kılıfı temiz bir cam slayda yerleştirin ve birkaç damla% 60 gliserol ekleyin. Diseksiyon mikroskobu ve iki çift forseps kullanarak, aşılanmış merkezi yukarı bakacak şekilde bırakarak kılıfı dikkatlice açın. Kılıfı forsepslerle açık tutun ve kılıfın kıvrılmasını ve enfeksiyon bölgesini tıkamasını önlemek için kapağı üstüne yerleştirin. NOT: Yaprak kılıfı çok kırılgandır ve kılıfın zarar görmesini önlemek için bu adımların dikkatle yapılması gerekir.</li>
	<li>Uzun süreli depolama için oje veya kısa süreli depolama için bant kullanarak kapak kapağını kapatın. Slaytları bileşik ışık mikroskobu altında gözlemleyin.</li>
	<li>Mikroskop ve cep telefonu kullanarak temel görüntüler çekin. Burada, görüntüler bir cep telefonu adaptörü montajı ve bir akıllı telefon ile çekildi. Android cihazlar için, kamera uygulamasını aşağıdaki ayarlara ayarlayın: flaş kapalı, Top Shot'ı devre dışı bırakın, parlaklık ve gölgelerin otomatik olarak ayarlanmasını devre dışı bırakın ve fotoğraf çözünürlüğünü tam olarak ayarlayın. NOT: Telefondaki kamera uygulamasını kullanmak pil ömrünü normalden daha hızlı azaltır, bu nedenle harici güç kullanılması önerilir.</li>
	<li>Cep telefonu mikroskop üzerine monte edildikten sonra, verileri elde etmek için kullanılacak olan bir ölçek mikrometresinin görüntüsünü alın. Bu çalışmadaki veriler 40x 0.65 NA hava hedefinde elde edildi ve telefon adaptörü 10x oküler üzerine monte edildi. Telefonun yakınlaştırmasını 2,5x'e ayarlayın ve sabit bir piksel boyutunu korumak için tutarlı tutun.</li>
	<li>Kılıfın merkezi, en büyük spor konsantrasyonunu barındırır ve appressoria'yı enfekte eder; Bu nedenle, istatistiksel analiz için önemli sayılar elde etmek için her kılıfın 9-12 görüntüsünü hedefleyin. Spor ve appressoria sayısı, uygulanan sporların konsantrasyonuna bağlı olarak değişir.</li>
</ol>4. ImageJ (FIJI) kullanarak görüntü değerlendirme ve sayma
<ol><li>Görüntüleri ImageJ (FIJI) çalıştıran bir bilgisayara aktarın. Görüntüleri açmak için dosyaları ImageJ çubuğuna sürükleyip bırakın.</li>
	<li>Sahne alanı mikrometre görüntüsünü yükleyerek ve ölçek için iki işaret arasında düz bir çizgi çizerek görüntülerin ölçeğini ayarlayın. Set Ölçeği'ni açın, ölçülen çizgi için Bilinen Mesafe'yi yazın ve ölçeğin birimini yazın. Mikrometrede, bu örnekte, en küçük çizgi 10 μm idi. Global Ayarla kutusunu işaretleyin ve Tamam'a basın. Yüklenen sonraki tüm görüntüler aynı ölçeğe sahip olacaktır.</li>
	<li>Appressoria, sporlar veya diğer nesneleri saymak için Nokta aracını seçin. Ardından, YG Yöneticisi'ni açın. Listeye nokta eklemek için klavyedeki T tuşunu tıklatın. Bu ilgi çekici bölgeler gerekirse kaydedilebilir ve aynı görüntüye yeniden yüklenebilir.</li>
	<li>Deneysel hedeflere bağlı olarak, spor uzunluğu, appressoria boyutu ve germ tüpü uzunluğu gibi ek ölçümler yapın.</li>
</ol>

