Name: İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Keşfedin, fare kolonoidlerini izole ederek 3D bağırsak epiteli modeli oluşturma ve 2D monolayer sisteminde inflamatuar bağırsak hastalığı bariyer fonksiyonlarını inceleme yöntemlerini. Bu protokol, intestinal hastalıkların tedavisine yönelik yeni araştırma imkanları sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe R01DK120986 (KPM'ye) tarafından desteklenmiştir.

Bağırsak İltihabının Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki Epitelyal Etkileri

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%3A+The+epithelial+barrier+and+its+relationship+with+mucosal+immunity+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
<li>McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).</li>
<li>Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+and+ex+vivo+systems+used+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Models%22%5BJournal%5D)">In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease.</a> In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).</li>
<li>Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+inflammatory+bowel+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammopharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of inflammatory bowel disease: A review.</a> Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).</li>
<li>Ostanin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+transfer+model+of+chronic+colitis%3A+Concepts%2C+considerations%2C+and+tricks+of+the+trade%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).</li>
<li>Bhinder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Citrobacter+rodentium+mouse+model%3A+Studying+pathogen+and+host+contributions+to+infectious+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e50222(2013).</li>
<li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Dotti, I., Salas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+human+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+niche%3A+Homeostasis+and+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations.</a> Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5%2B+intestinal+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li>
<li>Wilson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+culture+conditions+for+improved+growth+and+functional+differentiation+of+mouse+and+human+colon+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids.</a> Frontiers in Immunology. 11, 547102(2021).</li>
<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+intestinal+inflammation+in+DSS-induced+model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3678(2012).</li>
<li>Cunningham, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B3+coactivator+1-%CE%B1+%28PGC1%CE%B1%29+protects+against+experimental+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Julian, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelium+is+more+susceptible+to+cytopathic+injury+and+altered+permeability+than+the+lung+epithelium+in+the+context+of+acute+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis.</a> International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).</li>
<li>Haberman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis+mucosal+transcriptomes+reveal+mitochondriopathy+and+personalized+mechanisms+underlying+disease+severity+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response.</a> Nature Communications. 10, 38(2019).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+plays+opposite+roles+in+the+initiation+and+progression+of+colitis-associated+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer.</a> Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).</li>
<li>Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+CMV+in+the+gut+of+HIV-infected+individuals+and+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006202(2017).</li>
<li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).</li>
<li>Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+Intestinal+mucosal+defense+and+inflammation%3A+Learning+from+clinical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 2054(2020).</li>
<li>Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+stem+cells+are+indispensable+for+radiation-induced+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).</li>
<li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+reprogramming+of+colonic+epithelium+links+ECM+remodeling+to+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).</li>
<li>Komiya, Y., Habas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Wnt signal transduction pathways.</a> Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).</li>
</ol>

Katkıda bulunan yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Organoid gelişimi, bilimsel topluluğun organ sistemlerini in vitro olarak inceleme biçiminde devrim yarattı ve hücresel yapıyı ve işlevi bir tabaktaki bir hayvandan veya insandan kısmen özetleme yeteneği ile değiştirdi. Ayrıca, hastalıkları olan insanlardan elde edilen organoid sistemler, terapötik karar verme sürecine rehberlik edebilecek kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir araç sunmaktadır. Burada, iyi çalışan bir kript izolasyon protokolünü açıklıyoruz ve kaplamadan önce izolasyondaki fazla kalıntılar...

