Name: Esrar sativasından Glandüler Kapitat Saplı ve Sapsız Trikomların Susuz İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Öğrenin Cannabis sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların susuz izolasyonunu. Bu yüksek verimli yöntem, RNA ekstraksiyonu ve transkriptomik analiz için yüksek saflıkta trikom sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar CannabiVar Ltd.'den finansal destek aldıklarını kabul etmektedir. Tüm bitki materyali, İsrail'deki Volcani Merkezi'nden Profesör Hinanit Koltai tarafından cömertçe sağlandı.

NOT: Bu çalışmada kullanılan bitki materyali, başka bir yerde açıklandığı gibi İsrail'in Volcani Merkezi'nde yetiştirilen dört C. sativa ARO-Volcani suşundan (CS-11, CS-12, CS-13 ve CS-14) oluşmaktadır. Glandüler kapitat saplı trikomlar olgun çiçeklenme salkımından izole edildi ve glandüler kapitat sapsız trikomlar, olgun çiçekli olmayan ana bitkilerden büyük fan yapraklarından izole edildi. Tüm bitki materyali taze olarak toplandı ve hemen -80 ° C'de saklandı.
DİKKAT: Protokol boyunca kuru buz ve LN kullanılır. Bu maddeler son derece tehlikelidir. İzole trikomlar, kapalı tüplere yerleştirildiğinde tehlikeli gaz basıncı oluşturabilecek kuru buz parçacıkları içerebilir; Bu nedenle, tüm kapaklar iğneyle delinmelidir. Son derece düşük sıcaklıklarda kullanım için koruyucu gözlüklerin, uygun laboratuvar kıyafetlerinin ve eldivenlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
1. Trikomların bitki materyalinden ilk ayrılması için kurulum
<ol><li>Kuru bir buz bloğunu 5 L'lik plastik bir kapta bir çekiç ve sert düz bir nesne kullanarak küçük ince pullar halinde ezin.</li>
	<li>İnce kuru buz pullarını (5 mm'den küçük) eleyerek eleyin Kırılmamış kuru buzdan büyük bir süzgeçle (5 mm'den küçük gözenekler aracılığıyla ) başka bir 5 L plastik kaba koyun. Kuru buz pullarının yaklaşık 200cm3'ünü (200 mL işareti) dik 1 L'lik cam bir beher içine dökün.</li>
	<li>Ezilmiş kuru buzun ilk tabakasına 10 g'a kadar dondurulmuş C. sativa salkımını (bundan böyle bitki materyali olarak adlandırılır) ekleyin ve 200cm3'lük ince ezilmiş kuru buz tabakası ile örtün.</li>
	<li>1 L cam kabın açıklığını iki ila üç kat 1 mm ekran kapısı cibinliği ile örtün ve cam kabın dış taraflarına lastik bantlarla sabitleyin (Şekil 1).</li>
	<li>LN'yi, izole trikomların toplanacağı büyük bir yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kaba dökün (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Un elek ağını aşağıdan örtmek için un eleği/elek süzgecine 350 μm'lik bir ağ yerleştirin (Şekil 2). Çıkarılabilir plastik halkalı bir un eleği varsa, 350 μm ağı, un eleğinin ağının altına sabitlenecek şekilde yerleştirin. Değilse, 350 μm ağı un eleğinin çevresine lastik bantlarla sabitleyin.</li>
	<li>Un eleğini LN ile doldurulmuş büyük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın üzerine yerleştirin (Şekil 3). Yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın dışındaki elenmiş kütlenin kaybını en aza indirmek için kabın genişliğinin un eleğininkini aştığından emin olun.</li>
</ol>2. Trikomların bitki materyalinden ayrılması
<ol><li>1 L bardağı, açıklığı un eleğine doğru aşağı bakacak şekilde, büyük bir tuz çalkalayıcı kullanıyormuş gibi çalkalayın (Şekil 4).</li>
	<li>Un eleği üzerinde biriken ezilmiş kuru buzun ve bitki materyalinin elenmesini sağlamak için her 2-3 dakikada bir 1 L cam kabı bir kenara koyun.</li>
	<li>Aşağıdaki yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kapta bitki malzemesinin LN'ye geçişini kolaylaştırmak için un eleğini yatay olarak eleyin.</li>
	<li>Paslanmaz çelik kaba LN ekleyin ve seviyeleri düştüğünde 1 L cam beher için ezilmiş kuru buz ekleyin. Un eleği üzerindeki bitki materyali tükendiğinde, cam beherdeki kullanılmış bitki materyalini ilave 10 g taze bitki materyali ile doldurun. İkmal genellikle iki defadan fazla tekrarlanmak zorunda değildir.</li>