<ol><li>Roy, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+barley+blast+caused+by+Magnaporthe+oryzae+pathotype+Triticum+%28MoT%29+in+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh.</a> Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Wilson, R. A., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+pressure%3A+investigating+the+biology+of+plant+infection+by+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).</li>
<li>Giraldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+secretion+systems+facilitate+tissue+invasion+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Nature Communications. 4, 1996(2013).</li>
<li>Islam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+wheat+blast+in+Bangladesh+was+caused+by+a+SouthAmerican+lineage+of+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae.</a> BMC Biology. 14 (1), 84(2016).</li>
<li>Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangridge%2C+P+%22The+Barley+Genome.+Compendium+of+Plant+Genomes%22">The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes</a>. , Springer. Cham. 1-10 (2018).</li>
<li>Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+two+strains+of+Magnaporthe+grisea+with+rice%2C+goosegrass%2C+and+weeping+lovegrass%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).</li>
<li>Gowda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+rice-blast+fungus+Magnaporthe+oryzae+field+isolates+from+southern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India.</a> Genomics Data. 5, 284-291 (2015).</li>
<li>Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+reporters+for+functional+analysis+in+rice+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Direct%22%5BJournal%5D)">Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves.</a> Plant Direct. 4 (2), 00188(2020).</li>
<li>Fernandez, J., Wilson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+no+feeding+frenzy%3F+Mechanisms+of+nutrient+acquisition+and+utilization+during+infection+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).</li>
<li>Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Delaware%22">University of Delaware</a>. , Doctoral dissertation (2022).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((al.The+plant+infection+test%3A+Spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).</li>
<li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li>
<li>Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+surface+attachment+in+spores+of+a+plant+pathogenic+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus.</a> Science. 239 (4837), 288-290 (1988).</li>
<li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Sprey veya damlacık aşılamaları gibi uyumlu veya uyumsuz bir enfeksiyon yanıtının makroskopik düzeyde bir görselini sağlayan M. oryzae suşlarını test etmek için yaygın olarak kullanılan birçok tahlil ve lezyon boyutlarını ölçmek için derecelendirme sistemlerinin kullanımı13,14 vardır. M. oryzae için bir başka yaygın tahlil, patojenin özel penetrasyon yapısını, apppressorium15'i oluşturma yeteneğini test etmektir. Burada t...

