Name: İnsan Foliküllerinde Gen İfade Analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin, insan over foliküllerini enzimatik ve mekanik izolasyonla sağlam tutarak gen ifade analizleri için nasıl izole edeceğinizi. Bu yöntem, over hastalıkları ve toksik ajanlara maruz kalmayla ilgili gen ifade eksikliklerini anlamak için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma bir Bilim Mükemmelliği (EOS) hibesi (ID: 30443682) ile desteklenmiştir. I.D. Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique'de (FNRS) yardımcı araştırmacıdır.

Bu proje Erasme Hastanesi Etik Kurulu (Brüksel, Belçika) tarafından onaylanmıştır. Bu protokole dahil edilen hastaya 2000 yılında kemoterapiye maruz kalmadan önce fertilitenin korunması için yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu (OTC) uygulandı. Hasta, kalan dondurulmuş dokusunu depolama süresinin sonunda araştırmaya bağışlamak için bilgilendirilmiş yazılı onay imzaladı.
1. Kriyokorunmuş yumurtalık dokusunun çözülmesi
<ol><li>Beş çözme çözeltisi içeren 6 delikli bir plaka hazırlayın. İlk kuyu, Leibovitz-15 besiyeri, 0.1 mol / L sakaroz, 1.5 mol / L dimetil sülfoksit (DMSO) ve% 1 insan serum albümininden (HSA) oluşan 5 mL kriyoprotektan çözeltisi içerir. Bir sonraki kuyucuklar, azalan kriyoprotektan konsantrasyonlarına sahip 5 mL Leibovitz-15 ortamı içerir: 1 mol / L, 0.5 mol / L ve 2 x 0 mol / L DMSO. NOT: Kriyoprotektan çözeltisi, doğurganlık kliniğinde kullanılan protokole göre farklılık gösterebilir.</li>
	<li>Yumurtalık kortikal parçası içeren bir şişeyi güvenlik kurallarına (kriyojenik eldivenler, koruyucu gözlükler ve kapalı ayakkabılar) uygun olarak sıvı azottan çıkarın ve tüpü 30 sn boyunca oda sıcaklığında (RT) tutun.</li>
	<li>Flakonu dikey bir davlumbazın altında açmadan ve doğrudan 6 delikli plakanın ilk kuyucuğuna (buz üzerinde) aktarmadan önce şişeyi RT'de 2 dakika boyunca çift damıtılmış suya batırın.</li>
	<li>Parçayı art arda 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna aktarın, her biri 5 mL Leibovitz-15 ortamında azalan kriyoprotektan konsantrasyonları içerir. Her ortamdaki dokuyu 5 dakika boyunca (buz üzerinde) hafifçe çalkalayın.</li>
</ol>2. Folikül izolasyonu
NOT: Tüm deneyler RNase içermeyen malzemeler kullanılarak ve dikey bir başlık altında gerçekleştirilir.
<ol><li>Çözülmüş dokuyu 10 mL diseksiyon ortamı (Leibovitz-15 ortamı, sodyum piruvat [2 mmol / L], L-glutamin [2 mmol / L], HSA [% 0.3], penisilin G [30 μg / mL] ve streptomisin [50 μg / mL]) ile doldurulmuş 2 mm'lik ızgaralı bir Petri kabına aktarın. Gerekirse dokunun boyutunu bir neşterle ayarlayın. NOT: Klinik protokole bağlı olarak, dondurulmuş dokunun boyutu 8 mm x 4 mm x 1 mm ila 4 mm x 2 mm x 1 mm arasında değişebilir. Bu protokol için 4 mm x 2 mm x 1 mm'lik iki şerit kullanılmıştır.</li>
	<li>Doku dilimleyicinin üç parçasını yığın, parçayı iki blok arasına koyun ve parçayı bir bıçak kullanarak ikiye bölün, 0,5 mm kalınlığında iki parça elde etmek için bloklar arasında kaydırın.</li>
	<li>Parçayı kesmek ve daha küçük parçalar elde etmek için doku doğrayıcıyı kullanın. Gerekirse, doku tamamen parçalanana kadar kalan parçaları bir neşterle manuel olarak kesin.</li>
	<li>Parçalanmış dokuyu, % 0.2 kollajenaz ve% 0.02 DNaz ile desteklenmiş 7 mL sindirim ortamı (kültür ortamı [McCoy'un 5A ortamı, 3 mmol / L glutamin,% 0.1 HSA, 30 μg / mL penisilin G, 50 μg / mL streptomisin, 2.5 μg / mL transferrin, 4 ng / mL selenyum ve 50 μg / mL askorbik asit] ile doldurulmuş ızgaralı bir Petri kabına aktarın).</li>
	<li>Çanağı inkübatöre% 5 CO2 ve 37 ° C'de koyun. Her 10 dakikada bir, Petri kabını inkübatörden çıkarın ve 1 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu yıkayın.</li>
	<li>Sindirim ortamında 45 dakikalık inkübasyondan sonra, çanağı 5x-6.3x büyütme aralığına sahip bir stereomikroskop altına yerleştirin ve bir mikrokapiler pipet kullanarak folikülleri alın. İlgilendiğiniz folikülleri seçin ve bir ağız pipeti ile emerek izole edin. NOT: Ağız pipetlemesi, boruya malzeme kaybını ve kontaminasyonu önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.</li>
	<li>Foliküller bir korteks parçasında sıkışıp kalırsa, folikülleri stromadan serbest bırakmak için korteksi şırıngaların ucuyla sökerek iki 27 G şırınga ile mekanik olarak izole edin. NOT: Zarar görmemesi için foliküllere şırıngalarla dokunmayın.</li>