	<li>Yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kapta yeterli miktarda zenginleştirilmiş trikom toplanana kadar 2.1-2.4 arasındaki adımları tekrarlayın. Genel olarak, RNA ekstraksiyonu ve transkriptom analizi için 20 g taze bitki materyali yeterlidir.</li>
	<li>LN'ye batırılmış paslanmaz çelik kabın dibinde beyaz toz benzeri bir madde (bitki artıkları, glandüler trikomlar ve ezilmiş kuru buzdan oluşan) olduğunu doğrulayın. Mikroskobik bir gözlem, yeterli miktarda trikomun toplanıp toplanmadığını belirlemeye yardımcı olacaktır; Ancak, bu adım protokolün akışını engelleyebilir. Genellikle, çoğu izolasyon için 10-20 g ilk bitki materyali yeterlidir; Bununla birlikte, bitkilerin trikom yoğunluğunda farklılıklar olabilir. NOT: Bu noktadan itibaren, deneme duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. Kısa bir süre duraklatılırsa, trikomların suya batırılmış kalması için yeterli miktarda LN eklenmelidir. Alternatif olarak, trikomlar, adım 5'te açıklandığı gibi, daha sonra kullanılmak üzere 3 aya kadar -80 ° C'de toplanabilir ve saklanabilir.</li>
</ol>3. Glandüler capitate trikomların (saplı ve sapsız) soğanlı ve sistolikik trikomlar ve döküntüler gibi diğer trikom tiplerinden ayrılması
<ol><li>Temiz küçük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik bir kaba az miktarda LN ekleyin.</li>
	<li>20 cm x 20 cm'lik bir katlama elde etmek için 150 μm ağ boyutunda 40 cm x 40 cm mikro eleği iki kez katlayın ve açın. Koni benzeri bir şekle benzediğinden emin olun (Şekil 5).</li>
	<li>Ağ konisini yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın kenarına bir veya iki mandalla sabitleyin, böylece koninin açılan kısmı dik olur ve sivri kısmı kısmen LN'ye batırılır.</li>
	<li>LN'yi ve adım 2.6'daki beyaz toz benzeri maddeyi yavaşça mikro elek konisine dökün.</li>
	<li>Kalan bitki materyallerini toplamak ve ilk kaptan 150 μm ağ konisine aktarmak için yavaşça geniş bir fırça uygulayın.</li>
	<li>İlk kaba daha fazla LN ekleyin ve tüm bitki materyali mikro elek konisine aktarılana kadar fırçalama hareketini tekrarlayın.</li>
	<li>Mandalı kabın kapağından dikkatlice ayırın ve mikro elek konisini açın, böylece trikomlar açılan mikro eleğin ortasına yerleştirilecektir. Mikro eleğin dört köşesini de bir arada tutun, böylece trikomları içeren orta kısım LN'ye batırılmış halde kalır (Şekil 6).</li>
	<li>Mikro eleğin dört köşesini de tutarken, mikro eleği LN'ye bir çay poşeti demliyormuş gibi çelik kaba hafifçe daldırın ve sallayın. Bu daldırma/sallama (dikey ve yatay) hareketine 1 dakika devam edin. İzolasyon kalitesi ve miktarı arasında bir denge vardır. Daha uzun daldırma hareketleri daha fazla miktarda trikom ile sonuçlanabilir, ancak izolasyon dereceleri daha zayıf olabilir. Genel olarak, 1 dakika hem kalite hem de miktar için yeterli olarak önerilir. NOT: Bu eleme hareketi protokolün en kritik kısmıdır ve buna göre yürütülmelidir.</li>
	<li>İsteğe bağlı: Mikro eleğin ortasına sarılmış elenmemiş bitki artıklarını ve daha büyük trikomları (hala LN'ye batırılmış) 13 mL veya 50 mL'lik bir test tüpüne alın ve ileride kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın. DİKKAT: Basınçlı gazın birikmesini önlemek için (kuru buz ve LN kalıntılarından), test tüpünün kapağındaki bir deliği sterilize edilmiş bir iğne ile delin. Kapak, basınç düştüğünde, genellikle 24 saat sonra değiştirilebilir.</li>
</ol>4. Trikomların gözenek boyutu küçülen mikro eleklerden geçirilmesi
<ol><li>Küçük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın altındaki LN'ye batırılmış elenmiş trikomları, 3. adımda sunulduğu gibi, gözenek boyutları azalan (105 μm, 80 μm, 65 μm ve 50 μm) mikro eleklerden sırayla aktarın.</li>
</ol>5. İstenilen trikomların toplanması