Magnaporthe oryzae, pirinç patlama mantarı, arpa, buğday ve pirinç1 dahil olmak üzere çeşitli tahıl bitkilerini enfekte eder. Bu patojen yıkıcı hastalıklara neden olur ve bu değerli ürünler için dünya çapında bir tehdit oluşturur ve kontrol edilmezse tam ürün kaybına neden olur. Dünyadaki birçok laboratuvar, küresel tehdidi ve bitki-mantar etkileşimleri için mükemmel bir model olarak özellikleri nedeniyle pirinç patlama hastalığına odaklanmaktadır2. Tamamen sıralanmıştır ve enfektif döngüsünün genetiği, özellikle de erken olaylar, 3,4 olarak belirlenmiştir. Yaşam döngüsü, bir yaprak yüzeyinde çimlenen bir sporla başlar ve appressorium adı verilen özel penetrasyon yapısını oluşturur. Appressorium yaprak dokusuna nüfuz eder ve enfeksiyon, sporülasyon sürecini başlatan ve hastalık4'ü yayan lezyonların gelişimi ile devam eder. Bu erken olaylardan herhangi birini önlemek, bu yıkıcı hastalığı büyük ölçüde engelleyecektir. Sonuç olarak, patlama hastalığı ile ilgili en güncel araştırmalar, bir appressoryum oluşturan çimlenmiş konidiadan invaziv hiflerin ve biyotrofik ara yüzey kompleksinin (BIC) gelişimine kadar erken enfeksiyon adımlarına odaklanmıştır5.
M. oryzae çeşitli mahsuller için önemli bir patojen olmasına rağmen, patlama hastalığı üzerine çok sayıda araştırma pirinçte yapılmıştır ve yeni evrimleşmiş suşlar buğday6 için küresel bir tehdit olarak ortaya çıkmaktadır. Pirinç, buğday ve mısırla birlikte nüfusu beslemek için kullanılan ilk üç temel üründen biri iken, arpa hayvan yemi ve bira üretimi açısından dördüncü tahıl tanesidir7. Zanaat birası endüstrisi büyüdükçe, arpanın ekonomik değeri de artar. M. oryzae ve arpanın patlama hastalığını incelemek için bir patosistem olarak kullanılmasının belirgin avantajları vardır. İlk olarak, sadece arpayı enfekte eden M. oryzae suşlarının yanı sıra birden fazla çim türünü enfekte edebilen suşlar da vardır. Örneğin, 4091-5-8 öncelikle sadece arpayı enfekte ederken, Guy11 ve 70-15 hem arpa hem de pirinç8'i enfekte edebilir. Bu suşlar genetik olarak benzerdir ve enfeksiyon süreci karşılaştırılabilir9. İkincisi, standart laboratuvar ve sera koşullarında, pirincin karmaşık gereksinimlerine (özlü sıcaklık kontrolü, yüksek nem, spesifik ışık spektrumları) sahip olmadığı için arpanın yetiştirilmesi daha kolaydır. Arpanın10 göstermediği yaprak yüzeyinin hidrofobikliği nedeniyle pirinçle ilgili görüntüleme zorlukları da vardır.
Bu protokol, çoklu enfeksiyon aşamalarının mikroskobik analizi için arpa yaprağı kılıflarını izole etmek ve etkili bir şekilde kullanmak, ortak laboratuvar malzemeleri ve veri toplamak için bir akıllı telefon kullanmak için basit bir yöntem sunar. Arpa yaprağı kılıf testi için bu yöntem, minimum malzeme gerektirdiği için dünyadaki laboratuvarlar için uyarlanabilir ve yine de patojen ile enfekte ettiği ilk birkaç hücre arasındaki mikroskobik etkileşimin net bir resmini sağlar. Sprey veya damlacık aşılaması gibi patojenite testleri, patojenin lezyon oluşturma yeteneğinin makro bir görünümünü sağlayabilirken, bu tahlil araştırmacının penetrasyon öncesi olaylardan epidermal hücrelerin kolonizasyonuna kadar erken enfeksiyonun belirli adımlarını görselleştirmesine olanak tanır. Ayrıca, araştırmacılar vahşi tip mantar ile enfeksiyonu, virülansta azaltılmış bir mutant ile enfeksiyonla kolayca karşılaştırabilirler.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Cep telefonu&nbsp;</td><td>Google&nbsp;</td><td>Pixel 4A</td><td>Tutucuya monte edilebilen, arkaya bakan kamerası olan herhangi bir akıllı telefon yeterli olacaktır.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cep telefonu Mikroskop adaptörü</td><td>Vankey</td><td>B01788LT3S</td><td>https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63& sr=8-2 -spons& psc = 1 & spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DD QxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>AmScope</td><td>FM690TC</td><td>40x&ndash; 2500x Trinoküler dik epi-floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Yulaf ezmesi eski moda yulaf ezmesi</td><td>Quaker</td><td>N/A</td><td>https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& hvptwo=& HVQ MT=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& hvtargid =PLA-568492637928& psc = 1</td></tr><tr><td>ProMix BX</td><td>ProMix</td><td>1038500RG</td><td></td></tr><tr><td>Dikdörtgen kapak camı</td><td>Corning</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar, mikroskop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Sahne mikrometresi&nbsp;</td><td>OMAX</td><td>A36CALM7</td><td>0,1 mm ve 0,01 mm Mikroskop kalibrasyon sürgüsü</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

pirinç patlaması hastalığının (magnaporthe oryzae) erken enfeksiyon bölgelerinin arpa (hordeum vulgare) Üzerinde temel bir mikroskop ve akıllı telefon kullanarak görselleştirilmesi