	<li>Folikülleri, mikrokapiler ile, 500 μL yağ kültürü (damla başına 1 ila 10 folikül) ile kaplanmış kalibre edilmiş kültür ortamının 15 μL'lik damlalarını içeren 4 delikli bir plakaya aktarın. Bu adım, toplama işlemi sırasında folikül canlılığını korur. İşlemin sonunda, folikülleri her seferinde 5 s boyunca iki kez durulayın, 500 μL yağ kültürü (buz üzerinde) ile kaplanmış iki damla 15 μL fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) halinde durulayın.</li>
	<li>Boş bir tüpte ağız pipetini (maksimum 10 μL) kullanarak minimum miktarda PBS ile 20 folikül toplayın ve tüpü buz üzerinde tutun. NOT: RNA kararlılığı için, adım 2.8 ve adım 2.9'u buz üzerinde gerçekleştirmek çok önemlidir. Standart RT-qPCR (SYBR Green) için yeterli RNA'ya sahip olmak için yaklaşık 20 folikül (<75 μm) gereklidir.</li>
	<li>Sindirim ortamında maksimum 90 dakikalık inkübasyondan sonra, Petri kabına% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş kültür ortamından oluşan fazla miktarda soğuk (4 ° C) bloke edici çözelti (7.5 mL) ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun. NOT: Bloke edici çözelti, deneyci plakaya yapışan folikülleri veya hasarlı folikülleri (asimetrik şekil veya daha koyu renkli foliküller) gözlemlediği anda eklenebilir. Foliküler hasarı önlemek ve izolasyondan hemen sonra RNA ekstraksiyonu yapmak için folikül izolasyonunun maksimum 2.5 saatlik bir süre içinde yapılması önerilir.</li>
</ol>3. RNA ekstraksiyonu
NOT: RNA ekstraksiyonu, bir RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen talimatları izleyerek, elüsyon hacimlerini uyarlayarak gerçekleştirilir.
<ol><li>RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen lizis çözeltisinin 100 μL'sini, folikülleri içeren tüpe kimyasal bir başlık altında ekleyerek izole edilmiş folikülleri askıya alın ve foliküllerin yapısını kırmak için yüksek hızda (2.500 rpm / dak) vorteks yapın. Tüpe 50 μL etanol (% 100) ekleyin ve kısa bir süre yüksek hızda vorteks yapın. NOT: Lizis tamponu 2-merkaptoetanol ve tiyosiyanik asit içerdiğinden, bu adım kimyasal bir başlık altında dikkatle gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Tüpün toplam hacmini (yaklaşık 160 μL) bir sütun ve bir toplama tüpünden oluşan bir mikrofiltre kartuşu tertibatına aktarın ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj edin. Kolonu, kit ile birlikte verilen 180 μL yıkama çözeltisi 1 ile yıkayın ve tüpü 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Kolona kit ile birlikte verilen 180 μL 2/3 yıkama çözeltisini ekleyin ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj yapın. Bu adımı iki kez gerçekleştirin. Filtreyi kurutmak için tüpü 1 dakika boyunca son bir kez santrifüj edin ve kartuşun altına yeni bir toplama tüpü yerleştirin.</li>
	<li>Nükleik asitlerin elüsyonunu iki adımda gerçekleştirin:<ol><li>İlk olarak, filtreye 8 μL ılık elüsyon çözeltisi (75 ° C) ekleyin, RT'de 1 dakika bekleyin ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 30 s santrifüj yapın.</li>
		<li>Bu adımı 7 μL elüsyon çözeltisi ile tekrarlayın. NOT: Salınan nükleik asitleri içeren tüp buz üzerinde tutulmalıdır. DNA kontaminasyonunu önlemek için, DNA yıkımının ek bir adımı şiddetle tavsiye edilir-adım 3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüpü 2 IU DNaz ve 1x DNaz tamponu ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. RT'de 2 dakika boyunca 1/10 DNaz inaktivasyon reaktifi ile enzimatik aktiviteyi bloke edin.</li>
	<li>Tüpü 4 °C'de 16.363 x g'de 1,5 dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, RNA'yı içeren süspansiyonu toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Bir spektrofotometre (NanoDrop 2000 yazılımı > Nükleik Asit > RNA) kullanarak numunede bulunan RNA miktarını değerlendirin. Boş olarak 1 μL elüsyon çözeltisi kullanın ve izole foliküllerden ekstrakte edilen RNA miktarını 1 μL çözelti ile ölçün.</li>
	<li>RNA saflığı için 260/280 oranını kontrol edin (yaklaşık 2.0). Numuneyi −80 °C'de saklayın veya RT-qPCR gerçekleştirmek için doğrudan geriye dönük olarak transkripte edin. NOT: RNA bütünlüğünü değerlendirmek için, numune -80 ° C'de donmadan önce veya sonra yüksek çözünürlüklü otomatik bir elektroforez sistemi ile işlenebilir. Bu çalışmada retrotranskripsiyonu takiben RT-qPCR aşağıdaki siklus ile uygulanmıştır: Sahneyi 50 °C'de 20 sn ve 95 °C'de 10 dakika ile tutun 95 °C'de 15 sn ve 60 °C'de 1 dakika ile 40 PCR döngüsü 95 °C'de 15 sn, 60 °C'de 1 dakika, 95 °C'de 30 s ve 60 °C'de 15 s ile erime eğrisi aşaması</li>
</ol>

