Name: Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği ile H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Öğrenin, tüm hücre yama-kelepçe tekniği ile H9c2 kardiyomiyositlerinde voltaja bağlı potasyum akımlarını kaydetmeyi. Bu yöntem, kardiyotoksisite mekanizmalarını iyon kanalı perspektifinden araştırmak için yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (82130113) ve Qinghai Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanının Anahtar Ar-Ge ve Dönüşüm Programı'nın (2020-SF-C33) finansal desteğini takdir ediyoruz.

Ticari olarak elde edilen H9c2 sıçan kardiyomiyositleri ( Malzeme Tablosuna bakınız), %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de %10 ısıl inaktive fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin içeren DMEM'de inkübe edildi. Daha sonra normal H9c2 hücrelerinde ve 4-AP veya AC ile tedavi edilen hücrelerde IKv'deki değişiklikleri tespit etmek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanıldı (Şekil 1 ve Şekil 2).
1. Çözelti hazırlama
<ol><li>% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren DMEM hücre kültürü ortamını hazırlayın (bkz.</li>
	<li>100 μL DMSO çözeltisine 14,1165 mg 4-AP ekleyerek 1,5 M 4-AP çözeltisi hazırlayın (bkz. Hücre dışı çözeltiyi ekleyerek 1,5 M 4-AP'yi 1,5 mM'ye seyreltin (adım 1,5).</li>
	<li>19.36 μL DMSO çözeltisine 5 mg AC ekleyerek 400 mM AC hazırlayın (bkz. NOT: Yukarıdaki tüm çözeltiler 4 °C'lik bir buzdolabında saklanmıştır ve DMSO'nun nihai konsantrasyonu %0,1'i (v/d) geçmemelidir.</li>
	<li>50 mL çift damıtılmış suya 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 g MgCl 2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2 ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) ve 0,1900 g EGTA (10,0 mM) ekleyerek 50 mL hücre içi çözelti hazırlayın (bakınız Tablo 1 ve Malzeme Tablosu). NOT: Hücre içi çözeltinin pH değeri, 1 M KOH kullanılarak 7.2'ye ayarlandı ve küçük hacimlere (1.5-2 mL) aliquoted edildi ve -20 ° C'de saklandı.</li>
	<li>50 mL çift damıtılmış suya 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl 2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) ve 0,0990 g D-glikoz (10,0 mM) ekleyerek 50 mL hücre dışı çözelti hazırlayın (bakınız Tablo 1 ve Malzeme Tablosu). NOT: Hücre dışı çözelti hemen kullanım için hazırlanmalı ve pH değeri 1 M NaOH kullanılarak 7,4'e ayarlanmalıdır.</li>
</ol>2. Hücre kültürü
<ol><li>H9c2 kültür kabı% 80 birleştiğinde, hücreleri 30 saniye boyunca% 0.25 tripsin ile sindirin.</li>
	<li>Normal ortam veya ilaç içeren ortama (25 μM, 50 μM, 100 μM ve 200 μM AC) sahip kültür 2 x 10 5 hücre/mL, 37 °C'de 24 saat boyunca cam plakalarla halı kaplı35 mm'lik bir tabakta, %5 CO2 atmosferi ve %70 ila %80 bağıl nem oranı ile (bkz.</li>
</ol>3. Mikropipet imalatı
<ol><li>Mikropipet çektirme makinesini açın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 30 dakika boyunca ön ısıtın.</li>
	<li>Mikropipet çektirme makinesine filamentli (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm uzunlukta) bir borosilikat cam kılcal damar koyun. Adım 3.3'te ayarlanan programı seçin ve kontrol panelinde Enter tuşuna basın. Cam kılcal damarın "Isı" değerini belirlemek için sağ üst köşedeki Rampa programına tıklayın.</li>
	<li>"Rampa" testi ile belirlenen değere göre elektrodu çekme programını yazın ve aşağıdaki adımları kullanın: "Isı" değeri = "Rampa" değeri, Çekme = 0, Vel = çekme çubuğu hareket hızı, Zaman = 200-250. Pipetleri üretmeye başlamak için Çek'e tıklayın. NOT: Kullanmadan önce mikropipet çektiricinin kapalı kabındaki kurutuculara dikkat edin. Renk maviden pembeye değişirse, kurutucular değiştirilmelidir. Elektrot ucunun kirlenmesini önlemek için, pipet hazırlığı sırasında cam kılcal damarın orta kısmına dokunmamaya çalışın. Daha sonra, üretilen pipetleri dikkatlice çıkarın ve kapalı ve kapalı bir kaba koyun.</li>
</ol>4. Cihaz kurulumu
<ol><li>İlgili cihazları aşağıdaki sırayla açın: dijital-analog dönüştürücü, sinyal amplifikatör, mikromanipülatör, mikroskop ve kamera (bkz.</li>
	<li>Görüntüleme uygulamasını, sinyal amplifikatör yazılımını ve veri toplama yazılımını sırayla açın (bkz. NOT: Cihaz sırayla açılmalıdır; aksi takdirde, yazılımı açtıktan sonra "Demo Sayısallaştırıcı" durumu görünecektir.</li>
</ol>5. IKv parametre ayarı
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek IKv'yi kaydetme protokolünü düzenleyin.<ol><li>Düzenle'ye tıklayın ve veri toplama yazılımında Protokolü Düzenle'yi seçin (bkz.</li>
		<li>Programı "Dalga Formu" arayüzünde düzenleyin: Epoch A (İlk seviye = -60 mV, Delta seviyesi = 0 mV, İlk süre = 20 ms ve Delta süresi = 0 ms); B Dönemi (Birinci düzey = -40 mV, Delta düzeyi = 10 mV, İlk süre = 150 ms ve Delta süresi = 0 ms) ve Dönem C (Birinci düzey = -60 mV, Delta düzeyi = 0 mV, İlk süre = 30 ms ve Delta süresi = 0 ms).</li>