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone

Bitkilerin ve patojenlerin nasıl etkileşime girdiğini ve bu etkileşimin savunma veya hastalıkla sonuçlanıp sonuçlanmadığını anlamak, bitki sağlığı için daha güçlü ve daha sürdürülebilir stratejiler geliştirmek için gereklidir. Enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında bitki-patojen örneklerini daha etkili bir şekilde görüntüleyen yöntemlerdeki ilerlemeler, pirinç ve mantar patojeni Magnaporthe oryzae arasındaki enfeksiyon ve erken kolonizasyon olaylarının izlenmesinde yararlı olan pirinç yaprağı kılıfı testi gibi araçlar sağlamıştır. Bu hemi-biyotrofik patojen, pirinç ve darı, çavdar, arpa ve daha yakın zamanda buğday dahil olmak üzere ilgili monokotlarda ciddi hastalık kaybına neden olur. Yaprak kılıfı testi, doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde, araştırmacıların patojen saldırısı sırasında canlı hücre görüntülemesi yapmalarına veya belirli özellikler için boyanmış sabit örnekler oluşturmalarına olanak tanıyan birkaç kat kalınlığında, optik olarak net bir bitki bölümü verir. Arpa-M. oryzae etkileşimine ilişkin ayrıntılı hücresel araştırmalar, bu tahılın hayvanlar ve insanlar için bir besin kaynağı ve fermente içecekler olarak artan önemine rağmen, pirinç konağının gerisinde kalmıştır. Burada, aşılama sonrası ilk 48 saat boyunca M. oryzae etkileşimlerinin karmaşık çalışmaları için bir arpa yaprağı kılıfı testinin geliştirilmesi bildirilmiştir. Yaprak kılıfı testi, hangi türün çalışıldığına bakılmaksızın, hassastır; Arpa yetiştirme koşullarından yaprak kılıfı elde edilmesine, bitki yaprakları üzerindeki patojenin aşılanmasına, inkübasyonuna ve görüntülenmesine kadar her şeyi kapsayan bir protokoldür. Bu protokol, görüntüleme amacıyla akıllı telefon kadar basit bir şey kullanılarak yüksek verimli tarama için optimize edilebilir.

Bu teknik için ilk iş akışının bir tasviri Şekil 1'de gösterilmiştir. Kılıflar 14 günlük duyarlı "Lacey" arpa bitkilerinden (H. vulgare) toplandı. Konidia, 10 günlük sporlaştırıcı M. oryzae OMA plakalarından, mL başına 5 x 104 sporun nihai konsantrasyonu için steril ddH2O kullanılarak hazırlanan konidiyal bir süspansiyonla toplandı. İnokulum süspansiyonu, steril Petri plakalarına sabitlenen yaprak kılıflarına doğrudan uygulandı. Plakalar ışıksız 48 saa...

Bu, minimum reaktifler ve ortak laboratuvar ekipmanı (temel bir akıllı telefon dahil) kullanan bir arpa yaprağı kılıfı testinin basit bir protokolüdür. Amaç, gelişmiş mikroskopi ekipmanlarına erişimi olmayan laboratuvarlarda patlama hastalığının erken enfeksiyon sürecini görselleştirmektir.

Pirinç Patlaması Hastalığının (Magnaporthe oryzae) Erken Enfeksiyon Bölgelerinin Arpa (Hordeum vulgare) Üzerinde Temel Bir Mikroskop ve Akıllı Telefon Kullanarak Görselleştirilmesi

Understanding how plants and pathogens interact, and whether that interaction culminates in defense or disease, is required to develop stronger and more ...