<ol><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+follicular+development%3A+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+d%27Endocrinologie%22%5BJournal%5D)">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li>
<li>Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+human+ovarian+folliculogenesis+and+its+implications+in+assisted+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).</li>
<li>Rosewell, K. L., Curry, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ovarian+matrix+metalloproteinase+mRNAs+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization.</a> Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).</li>
<li>Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+localisation+of+c-kit+and+KITL+in+the+adult+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primordial+follicles+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue.</a> Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).</li>
<li>Bonnet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+sheep+granulosa+cells+and+oocytes+during+early+follicular+development+obtained+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection.</a> BMC Genomics. 12, 417(2011).</li>
<li>Chiti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+tailored+human+follicle+isolation+procedure+improves+follicle+recovery+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival.</a> Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).</li>
<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+follicle+isolation+methods+for+mouse+ovarian+follicle+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro.</a> Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+follicle+isolation+for+bioengineering+of+human+artificial+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary.</a> Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).</li>
<li>Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+isolation+methods+reveal+plasticity+of+granulosa+cell+steroidogenic+capacity+during+mouse+in+vitro+follicle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth.</a> Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).</li>
<li>McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+preantral+follicles+from+the+bovine+ovary+using+a+combination+of+fragmentation%2C+homogenization%2C+and+serial+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).</li>
<li>Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+%28IVG%29+of+human+ovarian+follicles+in+frozen+thawed+ovarian+cortex+tissue+culture+supplemented+with+follicular+fluid+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).</li>
<li>Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+experience+of+ovarian+tissue+cryopreservation+procedure%3A+Alternatives%2C+perspectives+and+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility.</a> Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).</li>
<li>Demeestere, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+function+and+spontaneous+pregnancy+after+combined+heterotopic+and+orthotopic+cryopreserved+ovarian+tissue+transplantation+in+a+patient+previously+treated+with+bone+marrow+transplantation%3A+Case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report.</a> Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).</li>
<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human%3A+A+model+from+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li>
<li>Grosbois, J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+PI3K+and+Hippo+signaling+pathways+during+in+vitro+human+follicle+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation.</a> Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).</li>
<li>Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+intercellular+contact-mediated+communication+in+cultured+human+early+stage+follicles+exposed+to+mTORC1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor.</a> Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+function+and+oocyte+retrieval+after+autologous+transplantation+of+ovarian+cortical+strips+to+the+forearm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.</a> Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).</li>
<li>Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+cryopreservation+versus+ovarian+tissue+cryopreservation+for+adult+female+oncofertility+patients%3A+A+cost-effectiveness+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).</li>
<li>Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+follicle+health+and+development+in+cultured+cryopreserved+ovarian+cortical+tissue%3A+A+study+of+ovarian+tissue+from+patients+undergoing+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility%22%5BJournal%5D)">Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation.</a> Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+A+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Rice, S., Ojha, K., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+biopsies+as+a+viable+source+of+pre-antral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles.</a> Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).</li>
<li>Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pre-antral+follicles+from+human+ovarian+medulla+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue.</a> Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).</li>
<li>Dong, F. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+research+on+the+isolation+methods+of+frozen-thawed+human+ovarian+preantral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).</li>
<li>Lierman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicles+of+various+maturation+stages+react+differently+to+enzymatic+isolation%3A+a+comparison+of+different+isolation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols.</a> Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+isolated+early+human+follicles+cultured+in+collagen+gels+for+24+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours.</a> Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+fully+and+partially+isolated+early+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Morphological study of fully and partially isolated early human follicles.</a> Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).</li>
<li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation+and+in+vitro+growth+of+preantral+and+small+antral+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles.</a> Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).</li>
<li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH%3A+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
</ol>