İnflamatuar barsak hastalığı (IBD), inflamasyon ve klinik sessizlik atakları ile karakterize kronik, remisyonlu ve tekrarlayan bir hastalıktır. İBH'nin etiyolojisi multifaktöriyeldir, ancak hastalığın temel karakteristik özellikleri arasında epitel bölmesinde aktive olan proinflamatuar sinyal kaskadlarına ek olarak kusurlu bariyer fonksiyonu ve bağırsak epitelinin artmış geçirgenliği yer alır 1,2. IBD sırasında epitel yanıtını özetlemek için hücre kültürü ve inflamasyonun murin modelleri de dahil olmak üzere çeşitli in vitro ve in vivo modeller kullanılmıştır3. Bununla birlikte, tüm bu sistemlerin, İBH4 sırasındaki epitelyal değişiklikleri özetleme yeteneklerini sınırlayan önemli eksiklikleri vardır. IBD'yi incelemek için kullanılan hücre dizilerinin çoğu dönüştürülür, tek tabaka oluşturma yeteneğine sahiptir ve3'ü ayırt edebilir, ancak konakçıdaki dönüştürülmemiş bağırsak epitel hücrelerinden farklı şekilde özünde yayılır. IBD'yi incelemek için birkaç farklı fare inflamasyon modeli kullanılır, bunlardan bazıları nakavt modelleri, enfeksiyöz modeller, kimyasal enflamatuar modeller ve T hücresi transfer modelleri5,6,7,8'i içerir. Her biri IBD'nin genetik yatkınlıklar, bariyer disfonksiyonu, immün deregülasyon ve mikrobiyom gibi belirli etiyolojik yönlerini inceleyebilse de, hastalığın multifaktöriyel doğasını inceleme yetenekleri sınırlıdır.
Enteroidler ve kolonoidler de dahil olmak üzere bağırsak organoidleri, son on yılda, sadece bağırsak kök hücrelerinin dinamiklerini değil, aynı zamanda bağırsak epitelinin bariyer bütünlüğünü ve işlevini bağırsak homeostazı ve hastalığında oynadıkları rolü incelemek için yararlı bir in vitro model olarak kurulmuştur. Bu antiteler, İBH9'un patogenezini anlamamıza önemli ölçüde katkıda bulunmuş ve kişiselleştirilmiş tıp için yeni fırsatlar açmıştır. Kolonoidler veya kolondan kök hücre türevi, kendi kendini organize eden doku kültürleri, bağırsak kriptlerinde bulunan kök hücrelerin süresiz olarak yayılmasına ve muhafaza edilmesine izin veren bir süreçte hem murin hem de insan dokusundan geliştirilmiştir10. Kök hücre nişi in vivo büyümesini desteklemek için hücre dışı faktörlere, özellikle kanonik Wnt sinyaline ve kemik-morfojenik protein sinyal yollarınadayanır 11. Bu faktörlerin eklenmesi, kolonoidlerin sağlığını ve uzun ömürlülüğünü destekler, ancak aynı zamanda kültürü, hem kendi kendini yenileyen hem de terminal olarak farklılaşmış hücrelerden oluşan in vivo epitelyal hücresel mimariyi yansıtmayan kök hücre benzeri bir duruma doğru yönlendirir12,13. Bağırsak epitelinin işlevselliği, kök hücre bölmesi ile farklılaşmış hücreler arasındaki sürekli karışmaya bağlı olsa da, bir kolonoid kültür sisteminde her ikisine de sahip olma yeteneği oldukça sınırlıdır. Bu sınırlamalara rağmen, organoid kültür sistemi, epitelin içsel özelliklerini ex vivo olarak incelemek için altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, eldeki bilimsel soruyu cevaplamak için alternatif kültür stratejilerinin düşünülmesi gerekebilir.
Sürekli 7 günlük bir dekstran sodyum sülfat (DSS) rejimindeki farelerin hem epitel iltihabı hem de bariyer disfonksiyonu geliştirdiğigösterilmiştir 14. Ayrıca, insan IBD'sinde belirgin olduğu gösterilen mitokondriyal biyogenez yetmezliği ve bağırsak epitelinde metabolik yeniden programlama da bu DSS kolit15 modelinde yakalanmıştır. Bununla birlikte, ön verilerimiz, mitokondriyal biyogenez başarısızlığının özelliklerinin, DSS ile tedavi edilen hayvanların kriptlerinden türetilen kolonoidlerde korunmadığını göstermektedir (Ek Şekil 1). Bu nedenle, inflamasyonun murin bağırsak iltihabı sırasında epitel değişikliklerini nasıl yönlendirdiğini incelerken alternatif kültür yöntemleri kullanılmalıdır. Burada, 1) murin kolonoidlerinin kurulması için tüm kolon dokusundan kriptlerin nasıl izole edileceğini, 2) hücre popülasyonunu in vivo olarak yansıtmak için bu hücre popülasyonunun terminal olarak nasıl ayırt edileceğini ve 3) bu in vitro modelde inflamasyonun nasıl indükleneceğini açıklayan bir protokolü özetliyoruz. İltihaplı epitel içindeki ilaç etkileşimlerini incelemek için, temel olarak inflamatuar mediatörlerle tedavi edilebilen ve ilaç tedavileri ile apikal olarak tedavi edilebilen murin kolonoidlerinden 2-dimensonal (2D) tek tabakalar oluşturmak için bir protokol geliştirdik.