Protokolümüz, araştırmacıların pahalı ekipman kullanmadan vahşi tip ve genetik mantar mutantlarının erken enfeksiyon adımlarını görselleştirmelerini sağlayan basitleştirilmiş bir yöntemdir. Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık biyolojik soruları cevaplamak ve mantar mutantlarının daha fazla analiz için hızlı bir şekilde taranması için temel laboratuvar malzemelerinin kullanılmasıdır. Bu tekniğin zor bir kısmı kılıfın tedavisidir.Kılıf, kolayca zarar görebilecek ince bir hücre tabakasıdır, bu nedenle başarılı bir deney için dikkatli kullanım şarttır. Başlamak için, ikinci yaprak aşamasına kadar yetiştirilen arpaları seçin. Steril makas kullanarak, arpa bitkisini toprak çizgisinin hemen üzerinde kesin.Forseps ve neşter kullanarak, uzunlamasına açık olan ilk yaprağın kılıfını dikkatlice kesin. Forsepsleri kullanarak, ikinci yaprağın tabanından çıkarın. Bir neşter kullanarak, ilk yaprağın çoğunu kılıftan uzaklaştırın ve montaj için yaprak dokusunun sadece 0,5 inçini bırakın.İlk yaprağı, plakanın içindeki nemi korumak için ıslak bir kağıt havlu içeren steril bir 60 milimetre Petri kabına yerleştirin. Yaprak dokusunu Petri kabının dibine bantlayın. Dokuz ila 12 günlük bir Magnaporthe oryzae kültür plakası seçin ve üzerine 0,5 ila iki mililitre steril su ekleyin.Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, ekli konidiayı serbest bırakmak için miseli yavaşça kazıyın. Konidiyal süspansiyondan büyük miselyum parçalarını filtrelemek için konidiyal süspansiyonu küçük bir parça peynir bezi içeren bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice pipetin. Gerekirse, spor konsantrasyonunu steril suyla mililitre başına beş kez 10 ila dördüncü sporlara kadar seyreltin, çünkü konsantrasyonun çok yüksek olması bireysel enfeksiyon bölgelerinin görüntülenmesini zorlaştırır.Kılıf boyutuna bağlı olarak, haddelenmiş yaprak kılıfının içindeki konidiyal süspansiyonun 25 ila 50 mikrolitresini dikkatlice pipetin. Daha sonra, dört veya beş adet 500 mililitrelik beheri çift damıtılmış suyla doldurun ve buharlaşana kadar ısıtın. Petri kabının kapağını, tabağın içindeki nemi hapsetmek için buharda pişirilen beherlerden birinin üzerinde tutun.Enfekte yaprak kılıf plakalarını istifleyin ve sporların çimlenmesi için nemli, nemli bir ortam yarattığı için kalan sıcak beherlerle çevreleyin. Bu kurulumu düz renkli bir kauçuk veya plastik kutu ile kaplayarak ve 48 saat boyunca veya görüntüleme için istenen zaman noktasında rahatsız edilmeden bırakarak ışıktan koruyun. Taze seyreltilmiş %45 asetik asit ve %0,1 tripan mavisini karıştırarak lekeyi hazırlayın.Boya çözeltisinin bir mililitresini mikrosantrifüj tüplerine aliquot. Bir neşter kullanarak, yaprak kılıfını banttan dikkatlice kesin. Forseps kullanarak, kılıfı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve boya çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun.Boyanın yaprağa nüfuz etmesi için tüplerin 40 santigrat derecelik bir ısı bloğunda veya su banyosunda iki saat beklemesine izin verin. Daha sonra, ekstra boyayı çıkarmak için yaprak kılıflarını% 60 taze gliserol içinde üç kez dikkatlice durulayın. Kılıfı slaytlara monte etmeye hazır olana kadar gliserol içinde tutun.Kılıfı temiz bir cam slayda yerleştirin ve birkaç damla% 60 gliserol ekleyin. Diseksiyon mikroskobu ve iki çift forseps kullanarak, aşılanmış merkezi yukarı bakacak şekilde bırakarak kılıfı dikkatlice açın. Kılıfı forseps ile açık tutarak, kılıfın kıvrılmasını ve enfeksiyon bölgesini tıkamasını önlemek için kapak kaymasını üstüne yerleştirin.Uzun süreli depolama veya bant kısa süreli depolama için oje kullanarak kapak fişini kapatın. Slaytları bileşik ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Mikroskopa bir cep telefonu adaptörü takarak akıllı telefonla temel görüntüleri çekin.Android cihazlar için, kamera uygulaması ayarlarını yanıp sönecek şekilde ayarlayın, üst çekimi devre dışı bırakın, parlaklık ve gölgelerin otomatik olarak ayarlanmasını devre dışı bırakın ve fotoğraf çözünürlüğünü tam olarak ayarlayın. Cep telefonunu monte ettikten sonra, verileri elde etmek için istenen bir hedefe sahip bir ölçek mikrometresinin görüntüsünü alın. Telefonun yakınlaştırmasını 2,5 x'e ayarlayın ve tutarlı bir piksel boyutunu korumak için tutarlı tutun.Kılıfın merkezi, en büyük spor konsantrasyonuna ev sahipliği yapar ve appressoria'yı enfekte eder. Bu nedenle, istatistiksel analiz için önemli sayılar elde etmek için her kılıfın dokuz ila 12 görüntüsünü hedefleyin. Kılıfın enfeksiyon bölgeleri, tripan mavisi ile boyandıktan sonra bir akıllı telefon ve akıllı telefon mikroskop adaptörü kullanılarak görüntülendi.Boyama işlemindeki ısı ve asetik asit, yaprak dokusunu nazikçe yumuşatır. % 60 gliserol içindeki boyama sonrası durulamalar sadece fazla lekeyi çıkarmakla kalmaz, aynı zamanda yaprağın neden olduğu ışık saçılımını azaltmaya ve görüntü kalitesini iyileştirmeye yardımcı olur. Boyama protokolünden sapmalar, burada gösterildiği gibi optimal olmayan sonuçlara neden olabilir.4091 vahşi tip ile enfekte olmuş arpa, yaprak kılıf dokusu içinde enfekte olmuş hiflerin varlığı ile tanımlanan başarılı bir şekilde enfekte olmuş hücreler üretti. Mutant J99A enfeksiyonu durumunda, appressoria ve penetrasyon mandallarının başarılı gelişimi fark edildi, ancak invaziv hifler üretmedi. Enfeksiyona dayalı analizler için zamanlama önemlidir.Uygun şekilde yaşlandırılmış bitkiler ve mantar sporları başarı için gereklidir. Bu çalışmada enfeksiyon yapılarının varlığına veya yokluğuna baktık. Ek deneyler, enfeksiyon yapısının fenotipi ve istilacı hiflerin fenotipi ile ilgili soruları cevaplayabilir.Metodolojimiz yeni değil, daha karmaşık, pahalı bir deneyin basitleştirilmiş, erişilebilir bir versiyonudur.