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Yumurtalık dokusunun kriyoprezervasyonu, kanser hastalarının fertilitesini korumak için umut verici bir yaklaşımdır. Klinikte, çözülmüş kortikal doku remisyon sonrası hastaya tekrar aşılanır ve yumurtalık fonksiyonunun ve doğurganlığın yeniden başlamasına izin verir19,20. Klinik kullanımın yanı sıra, folikülogenezi düzenleyen mekanizmaları incelemek için depolama süresinin sonunda araştırma için artık yumurtalık fragmanları da bağışlanabilir. Dahası, bu doku, <em...

Yumurtalık, korteks ve stroma içindeki foliküller de dahil olmak üzere fonksiyonel ve yapısal birimlerden oluşan karmaşık bir organdır. Folikülogenez, folikül aktivasyonu, büyümesi ve olgunlaşması süreci, ilkel sessiz bir durumdan döllenebilen ve erken embriyonik gelişimi destekleyen olgun bir foliküle kadar, araştırma1'de yaygın olarak incelenmiştir. Bu fenomeni yönlendiren mekanizmaların çözülmesi, kadınlar için doğurganlık bakımını iyileştirebilir2. Sabit insan dokusu üzerinde yapılan analizler, yumurtalığın fonksiyonel birimleri içinde protein ekspresyonunun ve gen lokalizasyonunun değerlendirilmesine izin verir 3,4. Bununla birlikte, yumurtalık folikülleri içindeki gen ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için folikülleri çevreleyen korteksten ayırmak için spesifik tekniklere ihtiyaç vardır. Bu nedenle, önceki bir çalışmada, gen ekspresyonunun doğrudan yumurtalık fonksiyonel biriminden analiz edilmesine izin vermek için bir folikül izolasyon tekniği geliştirilmiştir5. Enzimatik sindirim ve / veya mekanik izolasyonun yanı sıra lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi, bir doku parçası 6,7,8,9 içinde folikül izolasyonuna izin veren farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Folikül izolasyonu, gelişimin her aşamasında foliküllerin gen ekspresyon profillerini değerlendirmek için insan veya hayvan yumurtalık dokusu ile yaygın olarak kullanılmaktadır10,11,12. Bununla birlikte, optimal bir izolasyon prosedürü, folikülün yoğun korteks içindeki kırılgan yapısını dikkate almalı ve bu nedenle herhangi bir hasarı önlemek için dikkatle yapılmalıdır7. Bu makale, Woodruff'un laboratuvarı tarafından tanımlanan bir protokolden uyarlanmış, gen ekspresyon analizleri yapmak için insan foliküllerini dondurulmuş-çözülmüş yumurtalık korteksinden izole etmek için bir prosedürü açıklamaktadır13.
Dondurulmuş insan dokusundan yumurtalık folikülü izolasyonunun ilk adımı çözme işlemidir. Bu işlem, daha önce tarif edildiği gibi, kriyokorunmuş yumurtalık dokusunun greftlenmesi için kullanılan klinik protokole dayanarak gerçekleştirilir14,15. İşlem, ortamın azalan konsantrasyonlarında yumurtalık korteksi durulayarak kriyoprotektan ajanların uzaklaştırılmasını amaçlamaktadır. Daha sonra, folikülleri almak için enzimatik ve mekanik izolasyondan önce doku parçalanır. Farklı aşamalardaki foliküller, ilgilenenleri izole etmek için yüksek büyütmeli ve kaliteli optiklere sahip bir stereomikroskop kullanılarak ayırt edilebilir. İzole edilen her folikül, mikroskopa entegre edilmiş bir cetvel kullanılarak ölçülür ve foliküller gelişim aşamalarına göre toplanabilir: ilkel foliküller (30 μm), birincil foliküller (60 μm), ikincil foliküller (120-200 μm) ve antral foliküller (>200 μm)16. Foliküllerin morfolojisine göre daha ileri sınıflandırma yapılabilir: primordiyal foliküller bir kat düzleştirilmiş granüloza hücresine (GC) sahiptir, primer foliküller bir kat küboidal GC'ye sahiptir, ikincil foliküller en az iki kat küboidal GC'ye sahiptir ve GC'ler arasında bir boşluğun varlığı antral aşamayı karakterize eder. İlgilenilen foliküller seçildiğinde, RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilir. RNA miktarı ve kalitesi, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonundan (RT-qPCR) önce değerlendirilir (Şekil 1).