<table><tbody><tr><td>0.4-&mu; M şeffaf transwell, 24 kuyulu</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662-641</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik borular</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>70-&mu; M hücre süzgeci</td><td>VWR</td><td>76327-100</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>Stok Konsantrasyonu (1x); Son Konsantrasyon (1x)</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Stok Konsantrasyonu (50x); Son Konsantrasyon (1x)</td></tr><tr>EVO <td>World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td></td>Corning Matrigel GFR Membran Karışımı <td>Corning</td></tr><tr><td>354-230</td> için Yemek<td>Çubukları Elektrot Seti</td><td>Stok</td><td>Konsantrasyonu (%100); Nihai konsantrasyon (% 100)</td></tr> <tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>stok konsantrasyonu (1 m); nihai konsantrasyon (1.5 mM); Solvent (ultra saf su)</td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960-069</td><td>Stok Konsantrasyonu (1x); Son Konsantrasyon (1x)</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Kalsiyum ve Magnezyum Gibco içermeyen fosfat tamponlu salini</td><td>&nbsp;</td><td>14190-144</td><td>Stok Konsantrasyonu (1x); Son Konsantrasyon (1x)</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (ETDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>Stok Konsantrasyonu (0,5 M); Nihai konsantrasyon (30 mM)</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Bio-techne</td><td>S11150H</td><td>stok konsantrasyonu (% 100); Son Konsantrasyon (%1)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları, Beyaz, 25 x 75 mm</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>InvivoGen</td><td>ant-ga-1</td><td>Nihai Konsantrasyon (400 & mikro; g/&mikro; L)</td></tr> <tr><td>Gentamisin Reaktifi</td><td>Gibco / Fisher</td><td>15750-060</td><td>Stok Konsantrasyonu (50 mg / mL); Son Konsantrasyon (250 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Stok Konsantrasyonu (100x); Son konsantrasyon (1x)</td></tr><tr><td>HEPES 1 m</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Stok konsantrasyonu (1 m); Son Konsantrasyon (10 mM)</td></tr><tr><td>hIFN ve gama;</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>285-IF</td><td>Stok Konsantrasyonu (1000 ng/&mikro; L); Son Konsantrasyon (10 ng/mL); Çözücü (ultra saf su)</td></tr> <tr><td>hIL-1 ve beta;</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>201-LB</td><td>Stok Konsantrasyonu (10 ng/&mikro; L); Son Konsantrasyon (20 ng / mL); Çözücü (ultra saf su)</td></tr> <tr><td>hTNF ve alfa;</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>210-TA</td><td>Stok Konsantrasyonu (10 ng/&mikro; L); Son Konsantrasyon (40 ng/mL); Solvent (ultra saf su)</td></tr> <tr><td>Hidrojen Peroksit &</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Stok Konsantrasyonu (%30); Nihai konsantrasyon (% 0.003); Solvent (Fare yıkama ortamı)</td></tr><tr><td>Higromisin B Altın</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td>Nihai Konsantrasyon (400 & mikro; g/&mikro; L</td></tr><tr><td>) L-WRN Hücre Hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Novus</td><td>NBP2-35176</td><td>Stok Konsantrasyonu (0.5 & mikro; g/&mikro; L); Son Konsantrasyon (50 ng/mL); Çözücü (D-PBS +% 1 BSA)</td></tr> <tr><td>N-2 takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stok Konsantrasyonu (100x); Son Konsantrasyon (1x)</td></tr> <tr><td>N-Asetil-L-sistein</td><td>Sigma ve nbsp;</td><td>A9165-5G</td><td>Stok Konsantrasyonu (500 mM); nihai konsantrasyon (1 mM); Solvent (ultra saf su)</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Stok Konsantrasyonu (0.1 ng/&mikro; L); Son Konsantrasyon (100 ng/mL); Çözücü (Ultra Saf su +% 0.1 BSA)</td></tr> <tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td>Stok Konsantrasyonu (100x); Son Konsantrasyon (1x)</td></tr><tr><td>Petri kapları (sterilize; 100 mm x 15 mm) Polistiren tek kullanımlık</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren Mikroplakalar, 24 kuyu doku kültürü ile tedavi edilmiş, steril</td><td>Greiner Bio-one</td><td>5666-2160</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Stok Konsantrasyonu (0.25 &mikro; g/&mikro; L); Son Konsantrasyon (500 ng/mL); Çözücü (D-PBS +% 1 BSA)</td></tr> <tr><td>Tryp LE Express</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604-013</td><td>Stok Konsantrasyonu (10x); Son Konsantrasyon (1x); Solvent (1 mM EDTA)</td></tr><tr><td>Ultra Saf Su&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>Stok Konsantrasyonu (1x); Son Konsantrasyon (1x)</td></tr> <tr><td>Y-27632 dihidroklorür ve nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td>Stok Konsantrasyonu (10 mM); Son Konsantrasyon (10 & mikro; M); Solvent (Ultra Saf Su)</td></tr></tbody></table>

İntestinal İnflamasyonun yerleşik murin kolonoidleri Üzerindeki İn vitro epitelyal etkilerinin İncelenmesi

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Bağırsak epiteli, insan sağlığında önemli bir rol oynar ve konakçı ile dış ortam arasında bir bariyer sağlar. Bu son derece dinamik hücre tabakası, mikrobiyal ve immün popülasyonlar arasındaki ilk savunma hattını sağlar ve bağırsak immün tepkisini modüle etmeye yardımcı olur. Epitel bariyerinin bozulması, inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) ayırt edici özelliğidir ve terapötik hedefleme için ilgi çekicidir. 3 boyutlu kolonoid kültür sistemi, IBD patogenezinde bağırsak kök hücre dinamiği ve epitel hücre fizyolojisini incelemek için son derece yararlı bir in vitro modeldir. İdeal olarak, hayvanların iltihaplı epitel dokusundan kolonoidlerin oluşturulması, hastalık üzerindeki genetik ve moleküler etkilerin değerlendirilmesinde en faydalı olacaktır. Bununla birlikte, akut inflamasyonu olan farelerden oluşturulan kolonoidlerde in vivo epitelyal değişikliklerin mutlaka tutulmadığını gösterdik. Bu sınırlamayı ele almak için, kolonoidleri tipik olarak IBD sırasında yükselen bir inflamatuar mediatör kokteyli ile tedavi etmek için bir protokol geliştirdik. Bu sistem çeşitli kültür koşullarına her yerde uygulanabilirken, bu protokol hem farklılaşmış kolonoidler hem de yerleşik kolonoidlerden türetilen 2 boyutlu tek tabakalar üzerinde tedaviyi vurgular. Geleneksel bir kültür ortamında, kolonoidler bağırsak kök hücreleri ile zenginleştirilir ve kök hücre nişini incelemek için ideal bir ortam sağlar. Bununla birlikte, bu sistem, bariyer fonksiyonu gibi bağırsak fizyolojisinin özelliklerinin analizine izin vermez. Ayrıca, geleneksel kolonoidler, terminal olarak farklılaşmış epitel hücrelerinin proinflamatuar uyaranlara hücresel yanıtını inceleme fırsatı sunmaz. Burada sunulan yöntemler, bu sınırlamaları ele almak için alternatif bir deneysel çerçeve sağlar. 2 boyutlu tek katmanlı kültür sistemi, ex vivo terapötik ilaç taraması için de bir fırsat sunar. Bu polarize hücre tabakası, hücrenin bazal tarafında enflamatuar mediatörlerle ve IBD tedavisinde yararlılıklarını belirlemek için apikal olarak varsayılan terapötiklerle birlikte tedavi edilebilir.

3D bağırsak kolonoid kültür sistemi, epitelin bağırsak mukozal homeostazına içsel katkısını incelemek için paha biçilmez bir araçtır. Açıklanan protokol, 8 haftalıkken C57BL/6J (WT) farelerinden kriptlerin nasıl izole edileceğine ve birden fazla aşağı akış uygulaması için manipüle edilebilen uzun vadeli bir kolonoid kültür sisteminin nasıl kurulacağına dair ayrıntılı talimatlar sağlar. Bazal membran matrisindeki kriptlerin izolasyonu ve kaplanması üzerine, kriptler parlak alan mikroskobu ile görselleştirildiğinde yapı ol...