		<li>Ardından, Mod/Hız arayüzüne tıklayın ve "Deneme Hiyerarşisi" verilerini ayarlayın: Deneme gecikmesi = 0 s, Çalıştırma = 1, Süpürme = 11 ve Süpürme süresi = 0,22 s22,23. NOT: IKv kanal akımlarını, kontrol koşulları altında -60 mV'luk bir tutma potansiyelinde 10 mV'luk bir artışla -40 mV'den +60 mV'a kadar 150 ms depolarize edici adımlar uygulayarak elde edin. Protokolün toplam süresi, "Dalga Formu" programında ayarlanan süreden daha büyük olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>P / N Sızıntı Çıkarma programını düzenleyin: Uyaran düğmesini seçmek için Protokolü Düzenle'ye tıklayın ve P / N Sızıntı Çıkarma iletişim kutusunda sızıntı çıkarma programını ayarlayın: Alt Süpürme sayısı = 2-8 (bu çalışmada 4), Yerleşme süresi = 100-1.000 ms (bu çalışmada 200), "Polarite" = "Dalga formunun karşısında", tutma seviyesi = -80 mV. NOT: P/N Sızıntısı çıkarma işlemi, "İlk tutma"dan (-60 mV) daha düşük bir tutma seviyesine sahip olmalıdır.</li>
</ol>6. I Kv'nin voltaj kelepçesi modunda tüm hücre yama kelepçesi kaydı
<ol><li>Veri depolama yolunu oluşturun: Dosya'ya tıklayın ve veri toplama yazılımında Veri Dosyası Adlarını Ayarla'yı seçin. Veri toplama yazılımında Düzenle'yi seçipProtokolü Aç'a tıklayarak oluşturulan I Kv protokolünü (adım 5.1) açın. Son olarak, Araçlar seçeneğine tıklayın ve protokolü çalıştırmaya başlamak için Membran Testi'ni seçin.</li>
	<li>Hücre dışı çözeltiyi (adım 1.5) tüm hücre yama kelepçesi aparatı üzerindeki hücre banyosuna ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve kapak kaymasını banyodaki H9c2 hücreleri (adım 2.1'de kültürlenmiş) ile yukarı doğru yerleştirin.</li>
	<li>Pipetin %30'unu (3. adımda imal edilmiştir) hücre dışı çözelti ile doldurun ve patch-kelepçe aparatına entegre edilmiş kayıt elektrot tutucusuna takın. Pipetleri o-ring kauçuk conta ve plastik rondela sıkın. Ardından, pipeti mikromanipülatör ile banyoya bırakın. IKv akım taban çizgisini 0 pA'da tutmak için sinyal amplifikatör yazılımının Pipet ofset arayüzüne tıklayın (bkz. NOT: Hücre içi çözelti (adım 1.4) gümüş telin AgCl/Ag kısmı ile temas halinde olmalı ve gümüş tel pipetin iç duvarına yakın olmamalıdır. Pipetin direnci 2-6 MΩ olmalıdır. Pipet ucunun tıkanmasını önlemek için, plastik boru24 aracılığıyla kayıt elektrot tutucusuna bağlı 1,0 mL'lik bir şırınga kullanılarak pipete sürekli bir pozitif basınç verilmelidir.</li>
	<li>Kayıt elektrodu tutucusuna plastik bir tüp aracılığıyla bağlı 1,0 mL'lik bir şırınga ile manuel olarak uygun bir pozitif basınç verin. Mikromanipülatörü hücreyle temas edecek şekilde üç boyutlu olarak manipüle ederek pipeti hafifçe hareket ettirin.</li>
	<li>Pipet hücre zarına dokunduktan sonra membran testi kare dalgası 1/3 ila 1/2 oranında düştüğünde, pozitif basıncı çıkarın ve manuel olarak uygun bir negatif basınç verin. Ardından, GΩ mührünü oluşturmak için veri toplama yazılımının Patch arayüzüne tıklayın. Hızlı ve yavaş kapasitansı telafi etmek için hücre sızdırmazlığı sırasında "C p Hızlı" ve "Cp Yavaş" sinyal amplifikatörü yazılımını kullanın. NOT: Membran testi ≥1 GΩ olduğunda, pipet ucu ile hücre arasında hücreye bağlı bir konfigürasyon oluşturulur.</li>
	<li>Hücre zarının bir yamasını yırtmak için kısa negatif basınç darbeleri uygulayın. NOT: Membran direncindeki hızlı bir azalma, başarılı bir tüm hücre kayıt modelini karakterize eder. Erişim direnci (Ra) ≥30 MΩ ise, hücreler 6.3-6.6 adımları için yeniden seçilmelidir. Kaydedilen I Kv verilerinin doğruluğunu sağlamak için, hücre zarı kırıldıktan sonra negatif basınç çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Sinyal amplifikatör yazılımının Tüm hücre düğmesine tıklayarak tüm hücre membran kapasitans kompanzasyonunu yürütün. Son olarak, Veri kaydı düğmesine tıklayarak verileri kaydedin ve kaydedin .</li>
	<li>Kaydedilen I Kv verilerini veri analiz yazılımı ile açın. Akım-gerilim (I−V) ilişkilerini kaydedin: Aşağıdakileri yapmak üzere İstatistikler'i seçmek için Analiz Et'e tıklayın: Veri analizi için Aralığı Kusorlar 1,2 olarak seçin; Tepe Genliği ve Ortalama düğmelerine tıklayın ve ardından Sonuçlar sayfasındaki verileri görüntülemek için Tamam'a tıklayın. Son olarak, daha fazla analiz için IKv ortalama veri sütununu fonksiyon çizim yazılımına kopyalayın (bkz.</li>
	<li>Temsilci IKv geçerli izlerini kaydedin: Transfer İzleri'ni seçmek için Düzenle'ye tıklayın; Ardından, aktarılacak Bölgedeki Tam izlemeyi seçin; Ardından, İzleme Seçiminde Seç'e tıklayın ve Sinyaller'de IN 0 (pA) öğesini seçin; Son olarak, "Sonuçlar" sayfasındaki verileri görüntülemek için Tamam'a tıklayın ve mevcut izleri çizmek için toplam verileri işlev çizim yazılımına kopyalayın.</li>
	<li>IKv protokolünü kaydedin: Uyaran Dalga Formu Sinyali Oluştur'u seçmek için Düzenle'ye tıklayın ve Tamam'ı seçin. Ardından, "Sinyaller" bölümünde A0 # 0 (mA) seçmek dışında adım 6.9'u yineleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Luan, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+transport+and+ion+channels+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Scientiarum+Naturalium+Universitatis+Intramongoljcae%22%5BJournal%5D)">Passive transport and ion channels in biofilms.</a> Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).</li>