visualizing-early-infection-sites-rice-blast-disease-magnaporthe

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kaynak: Wen, J., Pasman, vd. al., Bacillus subtilis Sporlarında Mikropların ve İç Zarın Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, bakteri sporu içindeki çimlenme proteinlerinin organizasyonunu ortaya çıkaran üç boyutlu floresan görüntüleri elde etmek için yapılandırılmış aydınlatma mikroskobunun kullanımını göstermektedir.

Bakteri Sporlarının İç Zarındaki Çimlenme Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Bu video, pirinç bitkisi yapraklarında patojenik mantar Magnaporthe grisea enfeksiyonunu oluşturmak için bir teknik göstermektedir. Fungal conidia süspansiyonu pirinç yaprağının bölümlerine püskürtülür ve nekrotik lezyonların oluşumu puanlanarak hastalığın ilerlemesi değerlendirilir.

Pirinç Bitkisi Yapraklarında Mantar Enfeksiyonu Oluşturmak için Bir Sprey Aşılama Tekniği

Bu video, Magnaporthe grisea miselyumu ile yaralama aşılaması yoluyla pirinç bitkisi yaprağı enfeksiyonunun oluşumunu göstermektedir. Mantar sporundan türetilen germ tüpü epidermal tabakaya nüfuz ederek doku enfeksiyonuna ve yapraklarda lezyonlara neden olur. Bu yöntem, patotip taramasına yardımcı olur ve moleküler ıslah için bitki direncinin anlaşılmasını geliştirir.