3 boyutlu kolonoidlerin gelişimi için murin kolonik kriptlerinin izolasyonunu detaylandıran bir protokol açıklıyoruz. Yerleşik kolonoidler daha sonra, enflamatuar bir meydan okuma almadan veya bir epitelyal tek tabaka oluşturmaya yönlendirilmeden önce konakçı epitelinin hücresel bileşimini yansıtacak şekilde terminal olarak farklılaştırılabilir.

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

Araştırmamız sayesinde, bağırsak fizyolojisinin belirli yönlerini ve iltihaplı bir hastalık durumunun varlığında değişikliklerini incelemek için murin kolonoidlerinin geleneksel bir kolonoid kültür sisteminden nasıl değiştirilebileceğini keşfetmeyi amaçlıyoruz. İnflamatuar bağırsak hastalığı gibi hastalık durumlarında bariyer fonksiyonunu ve bağırsak fizyolojisini incelemek, yalnızca kök hücre fizyolojisini yansıtan geleneksel bir murin kolonoid kültür sistemi kullanıldığında sınırlıdır. Protokolümüz, okuyucuya, enflamatuar mediatörlerin bağırsak epitelini nasıl etkilediğini, onları terminal olarak farklılaştırarak veya 2D tek katmanlı bir sistem oluşturarak incelemek için birden fazla teknik sağlaması bakımından avantajlıdır.Gelecekte, laboratuvarımız, bağırsak fizyolojisi ve hastalıklarının, özellikle inflamatuar bağırsak hastalığının farklı yönlerini araştırmak için insan kolonoid kültür sisteminin nasıl değiştirilebileceğini anlamaya odaklanacaktır.

studying-epithelial-effects-intestinal-inflammation-vitro-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Küçük hayvan görüntüleme teknikleri seri tetkikler ve in vivo terapötik müdahaleyi sağlar. Son zamanlarda, uygulamaların kapsamı önemli genişletmiştir ve şu anda kolon tümör gelişiminin değerlendirilmesi, yara iyileşmesi ve enflamasyon izleme içerir. Bu protokol kemirgen endoskopi bu çeşitli potansiyel uygulamaları göstermektedir.

Murin için Endoskop In Vivo Karsinojenez ve bağırsak Değerlendirilmesi Multimodaller Görüntüleme Yara İyileşmesi ve İltihap

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

enflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD) Mevcut tedaviler, hastalığın semptomlarını hafifletmek amaçlamaktadır, ancak ciddi yan etkilere neden olabilir. Böylece, alternatif stratejiler hayvan kolit modellerinde araştırılmaktadır. Burada, klinik IBD işaretleri diyet takviyeleri yararlı etkileri böyle bir kolit modelinde analiz edilmektedir açıklar.

Deneysel Kolit sırasında Bağırsak epitel Bariyer Fonksiyonları Üzerine Ek Beslenme Faydalı Etkileri Analizi

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

Burada, bir protokol kültür insan enteroid veya ana bilgisayar microbiota epitel etkileşimleri hücresel ve biyokimyasal düzeyde çalışmaya sağlam bariyer fonksiyonu var colonoid monolayers mevcut.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Burada ince bağırsak organoidlerinin bariyer bütünlüğünü ölçmek için bir teknik açıklanmıştır. Yöntemin canlı organoidlere dayanması, farklı bariyer bütünlüğünün maddeleri veya bunların kombinasyonlarını zaman içinde çözümlü bir şekilde modüle ederek sıralı olarak araştırılmasını sağlar.

Yaşayan Organoidlerde Bağırsak Bariyerinin Bozulmasının Araştırılması

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Bu protokolde, murine primer epitel kolon monolayerlerinin doğrudan bağırsak mahzenlerinden nasıl üretılacağını açıklıyoruz. Geçirgen filtreler üzerinde birleştirici monolayerler, çizik yarası iyileşmesi ve biyokimyasal çalışmalar için birikme monolayerleri ve immünofluoresans analizi için seyrek ve birleştirici monolayerler üretmek için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.

Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

Keşfedin, fare kolonoidlerini izole ederek 3D bağırsak epiteli modeli oluşturma ve 2D monolayer sisteminde inflamatuar bağırsak hastalığı bariyer fonksiyonlarını inceleme yöntemlerini. Bu protokol, intestinal hastalıkların tedavisine yönelik yeni araştırma imkanları sunar.

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

Daha fazla video keşfet