<li>Lei, M., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+mechanism+of+arrhythmia+induced+by+sodium+channel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease.</a> Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).</li>
<li>Varró, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+transmembrane+ion+channels+and+action+potentials%3A+Cellular+physiology+and+arrhythmogenic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior.</a> Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).</li>
<li>Campuzano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+autopsy+and+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Negative autopsy and sudden cardiac death.</a> International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).</li>
<li>Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sodium+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflu%CC%88gers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sodium channelopathies.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).</li>
<li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+gated+Ca2%2B+currents+in+the+human+pathophysiologic+heart%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).</li>
<li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+dissection+of+multiple+ionic+currents+in+single+cardiac+myocytes+under+action+potential-clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).</li>
<li>Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+functional+myocardial+potassium+channel+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Electrophysiology+Clinics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity.</a> Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).</li>
<li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li>
<li>Olson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv1.5+channelopathy+due+to+KCNA5+loss-of-function+mutation+causes+human+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation.</a> Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).</li>
<li>Christophersen, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+KCNA5%3A+impact+on+the+atrial-specific+potassium+current+IKur+in+patients+with+lone+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation.</a> European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).</li>
<li>Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+knockout+of+the+transient+outward+current%2C+long-QT+syndrome%2C+and+cardiac+remodeling+in+mice+expressing+a+dominant-negative+Kv4+alpha+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit.</a> Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).</li>
<li>Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+ancillary+subunits+on+ventricular+repolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization.</a> Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).</li>
<li>Jia, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+studies+on+the+application+of+patch-clamp+technique+in+cellular+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Engineering+of+Chinese+Universities%22%5BJournal%5D)">Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology.</a> Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).</li>
<li>Leuthardt, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+electrocorticographic+speech+network+to+control+a+brain-computer+interface+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans.</a> Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).</li>
<li>Tian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applying+progress+of+patch-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Jilin+Medical+University%22%5BJournal%5D)">The applying progress of patch-clamp technique.</a> Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).</li>
<li>Wang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shensong+yangxin+capsule+on+c-type+Kv1.4+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel.</a> Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).</li>
<li>Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+resveratrol+on+Kv2.1+potassium+channels+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cardiac+Pacing+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes.</a> Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neferine+on+Kv4.3+channels+expressed+in+HEK293+cells+and+ex+vivo+electrophysiology+of+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aconitine%3A+A+review+of+its+pharmacokinetics%2C+pharmacology%2C+toxicology+and+detoxification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification.</a> Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270(2022).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+efficacy+and+toxicity+of+aconitine%3A+A+new+frontier+for+the+ancient+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison.</a> Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).</li>
<li>An, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+tegaserod%2C+a+gastrokinetic+agent%2C+on+voltage-gated+K%2B+channels+in+rabbit+coronary+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).</li>
<li>Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Kv2.1+by+BACE1+decreases+potassium+current+and+reduces+neuronal+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis.</a> Neurochemistry International. 155, 105310(2022).</li>
<li>Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+and+multi-electrode+array+electrophysiological+analysis+in+acute+mouse+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100442(2021).</li>
<li>Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+pressure-clamped+patch-clamp+recording+at+the+node+of+Ranvier+of+rat+myelinated+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100266(2021).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li>
<li>Yoshimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo+patch-clamp+technique+to+pharmacological+analysis+of+synaptic+transmission+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Yakurigaku+Zasshi.+Folia+Pharmacologica+Japonica%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS.</a> Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).</li>
<li>Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+and+perforated+patch-clamp+recordings+from+acutely-isolated+murine+sinoatrial+node+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells.</a> Bio-protocol. 10 (1), 3478(2020).</li>
<li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+problems+with+in+vitro+screening+of+drugs+for+QT+interval+prolongation+using+HERG+K%2B+channels+expressed+in+mammalian+cell+lines+and+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+whole-cell+patch-clamp+configuration+on+the+pharmacological+assessment+of+the+hERG+channel%3A+Trazodone+as+a+case+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).</li>
<li>Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+in+vivo+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Remedies+%26+Clinics%22%5BJournal%5D)">The development of in vivo patch clamp technique.</a> Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).</li>
<li>Lin, Y. F., Ouyang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+and+application+of+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Strait+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Research progress and application of patch clamp technique.</a> Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+current+advances+on+pharmacology%2C+pharmacokinetics%2C+toxicity+and+detoxification+of+aconitine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115(2022).</li>
<li>Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chinese+herbal+medicines+revisited%3A+A+Hong+Kong+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective.</a> Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).</li>
<li>Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+meta-analysis+based+on+the+preclinical+evidence+of+mechanism+of+aconitine-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 900842(2022).</li>
<li>Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Shenyang+Pharmaceutical+University%22">Shenyang Pharmaceutical University</a>. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aconitine+blocks+HERG+and+Kv1.5+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels.</a> Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).</li>
<li>Campbell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+kinetics+and+selectivity+of+sodium+channels+in+frog+skeletal+muscle+fibers+treated+with+aconitine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine.</a> The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).</li>
<li>Huang, X. Y., Ying, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+specific+protein+1+on+Kv2.1+potassium+channel+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology+and+Circulation%22%5BJournal%5D)">The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes.</a> Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).</li>
<li>Cao, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Yuncheng+University%22%5BJournal%5D)">Development and application of patch clamp technique.</a> Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Yama-kelepçe elektrofizyolojik tekniği esas olarak hücre zarı25 üzerindeki iyon kanallarının elektriksel aktivitesini ve fonksiyonel özelliklerini kaydetmek ve yansıtmak için kullanılır. Şu anda, yama kelepçe tekniğinin ana kayıt yöntemleri arasında tek kanallı kayıt ve tüm hücre kaydı26 bulunmaktadır. Tüm hücre modu için, cam mikroelektrot ve negatif basınç, hücre zarının küçük bir alanı ile pipet ucu27 arasında yüksek dirençli bir conta oluşturmak ...

İyon kanalları, hücre zarının lipit çift katmanına gömülü özel entegre proteinlerdir. Aktivatörlerin varlığında, bu tür özel entegre proteinlerin merkezleri, uygun boyut ve yükteki iyonların pasif bir taşıma yöntemiyle geçmesine izin veren oldukça seçici hidrofilik gözenekler oluşturur1. İyon kanalları, hücre uyarılabilirliğinin ve biyoelektriğin temelidir ve çeşitli hücresel aktivitelerde önemli bir rol oynar2. Kalp, aksiyon potansiyelleri tarafından başlatılan uyarılma-kasılma-birleşmiş bir süreçten kaynaklanan düzenli kasılmalar yoluyla diğer organlara kan sağlar3. Önceki çalışmalar, kardiyomiyositlerde aksiyon potansiyellerinin oluşumunun hücre içi iyon konsantrasyonundaki değişimden kaynaklandığını ve insan kardiyomiyositlerinde Na +, Ca2 + ve K + iyon kanallarının aktivasyonu ve inaktivasyonunun belirli bir sırayla aksiyon potansiyellerinin oluşumuna yol açtığını doğrulamıştır 4,5,6. Bozulmuş voltaj kapılı potasyum (Kv) kanal akımları (IKv) normal kalp ritmini değiştirebilir ve önde gelen ölüm nedenlerinden biri olan aritmilere yol açabilir. Bu nedenle, IKv'nin kaydedilmesi, hayatı tehdit eden aritmilerin tedavisinde kullanılan ilaçların mekanizmalarını anlamak için kritik önemesahiptir 7.
Kv kanalı, potasyum kanalının önemli bir bileşenidir. Kv kanalının koordinasyon fonksiyonu, memeli kalbinin elektriksel aktivitesinde ve miyokard kontraktilitesinde önemli bir rol oynar 8,9,10. Kardiyomiyositlerde, aksiyon potansiyellerinin genliği ve süresi, dışa doğru K + akımlarının çoklu Kv kanalı alt tipleri11 tarafından birlikte iletilmesine bağlıdır. Kv kanal fonksiyonunun düzenlenmesi, kardiyak aksiyon potansiyelinin normal repolarizasyonu için çok önemlidir. Kv iletkenliğindeki en ufak bir değişiklik bile kardiyak repolarizasyonu büyük ölçüde etkiler ve aritmi olasılığını arttırır12,13.
Hücresel elektrofizyolojik araştırmalarda temel bir yöntemi temsil eden hücre zarının küçük bir alanı ile tüm hücre yama-kelepçe kaydı için pipet ucu arasında negatif basınç uygulanarak yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulabilir. Sürekli negatif basınç, hücre zarının pipet ucuyla temas etmesini ve pipetin iç duvarına yapışmasını sağlar. Ortaya çıkan tam elektrik devresi, hücre zarı14'ün yüzeyi boyunca herhangi bir tek iyon kanalı akımının kaydedilmesini sağlar. Bu teknik, hücre zarı iyon kanalı akımı için çok yüksek bir hassasiyete sahiptir ve tüm iyon kanallarındaki akımları tespit etmek için kullanılabilir ve uygulamalar son derece geniştir15. Ayrıca, floresan etiketleme ve radyoaktif etiketleme ile karşılaştırıldığında, yama kelepçesi daha yüksek otorite ve doğruluğa sahiptir16. Şu anda, tüm hücre yama-kelepçe tekniği, Kv kanal akımlarına etki eden geleneksel Çin tıbbı bileşenlerini tespit etmek için kullanılmıştır17,18,19. Örneğin, Wang ve ark. tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullandılar ve lotus tohumunun etkili bileşeninin, aktif durum kanallarını bloke ederek Kv4.3 kanalının inhibisyonunu sağlayabileceğini doğruladılar19. Aconitine (AC), Aconitum carmichaeli Debx ve Aconitum sarkaç Busch gibi Aconitum türlerinin etkili ve aktif bileşenlerinden biridir. Çok sayıda çalışma, aşırı dozda AC'nin aritmilere ve hatta kalp durmasına neden olabileceğini göstermiştir20. AC ve voltaj kapılı iyon kanalları arasındaki etkileşim, kardiyotoksisitenin anahtar mekanizması olan hücre içi iyon homeostazının bozulmasına yol açar21. Bu nedenle, bu çalışmada, AC'nin kardiyomiyositlerin IKv'si üzerindeki etkilerini belirlemek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>4-Aminopiridin</td><td>Sigma</td><td>MKCJ2184</td><td></td></tr><tr><td>Aconitine</td><td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td><td>DSTDW000602</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Akson Enstrümanı</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi</td><td>Sartorius</td><td>124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>ATP Na2</td><td>Solarbio</td><td>416O022</td><td></td></tr><tr><td>Filamentli borosilikat cam (OD: 1.5 mm, ID: 1.10 mm, 10 cm uzunluk)&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>163225-5</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı (100 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı (35 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>3012022</td><td></td></tr><tr><td>Clampex yazılımı</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>Sürüm 10. 5</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit yazılımı</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>Sürüm 10. 6. 0. 13</td><td>veri toplama yazılımı</td></tr><tr><td>D-(+)-glikoz</td><td>Rhawn</td><td>RH289133</td><td></td></tr><tr><td>Dijital kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440</td><td></td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>Axon Enstrüman</td><td>Axon digidata 1550B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (1x)</td><td>Gibco</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Biofroxx</td><td>EZ6789D115</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/kahverengi mikropipet çektirme</td><td>Sutter Enstrüman Modeli</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 hücreleri</td><td>Hunan Fenghui Biyoteknoloji Co, Ltd</td><td>CL0111</td><td></td></tr><tr><td>HCImageLive</td><td>Hamamatsu</td><td>4.5.0.0</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>2106081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Xiya Kimya Teknolojisi (Shandong) Co., Ltd</td><td>20210221</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020082501</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020112601</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Tianjin Guangfu İnce Kimyasal Araştırma Enstitüsü</td><td>20160408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<alt>2</alt> ve orta nokta; 6H2O</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2021020101</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Sutter Aleti</td><td>MP-285A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı (20 ve kez; 20 mm)</td><td>Jiangsu Citotest Deneysel Ekipman Co, Ltd</td><td>80340-0630</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Chengdu Biyobilim Technology Co, Ltd</td><td>Milli-Q IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B komutanı</td><td>Axon Instrument</td><td>MultiClamp komutanı 2.0</td><td>sinyal amplifikatörü yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>OriginPro 8 yazılımı</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724 (B724)</td><td></td></tr> <tr><td>Penisilin-Streptomisin (100x)</td> <td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>PH&nbsp; metre&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>S201K</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (1x)</td><td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin %0,25 (1x)</td><td>HyClone</td><td>J210045</td><td></td></tr></tbody></table>