<table><tbody><tr><td>2 mm ızgaralı Petri kabı</td><td>Corning</td><td>430196</td> 2100 Biyoanaliz cihazı Agilent G2939BA <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Expert yazılımı</td><td>Agilent</td><td>sürüm B.02.08.SI648</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu plaka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>Carl Roth</td><td>&nbsp; EKX5.1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent toplam RNA 6000 pico kiti</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokılcal pipetler için aspiratör tüpü tertibatları</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-10kU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GoScript ters transkriptaz</td><td>Promega</td><td>A5003</td><td></td></tr><tr><td>HSA</td><td>CAF DCF&nbsp;</td><td>LC4403-41-080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>McCoy ' s 5A + bikarbonat + Hepes</td><td>LifeTechnologies</td><td>12330-031</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain doku doğrayıcı</td><td>Stoelting</td><td>51350</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokılcal RI EZ-İpuçları 200 ve mikro; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2200/1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokılcal RI EZ-İpuçları 75 & mikro; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2075/1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c işletim yazılımı</td><td>ThermoFisher</td><td>sürüm 1.6</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop spektrofotometre</td><td>ThermoFisher</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>PowerTrack SYBR yeşil ana karışım</td><td>ThermoFisher</td><td>A46109</td><td></td></tr><tr><td>Primerler: GDF9</td><td></td><td></td><td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td></tr><tr><td>Primerler: HPRT</td><td></td><td></td><td>F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACACAGAGGGCTACAA</td></tr><tr><td>Primerler: Kit Ligand</td><td></td><td></td><td>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı qPCR Quantstudio 3</td><td>ThermoFisher</td><td>A33779</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-micro toplam RNA izolasyon kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Selenyum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Serisi II&nbsp; su ceketli CO2&nbsp; inkübatörler</td><td>ThermoFisher</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Stadie-Riggs doku dilimleyici</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C10</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10652202001</tr></tbody></table>