Yaralama Yoluyla Mantar Aşılaması Yoluyla Pirinç Bitkisi Yaprak Enfeksiyonunun Kurulması

Burada, bitki virülans bitki patojeni ile test etmek için bir iletişim kuralı mevcut Magnaporthe grisea. Bu rapor mantarlar yalıtır pathotypes büyük ölçekli tarama için katkıda bulunmak ve moleküler ıslahı sırasında bitkilerin dirençli mekanizmaları anlamak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet.

Bitki enfeksiyon Test: Sprey ve bitki patojeni Magnaporthe Grisea ile aşı yara-aracılı

Bu protokol, taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak endosperm ve nişaste granül morfolojisinin analizi için tahıl tohumlarının enine bölümlerinin (örneğin pirinç) hazırlanmasına izin verir.

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Bu çalışma, CRISPR-Cas9 genom düzenleme teknolojisinin nakavt endojen gen OsABCG15'e ve ardından pirinçte istikrarlı bir erkek steril çizgi üretmek için modifiye edilmiş Agrobacteriumaracılı dönüşüm protokolüne kullanımını açıklamaktadır.

Agrobacterium-Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışmaları Için Uygulaması

Mevcut protokol, dokuların sert, kalın veya katmanlı doğası nedeniyle iç yapısal gözlemlere hazırlanması zor olan pirinç sürgünleri için bir temizleme tekniğini tanımlamaktadır. Bu yöntem, yetişkin pirinç bitkilerinde bile sürekli ve derin floresan gözlemlerini kolaylaştırır.

Clearing Teknolojisi ile Pirinç Sürgünlerinde Derin Floresan Gözlemi

Mevcut protokol, Plasmodiophora brassicae tarafından indüklenen safra kesesi histolojik gözlemi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlamaktadır. Hipokotillerin vibratom kesitleri, hastalığın ilerlemesi sırasında transkripsiyon faktörlerinin ve fitohormonların tutulumunu incelemek için floresan görüntülemeden önce temizlenir. Bu protokol, reçine gömme sınırlamalarının üstesinden gelerek floresan proteinlerinin planta görselleştirmesini sağlar.

Gen İfadesindeki Değişiklikleri ve Plasmodiophora brassicae'ye Fizyolojik Yanıtları Görselleştirmek için Temizleme ve Floresan Mikroskopisinin Birleştirilmesi

Burada, patojenle ilişkili moleküler paternle tetiklenen immün yanıtta pirinç dokularında apoplastik reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin gerçek zamanlı tespiti için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem basit, standartlaştırılmış ve kontrollü koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar üretir.

Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

Bu makale, pirinçte ile geliştirilmiş tuz stresi toleransını araştırmak için arbusküler mikorizal () mantar aşısı oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.

Arbusküler Mikorizal () Fungal İnokulum Üretimi ve Tuzlu Koşullarda Pirinç ve Simbiyozunun Fenotipik Değerlendirilmesi

Keşfedin, arpa yaprak kılıfı yöntemiyle Magnaporthe oryzae'nin erken enfeksiyon aşamalarını temel mikroskop ve akıllı telefon kullanarak görselleştirme tekniğini. Bu basit yöntem, maliyetli ekipman olmadan fungal mutantların hızlı taramasını sağlar.

Pirinç Patlaması Hastalığının (Magnaporthe oryzae) Erken Enfeksiyon Bölgelerinin Arpa (Hordeum vulgare) Üzerinde Temel Bir Mikroskop ve Akıllı Telefon Kullanarak Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal

Pirinç Patlaması Hastalığının (Magnaporthe oryzae) Erken Enfeksiyon Bölgelerinin Arpa (Hordeum vulgare) Üzerinde Temel Bir Mikroskop ve Akıllı Telefon Kullanarak Görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet