Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği ile H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı

Bu protokol, akonitinin H9C2 hücrelerinin IKv'si üzerindeki etkilerini başarıyla kaydeder. İyon kanalları perspektifinden ilaçların kardiyotoksisite mekanizmasını araştırmak için yeni aşamaların teşvik edilmesi. Tüm hücre yama-kelepçe tekniği, yüksek hassasiyet, yüksek hassasiyet ve yüksek özgüllük ile iyon kanalı araştırmasının altın standardıdır.

Tüm hücre yama kelepçesi tekniği, kardiyovasküler sistem ve sinir sistemi gibi çoklu sistem hastalıkları için yan yana gelen spesifik iyon kanallarının farmakolojik veya toksik mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir. Başlamak için, H9C2 kültür kabı% 80 birleştiğinde, hücreleri 30 saniye boyunca% 0.25 tripsin ile sindirin. Kültür 2 kez 10 ila 5. hücreler mililitre başına normal ortam veya ilaç içeren ortam ile 37 santigrat derecede 24 saat cam plakalarla halı kaplı 35 milimetrelik bir tabakta,% 5 karbondioksit atmosferi ve% 70 ila% 80 bağıl nem ile.

Mikropipet çektirme makinesini açın ve 30 dakika boyunca ön ısıtın. Daha sonra mikropipet çektirme makinesine filamentli bir borosilikat cam kılcal damar koyun. Programı seçin ve kontrol panelinde enter tuşuna tıklayın.

Cam kılcal damarın ısı değerini belirlemek için sağ üst köşedeki rampa programına tıklayın. Rampa testi ile belirlenen değere göre elektrodu çekme programını yazın ve pipetleri imal etmeye başlamak için çekme düğmesine tıklayın. Dijital analog dönüştürücüyü, sinyal amplifikatörünü, mikro manipülatörü, mikroskobu ve kamerayı açın.

Görüntüleme uygulamasını, sinyal amplifikatör yazılımını ve veri toplama yazılımını sırayla açın. Al üzerine tıklayın ve veri toplama yazılımında düzenleme protokolünü seçin. Programı dalga formu arayüzünde düzenleyin.

A, B dönemi ve C dönemi için birinci düzey, delta düzeyi, ilk süre ve delta süresi değerlerini girin.Ardından mod hızı arabirimine tıklayın ve deneme hiyerarşisi verilerini ayarlayın. Ardından, uyaran düğmesini seçmek için protokolü düzenle'ye tıklayın ve PM sızıntı çıkarma iletişim kutusunda sızıntı çıkarma programını ayarlayın. Veri depolama yolunu oluşturmak için, dosyaya tıklayın ve veri toplama yazılımında veri dosyası adlarını ayarla'yı seçin.

Ardından, veri toplama yazılımında acquire (edin) seçeneğini seçip protokolü aç'a tıklayarak oluşturulan lKv protokolünü açın. Son olarak, araçlar seçeneğine tıklayın ve protokolü çalıştırmaya başlamak için membran testini seçin. Hücre dışı çözeltiyi, tüm hücre yama kelepçesi aparatı üzerindeki hücre banyosuna ekleyin ve kapak kaymasını banyodaki H9C2 hücreleri ile yukarı doğru yerleştirin.

Pipetin% 30'unu hücre dışı çözelti ile doldurun ve yama kelepçe aparatına entegre edilmiş kayıt elektrot tutucusuna takın. Pipetleri kayıt elektrot tutucusuyla sıkın. Daha sonra pipeti mikro manipülatör ile banyoya bırakın.

lKv akım taban çizgisini sıfır pikoampirde tutmak için sinyal amplifikatör yazılımının pipet ofset arayüzüne tıklayın. Kayıt elektrodu tutucusuna bağlı 1,0 mililitrelik bir şırınga ile plastik bir tüp aracılığıyla manuel olarak uygun bir pozitif basınç sağlayın. Mikromanipülatörü hücreyle temas edecek şekilde üç boyutlu olarak manipüle ederek pipeti hafifçe hareket ettirin.

Membran, pipet hücre zarına dokunduktan sonra kare dalganın üçte bir ila yarı yarıya düştüğünü test ettikten sonra, pozitif basıncı çıkarın ve manuel olarak uygun bir negatif basınç verin. Ardından, gigaseal'i oluşturmak için veri toplama yazılımının yama arayüzüne tıklayın. Hızlı ve yavaş kapasitansı telafi etmek için hücre tavanı sırasında hızlı kapasitans telafisi ve kapasitans telafisi yavaş sinyal amplifikatörü yazılımını kullanın.

Hücre zarının bir yamasını yırtmak için kısa negatif basınç darbeleri uygulayın. Sinyal amplifikatörü yazılımının tüm hücre düğmesine tıklayarak tüm hücre membran kapasitans kompanzasyonunu çalıştırın. Son olarak, veri kayıt düğmesine tıklayarak verileri kaydedin ve kaydedin.

Kaydedilen lKv verilerini veri analiz yazılımı ile açın. Mevcut voltaj ilişkilerini kaydedin. İstatistikleri seçmek için analiz et'e tıklayın.

Veri analizi için aralığı İmleçler 1 2 olarak seçin, tepe genliği ve ortalama düğmelerine tıklayın ve ardından sonuçlar sayfasındaki verileri görüntülemek için Tamam'a tıklayın. Son olarak, daha fazla analiz için lKv ortalama veri sütununu fonksiyon çizim yazılımına kopyalayın. Temsili lKv akım izlerini kaydedin.

Aktarım izlemelerini seçmek için düzenle'yi tıklayın, ardından aktarılacak bölgedeki tam izlemeyi seçin. Ardından, izleme seçiminde seç'e tıklayın ve sinyallerde IN 0'ı seçin. Son olarak, sonuçlar sayfasındaki verileri görüntülemek için Tamam'a tıklayın ve mevcut izleri çizmek için toplam verileri işlev çizim yazılımına kopyalayın.

lKv protokolünü kaydedin. Uyaran dalga formu sinyali oluştur'u seçmek için düzenle'ye tıklayın ve Tamam'ı seçin. Ardından, sinyali seçmeden akım izlerini çizme adımını tekrarlayın.

lKv, eksi 60 milivoltluk tutma potansiyelinde eksi 40 ila artı 60 milivolt arasında 150 milisaniyelik depolarizan darbe uyaranı ile tetiklendi. H9C2 sıçan kardiyomiyositlerinin lKv'si, ilk önce eksi 20 milivolt civarında ortaya çıktı ve daha sonra genlik daha fazla depolarizasyon ile arttı. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, lKv genliği, 1.5 milimolar 4-AP ile beş dakikalık tedaviden sonra gözlenebilir şekilde azaldı.

Ek olarak, lKv, 24 saatlik AC tedavisinden sonra, membran potansiyellerinde doza bağlı bir şekilde 10 ila 60 milivolt arasında önemli ölçüde azalmıştır. İyon kanalını kaydettikten sonra bireysel hücre, tek hücreli genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik gibi daha fazla tek hücreli omik değerlendirmesi için kullanılabilir.