İnsan foliküllerinde gen İfade analizleri

Gene Expression Analyses in Human Follicles

Yumurtalık, farklı hücre tiplerinden oluşan heterojen bir organdır. Folikülogenez sırasında meydana gelen moleküler mekanizmaları incelemek için, proteinlerin lokalizasyonu ve gen ekspresyonu sabit doku üzerinde gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bir insan folikülündeki gen ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için, bu karmaşık ve hassas yapı izole edilmelidir. Bu nedenle, Woodruff'un laboratuvarı tarafından daha önce tarif edilen uyarlanmış bir protokol, folikülleri (oosit ve granüloza hücreleri) çevrelerinden ayırmak için geliştirilmiştir. Yumurtalık kortikal dokusu ilk önce iki araç kullanılarak küçük parçalar elde etmek için manuel olarak işlenir: bir doku dilimleyici ve bir doku doğrayıcı. Doku daha sonra en az 40 dakika boyunca% 0.2 kollajenaz ve% 0.02 DNaz ile enzimatik olarak sindirilir. Bu çürütme adımı 37 °C ve %5 CO2'de gerçekleştirilir ve her 10 dakikada bir ortamın mekanik pipetlenmesi eşlik eder. İnkübasyondan sonra, izole edilmiş foliküller, mikroskop büyütme altında kalibre edilmiş bir mikrokapiller pipet kullanılarak manuel olarak toplanır. Doku parçalarında foliküller hala mevcutsa, prosedür manuel mikrodiseksiyon ile tamamlanır. Foliküller bir kültür ortamında buz üzerinde toplanır ve fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi damlacıkları içinde iki kez durulanır. Bu sindirim prosedürü, folikül bozulmasını önlemek için dikkatlice kontrol edilmelidir. Foliküllerin yapısı tehlikeye girer girmez veya maksimum 90 dakika sonra, reaksiyon% 10 fetal sığır serumu içeren 4 ° C'lik bir bloke edici çözelti ile durdurulur. Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) için RNA ekstraksiyonundan sonra yeterli miktarda toplam RNA elde etmek için en az 20 izole folikül (75 μm'nin altında boyutlu) toplanmalıdır. Ekstraksiyondan sonra, 20 folikülden toplam RNA'nın miktarının belirlenmesi ortalama 5 ng / μL'lik bir değere ulaşır. Toplam RNA daha sonra cDNA'ya retrokribe edilir ve ilgilenilen genler RT-qPCR kullanılarak daha fazla analiz edilir.

Bu izolasyon prosedürünü kullanarak, deneyci spesifik gen ekspresyon analizleri yapmak için stromal ortamdan folikülleri alabilir. Foliküllerin büyüklüğüne ve morfolojisine dayanarak, folikülogenezin farklı aşamalarını ayırt etmek mümkündür. Deneyci, uyarlanmış bir mikrokapiler pipet kullanarak ilgilendiği folikülleri boyutlarına göre seçebilir. Maksimum 75 μm'lik bir mikrokapiller kullanarak, primordial ve primer folikülleri ikincil, antral ve matür foliküllerden ayırmak mümkündür. Ayrıca, deneyci folikül morfolojisine ...

Burada, gen ekspresyon analizleri yapmak için insan yumurtalık foliküllerinin dondurulmuş-çözülmüş kortikal dokudan nasıl izole edileceğini özetleyen bir protokol açıklıyoruz.

İnsan Foliküllerinde Gen İfade Analizleri

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

Bu protokol, bu germ hücreleri üzerindeki gen ekspresyon analizlerini değerlendirmek için yumurtalık foliküllerini çevreleyen stroma hücrelerinden izole etmek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır. Kontrollü enzimatik ve mekanik izolasyonlar kullanan bu teknik, foliküllerin bütünlüğünü korurken geri alınmasına izin verir. Bu protokolü takiben, araştırmacı bu hücrelerden spesifik gen ifadelerini değerlendirebilir.Bu teknik, yumurtalık fonksiyonunu etkileyen hastalıklarla ilgili foliküllerde veya toksik ajanlara maruz kaldıktan sonra gen ekspresyonunun eksikliğini daha iyi anlamak için kullanılabilir. İlk kuyucuğa beş mililitre kriyoprotektan çözeltisi ve sonraki dört kuyucuğa azalan kriyoprotektan konsantrasyonları ile beş mililitre Leibovitz 15 ortamı ekleyerek altı kuyucuklu bir plaka hazırlamaya başlayın. Yumurtalık kortikal parçası içeren bir şişeyi güvenlik kurallarına uygun olarak sıvı azottan çıkarın.Oda sıcaklığında veya RT'de 30 saniye sonra, şişeyi iki dakika boyunca çift damıtılmış suya batırın. Dikey bir davlumbazın içinde, içeriği buz üzerine yerleştirilmiş altı delikli plakanın ilk kuyucuğuna aktarmadan önce yumurtalık kortikal parça şişesini hafifçe çalkalayın ve açın. Daha sonra, ilk kuyucuktaki yumurtalık kortikal fragmanını, beş mililitre Leibovitz 15 ortamında azalan kriyoprotektan konsantrasyonları içeren altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna art arda aktarın.Her ortamdaki dokuyu beş dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Folikül izolasyonu için, çözülmüş yumurtalık dokusunu 10 mililitre diseksiyon ortamı, mililitre penisilin G başına 30 mikrogram ve mililitre streptomisin başına 50 mikrogram ile doldurulmuş iki milimetrelik ızgaralı bir Petri kabına aktarın. Gerekirse doku boyutunu neşterle ayarlayın.Doku dilimleyicinin üç parçasını yığın ve yumurtalık parçasını iki blok arasına yerleştirin. 0,5 milimetre kalınlığında iki parça elde etmek için bloklar arasında kayarak bir bıçak kullanarak parçayı ikiye bölün. Daha küçük parçaları elde etmek için doku doğrayıcıyı kullanarak dokuyu kesin.Gerekirse, doku parçalanana kadar kalan parçaları neşterle manuel olarak kesin. Doku parçalandıktan sonra, parçalanmış dokuyu, kabı% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirmeden önce yedi mililitre sindirim ortamı ile doldurulmuş ızgaralı bir Petri kabına aktarın. Petri kabını inkübatörden her 10 dakikada bir alın.Sindirim ortamını bir mililitrelik pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu yıkayın. Sindirim ortamında 45 dakikalık inkübasyondan sonra, çanağı beş ila 6,3 kat büyütme aralığına sahip bir stereo mikroskop altına yerleştirin ve bir mikro kılcal pipet kullanarak folikülleri alın. İlgilendiğiniz folikülleri seçin ve bir ağız pipeti ile emerek izole edin.Foliküller bir korteks parçasında sıkışıp kalırsa, korteksi şırıngaların ucuyla sökerek ve folikülleri stromadan serbest bırakarak iki adet 27 gauge şırınga ile mekanik olarak izole edin. Mikro kılcal damarı kullanarak, izole edilmiş folikülleri, 500 mikrolitre yağ kültürü ile kaplanmış kalibre edilmiş kültür ortamının 15 mikrolitresini içeren dört kuyucuklu bir plakaya aktarın. Bir ila 10 folikül aktardıktan sonra, her biri beş saniye boyunca 500 mikrolitre yağ kültürü ile kaplanmış iki damla 15 mikrolitre PBS damlasında iki kez durulayın.Ağız pipetini kullanarak, boş bir tüpte minimum PBS ile 20 folikül toplayın ve tüpü buz üzerinde tutun. Sindirim ortamında 90 dakikalık inkübasyondan sonra, soğuk bloke edici bir çözelti ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun. Kimyasal kaputun altında, izole edilmiş folikülleri, RNA Ekstraksiyon Kiti ile birlikte verilen lizis çözeltisinin 100 mikrolitresinde askıya alın.Yapılarını kırmak için izole edilmiş folikülleri dakikada 2500 RPM'de vorteksleyin, ardından tüpe 50 mikrolitre% 100 etanol ekleyin. Ve kısaca tüpü yüksek hızda vorteks. Vortekslemeden sonra, tüpün toplam hacmini bir sütun ve bir toplama tüpünden oluşan bir mikro filtre kartuşu tertibatına aktarın.Ve tertibatı 16'da 10 saniye boyunca santrifüjleyin, dört santigrat derecede 363g. Tüpü 10 saniye boyunca santrifüj etmeden önce kolonu kit ile birlikte verilen 180 mikrolitre Yıkama Çözeltisi 1 ile yıkayın. Kolona 180 mikrolitre Yıkama Çözeltisi 2, 3'ün iki yıkamasını verdikten sonra, tüpü son bir kez santrifüj ederek filtreyi kurutun ve kartuşun altına yeni bir toplama tüpü yerleştirin.Nükleik asitlerin elüsyonunu gerçekleştirmek için, önce filtre tertibatına sekiz mikrolitre 75 santigrat derece Elüsyon Çözeltisi ekleyin. Bir dakika sonra, tertibatı 30 saniye boyunca santrifüj edin. Bu adımı yedi mikrolitre Elüsyon Çözeltisi ile tekrarlayın.Tamamlandığında, tüpe iki uluslararası birim DNaz ve DNaz tamponu ekleyin ve tüpü 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. Enzimatik aktiviteyi oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir x 10 DNaz inaktivasyon reaktifi ile bloke edin. Daha sonra, tüpü 16'da 1.5 dakika, dört santigrat derecede 363 g'da santrifüj edin ve RNA'yı içeren süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın.Bir spektrofotometre kullanarak, numunedeki RNA miktarını değerlendirin. İzole foliküllerden ekstrakte edilen bir mikrolitre Elüsyon Çözeltisini boş ve bir mikrolitre RNA çözeltisi olarak kullanın. RNA saflığı için 260/280 oranının 2.0 civarında olup olmadığını kontrol edin.Numuneyi eksi 80 santigrat derecede saklayın veya RT-qPCR gerçekleştirmek için doğrudan geriye doğru transkripte edin. Bu protokol kullanılarak, aynı hastadan 4x2x1 milimetrelik iki homojenize yumurtalık parçası, folikülleri izole etmek için işlendi. RNA nicelleştirmesi, toplam RNA'nın mikrolitresi başına 4.8 nanogramının, 1.89 saflık oranına sahip 75 mikrometreden küçük foliküllerden çıkarıldığını ortaya koymuştur.200 mikrometreden az folikülden, toplam RNA'nın mikrolitresi başına 10.5 nanogram, 1.74 saflık oranıyla ekstrakte edildi. RNA bütünlük numarası veya RIN değerleri, örneklerimizden RNA'nın kalitesini doğrulayan bir ve iki tüpte sırasıyla 7.1 ve 7.9 idi. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde standart bir döngü çalıştırdıktan sonra, elde edilen döngü eşikleri veya BT, HPRT için 30.87 ve 29.56, kit ligand için 33.5 ve 31.77 ve GDF9 için 30.71 ve 30.57 idi.Dokunun enzimatik sindirimi kritik bir noktadır. Deneyci, reaksiyon sırasında folikül bütünlüğünü sürekli olarak değerlendirmeli ve gerektiğinde durdurarak sağlamalıdır. Gen ekspresyon analizlerinin yanı sıra, izole foliküller, folikül in vitro kültür veya yapay yumurtalık gibi kanser hastalarının doğurganlığını korumak için deneysel sistemler geliştirmek için kullanılır.İzolasyon tekniği, çok sayıda sağlam folikülü almak için bir öğrenme eğrisi gerektiriyordu. Araştırmacılara, sindirimden önce dokunun iyi parçalandığından emin olmaları önerilir.