<ol><li>LN'ye batırılmış ve önceden soğutulmuş (LN'de) bir kaşık kullanarak 50 μm mikro eleğe sarılmış istenen trikomları çıkarın. Onları temiz bir tabağa yerleştirin. NOT: Bu son izolasyon aşamasında, istenilen trikomlar elekten toplanır.</li>
	<li>Toz benzeri trikomları, önceden soğutulmuş bir spatula veya tüpe yerleştirilen bir scoopula aracılığıyla etiketli önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın (Şekil 7). Daha ileri çalışmalar için tüpleri hemen -80 ° C'de saklayın. NOT: Tüm yalıtım protokolünü gösteren şematik bir iş akışı şeması Şekil 8'de verilmiştir.</li>
</ol>6. Saflaştırılmış trikomların gözlem ve analizi
<ol><li>Önceden soğutulmuş (LN yoluyla ) bir spatula kullanarak mikroskop slaydına az miktarda (10 mg) izole trikom yerleştirin. Bir damla su ekleyin ve lekelenmeden doğrudan hafif bir mikroskopta gözlemleyin. Genel izolasyon ve kontaminasyon derecesini düşük (10x) ve yüksek (40x) büyütmeler kullanarak değerlendirin. Zenginleştirme, Şekil 9'da gösterildiği gibi, trikom dışı dokuya göre trikomların göreceli miktarı ile görsel olarak tahmin edilir.</li>
	<li>50 mg izole C. sativa glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomlardan RNA ekstraksiyonu ve kalite analizi yapın. NOT: RNA ekstraksiyonu için poli-A tabanlı bir mRNA saflaştırma stratejisi kullanan ticari bir ekstraksiyon kiti (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.<ol><li>Lizis çözeltisinde 50 mg izole trikomu yeniden askıya alın, 30 s boyunca vorteks, 5 dakika boyunca 35 kHz'de buz gibi soğuk bir ultrasonik temizleme ünitesinde sonikleştirin ve mRNA'yı üreticinin protokolüne göre numunelerden çıkarın (bkz.</li>
		<li>Trikomlardan ekstrakte edilen RNA'nın bütünlüğünü tahmin etmek için, RNA konsantrasyonunu, toplam miktarı ve RNA bütünlük sayısı (RIN) değerlerini bir çip üzerinde laboratuvar sistemi kullanarak belirleyin (bkz.</li>
		<li>Trikom fraksiyonlarının RNAseq analizini yapın (isteğe bağlı). RNAseq analizi ve sıralı okumaların biyoinformatik analizleri standart dış kaynak kullanımı hizmetleri ile gerçekleştirilebilir</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+plant+trichome+biochemistry+for+the+production+of+useful+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal+for+Cell+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds.</a> Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).</li>
<li>Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-volatile+natural+products+in+plant+glandular+trichomes%3A+chemistry%2C+biological+activities+and+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis.</a> Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).</li>
<li>Fairbairn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trichomes+and+glands+of+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22UN+Bulletin+on+Narcotics%22%5BJournal%5D)">The trichomes and glands of Cannabis sativa L.</a> UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).</li>
<li>Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terpene+synthases+from+Cannabis+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Terpene synthases from Cannabis sativa.</a> PLoS One. 12 (3), 0173911(2017).</li>
<li>Yerger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolating+glandular+trichomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolating glandular trichomes.</a> Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).</li>
<li>Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+histochemical+localization+of+monoterpene+biosynthesis+in+the+glandular+trichomes+of+spearmint+%28Mentha+spicata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata).</a> Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).</li>
<li>Gershenzon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+secretory+cells+from+plant+glandular+trichomes+and+their+use+in+biosynthetic+studies+of+monoterpenes+and+other+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products.</a> Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).</li>
<li>Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Cannabis+sativa+glandular+trichome+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome.</a> PLoS One. 16 (4), 0242633(2021).</li>
<li>Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+novel+transcription+factors+involved+in+cannabinoid+biosynthesis+in+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L.</a> Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).</li>
<li>Slone, J. H., Kelsey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+glandular+secretory+cells+from+Artemisia+tridentata+%28ssp.+vaseyana%29+by+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation.</a> American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).</li>
<li>Namdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terpenoids+and+Phytocannabinoids+Co-Produced+in+Cannabis+Sativa+Strains+Show+Specific+Interaction+for+Cell+Cytotoxic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity.</a> Molecules. 24 (17), 3031(2019).</li>
<li>McDowell, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+functional+genomic+analysis+of+Solanum+glandular+trichome+types%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types.</a> Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).</li>
<li>Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+as+a+signal+to+sort+developing+glandular+trichomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 949(2016).</li>
<li>Livingston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabis+glandular+trichomes+alter+morphology+and+metabolite+content+during+flower+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation.</a> The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).</li>
<li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gland+distribution+and+cannabinoid+content+in+clones+of+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L.</a> American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).</li>
<li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+cannabinoids+in+individual+glandular+trichomes+of+Cannabis+sativa+L.+%28Cannabaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae).</a> American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).</li>
<li>Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+glandular+hairs+of+Cannabis+sativa+from+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy.</a> American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).</li>
<li>Marks, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+isolating+large+quantities+of+Arabidopsis+trichomes+for+transcriptome%2C+cell+wall%2C+and+other+types+of+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses.</a> The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).</li>
<li>Huebbers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+method+for+the+release%2C+enrichment+and+purification+of+high-quality+Arabidopsis+thaliana+rosette+leaf+trichomes+enables+profound+insights+into+the+trichome+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome.</a> Plant Methods. 18 (1), 12(2022).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Mevcut trikom izolasyon protokolleriyle karşılaştırıldığında, mevcut protokolde iki ana değişiklik açıklanmaktadır. Bunlar, trikomların ilk adımda kuru buz kullanılarak bitki malzemesinden ayrılmasını ve yaygın olarak kullanılan sıvı tampon ortamının yerine LN'nin kullanılmasını içerir. C. sativa trikom saflaştırması için ilk modifikasyon, trikomları sardunya pedicellerinden ayırmak için ezilmiş kuru buz kullanımını tanıtan daha önceki bir protokole dayanmaktadır5. Geleneksel trikom izola...

Glandüler trikomlar, birçok ikincil metabolit1 içeren bitkilerde bulunan ve yeni biyosentetik genlerin ve enzimlerin değerli bir bankasını temsil eden saç benzeri yapılardır2. Esrarda, önemli ikincil metabolitlerin, kanabinoidler3 ve terpenler4'ün biyosentezi, trikomlarda lokalizedir. Trikomların hem tıbbi hem de rekreasyonel kullanımlar için Esrar kalitesini belirlemedeki rolü göz önüne alındığında, trikom gen ekspresyonunun incelenmesi ilgi çekicidir. Trikoma özgü genlerin ekspresyonunu karakterize etmek için, önce ilgilenilen trikomlar izole edilmelidir. Trichome izolasyon protokolleri ilk olarak 1992 gibi erken bir tarihte tanımlanmıştır5 ve en son gelişmeleri yakın zamanda gözden geçirilmiştir2. Genel olarak, transkriptomik karakterizasyon için glandüler trikomların ekstraksiyonu için protokoller iki ayrı sıralı adıma ayrılabilir. İlk adım, trikomların bitki dokusundan tamamen fiziksel olarak ayrılmasını içerir. Bu adım, kuru buz5, ticari aparat 6,7 ile cam boncuklar, bitki materyalinin bir ağ elek8'e karşı öğütülmesi veya bitki dokusunun bir izolasyon tamponu9'da vortekslenmesi ile gerçekleştirilebilir. İkinci adım, ilgilenilen trikomların mikroskobik bitki kalıntılarından ve / veya diğer trikom türlerinden daha rafine bir şekilde ayrılmasını içerir. Bu adım, yoğunluk gradyanı santrifüjleme8,10 veyaçeşitli boyutlarda elekler 7,9 kullanılarak gerçekleştirilebilir. İşlenmiş dokulardaki RNA'nın bozunma ajanlarına karşı aşırı duyarlılığı nedeniyle, bu iki ardışık adım genellikle buz gibi soğuk izolasyon ortamında, genellikle protein inhibitörlerinin varlığında gerçekleştirilir4.
Geleneksel trikom izolasyon protokolleri, buz gibi soğuk sıcaklıklara ek olarak, verimli bir ekstraksiyon prosedürü sağlamak için büyük miktarda izolasyon ortamı gerektirir. Bu bileşenlerin birleşimi, yüksek verimi engelleyen zorlu ve zaman alıcı bir yalıtım süreciyle sonuçlanır. Bu nedenle, basit, kullanıcı dostu bir alternatif trikom izolasyon protokolü sunmak, trikom karakterizasyonu ile ilişkili çeşitli yönler için faydalı olacaktır. Bu makale, geleneksel protokollerden çeşitli unsurları birleştirerek ve entegre ederek, saplı ve sapsız glandüler capitate trikomlarını Esrar sativasından izole etmek için alternatif bir protokol sunmayı amaçlamaktadır. Bu elementler arasında kuru buz5, trikomların gözenek boyutları 7,9 azalan birkaç mikro elek içinden geçirilmesi ve izolasyon ortamı8 için sıvı azotun (LN) ikame edilmesi yer almaktadır.
Mevcut trikom izolasyon protokolünün yeniliği, geleneksel protokollerle karşılaştırıldığında, çeşitli şekillerde ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, tehlikeli bileşenler gerektirmediğinden kullanışlıdır. Prosedür laboratuvarda minimum önlemle gerçekleştirilebilir ve yüksek verimi kolaylaştırır. Standart sıvı izolasyon ortamının yerine LN'nin ikame edilmesi, izolasyon prosesi boyunca trikomların bütünlüğünü sağlayarak sonraki transkriptomik analizlere olanak tanır. LN ve kuru buzun süblimasyonu üzerine, izole edilmiş trikomlar zararlı artıklardan arındırılmış olarak bırakılır. Ayrıca, LN'nin oda sıcaklığında süblimasyon eğilimi, protokol boyunca cömert kullanımına izin verir. Buna karşılık, büyük miktarlarda geleneksel izolasyon ortamının kullanılması, taşınmasında pratik zorluklar yaratır. Son olarak, protokol disk hücresinin glandüler trikomun kalan kırılgan kafa yapısından ayrılmasını azaltır ve kafa boşluğu içeriğinin tutulmasını sağlar.
Bu protokol, C. sativa glandüler capitate trikomlarının izole edilmesinin teknik uygulamasına yardımcı olmak için tasarlanmış ayrıntılı bir adım adım tarzda sunulmaktadır. Protokol, aşağı akış moleküler analizi için uygun olan yüksek konsantrasyon ve saflığa sahip izole trikomlarla sonuçlanan yönetilebilir bir iş akışı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Biyoanalizör RNA Pico 6000 çip</td><td>Agilent, Almanya</td><td>Yeniden sipariş numarası 5067-1513</td><td>Çip üzerinde laboratuvar sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>Transsonic-310</td><td>Elma, Almanya</td><td>D-78224</td><td>Ultrasonik temizleme ünitesi&nbsp;</td></tr><tr><td>TruSeq RNA Numune Hazırlama Kiti v2</td><td>Illumina, ABD</td><td>RS-122-2001</td><td>RNA dizileme kütüphanesi için numune hazırlama</td></tr><tr><td>Spektrum Bitki Toplam RNA Kiti&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH, ABD</td><td>STRN50-1KT</td><td>Bitki Toplam RNA Kiti&nbsp;</td></tr><tr><td>350 & mikro ağ boyutuna sahip naylon mikro elek; m (un eleğinin çevresinden 40 x 40 cm veya daha büyük)</td><td>Sinun Tech, İsrail</td><td>r0350n350210</td><td>Naylon&nbsp; ekran açıklığı</td></tr><tr><td>150 ve mikro ağ boyutuna sahip naylon mikro elek; m (30 x 30 cm boyutunda)</td><td>Sinun Tech, İsrail</td><td>r0150n360465</td><td>Naylon&nbsp; ekran açıklığı</td></tr><tr><td>Örgü boyutu ø 105 ve mikro ile naylon mikro elek; m (30 x 30 cm boyutunda)</td><td>Sinun Tech, İsrail</td><td>r0105n320718</td><td>Naylon&nbsp; ekran açıklığı</td></tr><tr><td>Örgü boyutu ø 80 ve mikro olan naylon mikro elek; m (30 x 30 cm boyutunda)</td><td>Sinun Tech, İsrail</td><td>r0080n370465</td><td>Naylon&nbsp; ekran açıklığı</td></tr><tr><td>Örgü boyutu ø 65 ve mikro olan naylon mikro elek; m (30 x 30 cm boyutunda)</td><td>Sinun Tech, İsrail</td><td>r0065n340715</td><td>Naylon&nbsp; ekran açıklığı</td></tr><tr><td>Naylon mikro elek, ağ boyutu ø 50 ve mikro; m (30 x 30 cm boyutunda)</td><td>Sinun Tech, İsrail</td><td>r0080n370465</td><td>Naylon&nbsp; ekran açıklığı</td></tr><tr><td>10 g'a kadar donmuş bitki materyali (-80 oC veya sıvı nitrojen içinde saklanır)</td><td></td><td></td><td></td></tr>Düşük <tr><td>sıcaklıklarla</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>başa çıkmak için uygun eldivenler<td>Güvenlik gözlükleri</td></tr><tr><td>1 mm ekran kapısı (sivrisinek) ağ (30 x 100 cm şerit)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yaklaşık 5 mm delikli büyük süzgeç (kevgir)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L cam beher,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 blok kuru buz (0,5-1 kg)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çekiç ve sert, yassı nesne</td><td></td><td></td><td></td></tr>: <tr><td>İki adet 5 L'lik plastik kap</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Lastik bantlar,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Büyük un, elek veya elek süzgeci - tercihen çevresinde çıkarılabilir plastik halka bulunan bir süzgeç</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Birkaç büyük ve küçük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kap. Bunlardan biri, yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın dışında elenmiş kütlenin kaybını en aza indirmek için un eleğinin çevresinden (yaklaşık 40 cm çapında) daha büyük olmalıdır.</td> Önceden soğutulmuş (sıvı nitrojen ile) paslanmaz çelik kaşık, spatula ve kepçe Temiz plaka Birkaç mandal <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Önceden soğutulmuş (sıvı nitrojen yoluyla) etiketli 1,5 mL tüpler, steril bir iğne</td><td></td><td></td><td></td>ile kapağa delikler açılmış</tr><tr><td>İki kap sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>1 cm genişliğinde boyama fırçası</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

esrar sativasından glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların susuz İzolasyonu ve zenginleştirilmesi

Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa

Bu yazıda, Cannabis sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Kannabinoid ve uçucu terpen metabolizması için biyosentetik yollar öncelikle Esrar trikomlarında lokalize edilir ve izole trikomlar transkriptom analizi için faydalıdır. Transkriptomik karakterizasyon için glandüler trikomların izole edilmesine yönelik mevcut protokoller sakıncalıdır ve tehlikeye atılmış trikom kafaları ve nispeten düşük miktarda izole trikom sağlar. Ayrıca, RNA yıkımını önlemek için pahalı cihazlara ve protein inhibitörleri içeren izolasyon ortamına güvenirler. Bu protokol, sırasıyla C. sativa olgun dişi salkımından ve fan yapraklarından büyük miktarda izole glandüler kapitat saplı ve sapsız trikom elde etmek için üç bireysel modifikasyonun birleştirilmesini önermektedir. İlk modifikasyon, trikomların mikro eleklerden geçişini kolaylaştırmak için geleneksel izolasyon ortamı yerine sıvı azotun ikame edilmesini içerir. İkinci modifikasyon, trikomları bitki kaynağından ayırmak için kuru buz kullanmayı içerir. Üçüncü modifikasyon, bitki materyalinin azalan gözenek boyutlarına sahip beş mikro elek içinden art arda geçirilmesini içerir. Mikroskobik görüntüleme, izolasyon tekniğinin her iki trikom tipi için etkinliğini göstermiştir. Ek olarak, izole trikomlardan ekstrakte edilen RNA'nın kalitesi, aşağı akış transkriptomik analizi için uygundu.

Geleneksel trikom izolasyon protokollerine kıyasla bu protokolde yer alan ana modifikasyon, standart izolasyon ortamının LN ile değiştirilmesidir. LN'yi bir izolasyon ortamı olarak kullanmak, rahat bir iş akışı sağlar, çünkü numuneler LN'ye batırıldığı sürece, metabolik bozulmanın meydana gelmesi muhtemel değildir. Ayrıca, protokol geleneksel trikom izolasyon ortamında kullanılan tehlikeli bileşenlerden (yani, aurintrikarboksilik asit ve β-merkaptoetanol) kaçındığından, iş kimyasal bir başlık ile sınırlı değildir. Bununl...

Esrar sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, sadece sıvı azot, kuru buz ve naylon elekler kullanılarak trikomların kuru, tamponsuz ekstraksiyonuna dayanır ve RNA ekstraksiyonu ve transkriptomik analiz için uygundur.

Esrar sativasından Glandüler Kapitat Saplı ve Sapsız Trikomların Susuz İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

This paper presents a protocol for the convenient and high-throughput isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from ...

Protokolün önemi, tamamlanması için gereken kısa sürede kolaylık sağlamasında yatmaktadır. Bu, yüksek verim, yüksek konsantrasyon ve saplı ve sapsız trikomların yüksek derecede izolasyonunu sağlar. Bu tekniğin temel avantajı basitliğidir.Bu teknik sırasında, bitki kaynağının trikom yoğunluğu göz önünde bulundurulmalı ve protokolü ilk kez gerçekleştirirken mikroskop ile her adımda izolasyon derecesi incelenmelidir. Bu tekniği gösteren, Volcani Merkezi'nden esrar uzmanı Nurit Shalev olacak. Kuru bir buz bloğunu beş litrelik plastik bir kapta bir çekiç ve sert, düz bir nesne kullanarak küçük, ince pullar halinde ezerek başlayın.Büyük bir süzgeç kullanın ve ince kuru buz pullarını ezilmemiş kuru buzdan beş litrelik başka bir plastik kaba eleyin. Kuru buz pullarının yaklaşık 200 santimetreküpünü dik bir litrelik cam beher içine dökün. Ezilmiş kuru buzun ilk katmanına 10 grama kadar dondurulmuş esrar sativa salkımını ekleyin ve 200 santimetreküp ince ezilmiş kuru buz tabakası ile örtün.Ardından, bir litrelik cam kabın açıklığını, bir milimetrelik bir ekran kapısı cibinliğinin iki ila üç katmanı ile örtün ve lastik bantlarla sabitleyin. Ardından, sıvı azotu büyük bir yuvarlak tabanlı pasl

non-aqueous-isolation-enrichment-glandular-capitate-stalked-sessile

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hava bitki organlarının kütikül, bir supramoleküler biopolyester-balmumu meclisi tarafından korunmaktadır. Biz katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu ile moleküler ve mikro ölçeklerde domates meyve tırnak etlerini gelen seçici olarak çıkarılmasına epi-ve intracuticular mumlar, sırasıyla izlemek ve mühendislik cuticular biopolyesters çapraz-bağlantı kapasitesi değerlendirmek için protokolleri sunuyoruz.

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

Bitki bezleri, biyotik çevre ile etkileşimlerde yer alan birçok bileşiğin biyosentezi ve salgılanmasından sorumlu özel yapılardır. Moleküler ve biyokimyasal özellikleri üzerinde çalışmalara olanak sağlamak için, burada etçil bitki Nepenthes'ten metabolik olarak aktif tek bezleri izole etmek için mekanik bir mikro hazırlama tekniği oluşturulmuştur.

Etçil Bitki Nepenthes'in Dokusundan Canlı Çok Hücreli Bezlerin İzolasyonu

Lipid poliesterler, bitki kütikülü ve suberin içeren difüzyon bariyerleri olmak üzere iki hücre duvarı modifikasyonunun yapısal bileşenlerini oluşturur. Bu videoda, bütün delipide edilmiş yapraklardan kütini depolimerize etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, kütin veya suberin biyosentezinde tehlikeye giren mutantların araştırılmasına uygulanabilir.

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Bu protokol / Eser Lycopodium clavatum sporlar Sporopollenin ekzin kapsüller (sn) üretimi için, bu saniye hidrofilik bileşiklerin yüklenmesi için düzenlenmiş bir işlem açıklanmaktadır.

Mikroenkapsülasyon Uygulamaları için Ekstraksiyon Tesisi tabanlı Kapsüller

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Ultrasonik yardımlı ekstraksiyon (BAE), çözücülerin ekstraksiyon verimliliğini arttırır ve Esrar spp. biyokütlesine uygulandığında, ekstraksiyon için gereken süreyi azaltır. Bu, bozulma nedeniyle maliyeti ve potansiyel kanabinoid kaybını azaltır. Ek olarak, BAE düşük çözücü kullanımı nedeniyle yeşil bir yöntem olarak kabul edilir.

Esrar Biyokütlesinden Esrar Destekli Esrar Asidinin Ultrasonik Destekli Ekstraksiyonu

Bu makale, bitki ilişkili endofitik mantarların izolasyonu, izolatların uzun süreli korunması, morfolojik karakterizasyon ve sonraki moleküler tanımlama ve metagenomik analizler için toplam DNA ekstraksiyonu için ayrıntılı ve yeterli protokoller sağlamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitkilerde Endofitik Mantarları Tanımlamak için İzolasyon, Karakterizasyon ve Toplam DNA Ekstraksiyonu

Arabidopsis bitkilerinin yaprak yüzeyinden ve apoplastından hücre dışı RNA'yı izole etmek için basit ama oldukça tekrarlanabilir bir yöntem tarif ediyoruz.

Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA'nın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz

Bu protokol, Arabidopsis thaliana yapraklarından hücre dışı veziküllerin (EV) izole edilmesi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlar; bu yöntem aşağı akış moleküler ve fonksiyonel analizleri destekler.

Arabidopsis yapraklarından bitki ekstrasellüleri veziküllerinin optimize edilmiş apoplastik yıkama toplama yöntemiyle izolyasyonu ve arındırılması

Öğrenin Cannabis sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların susuz izolasyonunu. Bu yüksek verimli yöntem, RNA ekstraksiyonu ve transkriptomik analiz için yüksek saflıkta trikom sağlar.

Esrar sativasından Glandüler Kapitat Saplı ve Sapsız Trikomların Susuz İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Daha fazla video keşfet