tüm hücre yama-kelepçe tekniği ile h9c2 kardiyomiyositlerine voltaja bağlı potasyum akımı kaydı

Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

Miyokard hücre zarı üzerindeki potasyum kanalları, hücre elektrofizyolojik aktivitelerinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ana iyon kanallarından biri olan voltaj kapılı potasyum (Kv) kanalları, ilaca bağlı miyokard hasarı ve miyokard enfarktüsü gibi bazı ciddi kalp hastalıkları ile yakından ilişkilidir. Bu çalışmada, H9c2 kardiyomiyositlerinde 1.5 mM 4-aminopiridin (4-AP, geniş spektrumlu potasyum kanal inhibitörü) ve akonitinin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM ve 200 μM) Kv kanal akımı (IKv) üzerindeki etkilerini belirlemek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılmıştır. 4-AP'nin IKv'yi yaklaşık% 54 oranında inhibe ettiği, AC'nin I Kv üzerindeki inhibitör etkisinin doza bağımlı bir eğilim gösterdiği bulunmuştur (25μM için etki yok, 50 μM için% 30 inhibitör oran, 100 μM için% 46 inhibitör oranı ve 200 μM için% 54 inhibitör oranı). Daha yüksek duyarlılık ve hassasiyet özellikleri nedeniyle, bu teknik kardiyotoksisitenin araştırılmasını ve etnotıbbın iyon kanallarını hedeflemesinin farmakolojik etkilerini teşvik edecektir.

Bu protokol, IKv'nin tüm hücre yama-kelepçe tekniğinde ayarlanan parametrelere göre kaydedilmesine izin verdi. IKv, -60 mV'luk bir tutma potansiyelinde -40 ila +60 mV'luk bir depolarizan darbe uyaranı ile 150 ms depolarizan darbe uyaranı ile tetiklendi (Şekil 3A). H9c2 sıçan kardiyomiyositlerinin IKv'si ilk önce -20 mV civarında ortaya çıktı ve daha sonra genlik daha fazla depolarizasyon ile arttı. IKv ve membran potansiyeli arasındaki ortalama ili...

Bu protokol, tüm hücre yama kelepçesi tekniğini kullanarak H9c2 kardiyomiyositlerinde voltaj kapılı potasyum (Kv) kanal akımlarının gerçek zamanlı ve dinamik olarak elde edilmesi için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği ile H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Bu protokol, akonitinin H9C2 hücrelerinin IKv'si üzerindeki etkilerini başarıyla kaydeder. İyon kanalları perspektifinden ilaçların kardiyotoksisite mekanizmasını araştırmak için yeni aşamaların teşvik edilmesi. Tüm hücre yama-kelepçe tekniği, yüksek hassasiyet, yüksek hassasiyet ve yüksek özgüllük ile iyon kanalı araştırmasının altın standardıdır.Tüm hücre yama kelepçesi tekniği, kardiyovasküler sistem ve sinir sistemi gibi çoklu sistem hastalıkları için yan yana gelen spesifik iyon kanallarının farmakolojik veya toksik mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir. Başlamak için, H9C2 kültür kabı% 80 birleştiğinde, hücreleri 30 saniye boyunca% 0.25 tripsin ile sindirin. Kültür 2 kez 10 ila 5. hücreler mililitre başına normal ortam veya ilaç içeren ortam ile 37 santigrat derecede 24 saat cam plakalarla halı kaplı 35 milimetrelik bir tabakta,% 5 karbondioksit atmosferi ve% 70 ila% 80 bağıl nem ile.Mikropipet çektirme makinesini açın ve 30 dakika boyunca ön ısıtın. Daha sonra mikropipet çektirme makinesine filamentli bir borosilikat cam kılcal damar koyun. Programı seçin ve kontrol panelinde enter tuşuna tıklayın.Cam kılcal damarın ısı değerini belirlemek için sağ üst köşedeki rampa programına tıklayın. Rampa testi ile belirlenen değere göre elektrodu çekme programını yazın ve pipetleri imal etmeye başlamak için çekme düğmesine tıklayın. Dijital analog dönüştürücüyü, sinyal amplifikatörünü, mikro manipülatörü, mikroskobu ve kamerayı açın.Görüntüleme uygulamasını, sinyal amplifikatör yazılımını ve veri toplama yazılımını sırayla açın. Al üzerine tıklayın ve veri toplama yazılımında düzenleme protokolünü seçin. Programı dalga formu arayüzünde düzenleyin.A, B dönemi ve C dönemi için birinci düzey, delta düzeyi, ilk süre ve delta süresi değerlerini girin.Ardından mod hızı arabirimine tıklayın ve deneme hiyerarşisi verilerini ayarlayın. Ardından, uyaran düğmesini seçmek için protokolü düzenle'ye tıklayın ve PM sızıntı çıkarma iletişim kutusunda sızıntı çıkarma programını ayarlayın. Veri depolama yolunu oluşturmak için, dosyaya tıklayın ve veri toplama yazılımında veri dosyası adlarını ayarla'yı seçin.Ardından, veri toplama yazılımında acquire (edin) seçeneğini seçip protokolü aç'a tıklayarak oluşturulan lKv protokolünü açın. Son olarak, araçlar seçeneğine tıklayın ve protokolü çalıştırmaya başlamak için membran testini seçin. Hücre dışı çözeltiyi, tüm hücre yama kelepçesi aparatı üzerindeki hücre banyosuna ekleyin ve kapak kaymasını banyodaki H9C2 hücreleri ile yukarı doğru yerleştirin.Pipetin% 30'unu hücre dışı çözelti ile doldurun ve yama kelepçe aparatına entegre edilmiş kayıt elektrot tutucusuna takın. Pipetleri kayıt elektrot tutucusuyla sıkın. Daha sonra pipeti mikro manipülatör ile banyoya bırakın.lKv akım taban çizgisini sıfır pikoampirde tutmak için sinyal amplifikatör yazılımının pipet ofset arayüzüne tıklayın. Kayıt elektrodu tutucusuna bağlı 1,0 mililitrelik bir şırınga ile plastik bir tüp aracılığıyla manuel olarak uygun bir pozitif basınç sağlayın. Mikromanipülatörü hücreyle temas edecek şekilde üç boyutlu olarak manipüle ederek pipeti hafifçe hareket ettirin.Membran, pipet hücre zarına dokunduktan sonra kare dalganın üçte bir ila yarı yarıya düştüğünü test ettikten sonra, pozitif basıncı çıkarın ve manuel olarak uygun bir negatif basınç verin. Ardından, gigaseal'i oluşturmak için veri toplama yazılımının yama arayüzüne tıklayın. Hızlı ve yavaş kapasitansı telafi etmek için hücre tavanı sırasında hızlı kapasitans telafisi ve kapasitans telafisi yavaş sinyal amplifikatörü yazılımını kullanın.Hücre zarının bir yamasını yırtmak için kısa negatif basınç darbeleri uygulayın. Sinyal amplifikatörü yazılımının tüm hücre düğmesine tıklayarak tüm hücre membran kapasitans kompanzasyonunu çalıştırın. Son olarak, veri kayıt düğmesine tıklayarak verileri kaydedin ve kaydedin.Kaydedilen lKv verilerini veri analiz yazılımı ile açın. Mevcut voltaj ilişkilerini kaydedin. İstatistikleri seçmek için analiz et'e tıklayın.Veri analizi için aralığı İmleçler 1 2 olarak seçin, tepe genliği ve ortalama düğmelerine tıklayın ve ardından sonuçlar sayfasındaki verileri görüntülemek için Tamam'a tıklayın. Son olarak, daha fazla analiz için lKv ortalama veri sütununu fonksiyon çizim yazılımına kopyalayın. Temsili lKv akım izlerini kaydedin.Aktarım izlemelerini seçmek için düzenle'yi tıklayın, ardından aktarılacak bölgedeki tam izlemeyi seçin. Ardından, izleme seçiminde seç'e tıklayın ve sinyallerde IN 0'ı seçin. Son olarak, sonuçlar sayfasındaki verileri görüntülemek için Tamam'a tıklayın ve mevcut izleri çizmek için toplam verileri işlev çizim yazılımına kopyalayın.lKv protokolünü kaydedin. Uyaran dalga formu sinyali oluştur'u seçmek için düzenle'ye tıklayın ve Tamam'ı seçin. Ardından, sinyali seçmeden akım izlerini çizme adımını tekrarlayın.lKv, eksi 60 milivoltluk tutma potansiyelinde eksi 40 ila artı 60 milivolt arasında 150 milisaniyelik depolarizan darbe uyaranı ile tetiklendi. H9C2 sıçan kardiyomiyositlerinin lKv'si, ilk önce eksi 20 milivolt civarında ortaya çıktı ve daha sonra genlik daha fazla depolarizasyon ile arttı. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, lKv genliği, 1.5 milimolar 4-AP ile beş dakikalık tedaviden sonra gözlenebilir şekilde azaldı.Ek olarak, lKv, 24 saatlik AC tedavisinden sonra, membran potansiyellerinde doza bağlı bir şekilde 10 ila 60 milivolt arasında önemli ölçüde azalmıştır. İyon kanalını kaydettikten sonra bireysel hücre, tek hücreli genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik gibi daha fazla tek hücreli omik değerlendirmesi için kullanılabilir.

voltage-dependent-potassium-current-recording-on-h9c2-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Yılanı / dilatör yanıtları (basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak) ölçümleri ile paralel izole arteriyel miyositler (yama elektrofizyolojik teknikler kelepçe kullanarak) KV7 (KCNQ) potasyum kanal aktivitenin ölçümleri vasküler düz kas fizyolojisi KV7 kanalları rolleri hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarmak ve olabilir farmakoloji.

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Kv kanal disfonksiyonu kardiyak aritmiler ile ilişkilidir. Biz Kv kanal yan altbirim knockout farelerde atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu için sistematik bir protokol kullanmak gibi aritmiler neden moleküler mekanizmaları incelemek için. İzole kardiyomiyositlerde hemen sonra hücresel elektrofizyolojik çalışmalar, biyokimyasal ya da immunofloresan (IF) deneyleri için de kullanılabilir.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu...

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu protokol tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için temel usul adımları açıklar. Bu teknik nöronların elektriksel davranışının çalışma sağlar ve beyin dilimleri yapıldığında, hala nispeten iyi korunmuş beyin devreleri entegre edilmiştir nöronlardan farklı nöron işlevlerinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Tavşan kardiyomiyositlerinde GtACR1 aktivasyonunun elektromekanik etkilerinin değerlendirilmesi için bir protokol sayılmiyoruz. Hücre izolasyonu, kültür ve adenoviral transdüksiyon ve yama-kelepçe ve karbon-fiber teknikleri ile fonksiyonel deneyler hakkında ayrıntılı bilgi salıyoruz.

Optogenetik Modüle Kardiyomiyosit Aktivitesinin Elektromekanik Değerlendirilmesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

Bu protokol, sıçan baziler arterinden düz kas hücrelerini izole etmek ve tüm hücre yama kelepçesi tekniğini kullanarak bu hücrelerde içe doğru doğrultucu potasyum kanal akımlarını kaydetmek için hızlı ve etkili bir yöntemi tanımlar. Baziler arter ve iyon kanallarını inceleyen araştırmacılar için yeni bir yaklaşım sunar.

Yeni İzole Edilmiş Baziler Arter Düz Kas Hücrelerinde İçe Doğru Doğrultucu K+ Akımlarının Yama Klemp Tekniği ile Kaydedilmesi

Öğrenin, tüm hücre yama-kelepçe tekniği ile H9c2 kardiyomiyositlerinde voltaja bağlı potasyum akımlarını kaydetmeyi. Bu yöntem, kardiyotoksisite mekanizmalarını iyon kanalı perspektifinden araştırmak için yeni olanaklar sunar.

Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği ile H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı

Daha fazla video keşfet