gene-expression-analyses-in-human-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol yenidoğan farelerde ve prepubertal farelerden alınan bireysel yumurtalık folikülleri gelen yumurtalıklarını kullanarak, fare yumurtalık dokusunun primer kültür / ko-kültür açıklar. kültür teknikleri yumurtalık üzerindeki dışsal ajanların etkisi soruşturma olanak veren yüksek fizyolojik bir şekilde gelişimini desteklemek ve yumurtalık foliküllerinin arasındaki etkileşimlerin.

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

Bu el yazması, at oositlerini morfolojik ve biyokimyasal olarak karakterize eden deneysel bir yaklaşımı anlatmaktadır. Özellikle mevcut çalışma, ultrason kılavuzluğundaki ovum toplama (OPU) ile olgunlaşmamış ve olgun ata oositlerinin nasıl toplanacağını ve kromozom ayrımını, iğ morfolojisini, küresel histone asetilasyonunu ve mRNA ekspresyonunu nasıl araştıracağını göstermektedir.

At Oositlerinde Kromozom Ayrımı, Histon Asetilasyonu ve İşmili Morfolojisi Analizi

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Burada, yumurtalık hücrelerinin antral foliküllerden tanımlanması ve saflaştırılması için protokoller sunuyoruz. Kortikal şeritlerin kriyoprezervasyonu için tüm yumurtalıkların işlenmesi için yöntemler üzerinde dururken, aynı zamanda granüloza, teka, endotelyal, hematopoetik ve stromal hücreler de dahil olmak üzere çoklu folikül yerleşik hücre tiplerini serbest bırakmak için enzimatik olarak muamele edilen bozulmamış antral folikülleri hasat ediyoruz.

İnsan Antral Foliküllerinden Soya Özgü Hücrelerin Ekstraksiyonu, Etiketlenmesi ve Saflaştırılması

Preantral folikülogenez çalışmasının ilerletilmesi, tek yumurtalıklardan folikül izolasyonu için etkili yöntemler gerektirir. Burada bir doku doğrayıcı ve homojenizatör kullanılarak sığır yumurtalıklarından folikül izolasyonu için modernize edilmiş, mekanik bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, tek bir yumurtalıktan çok sayıda canlı preantral folikülün toplanmasına izin verir.

Küçük Preantral Foliküllerin Sığır Yumurtalıktan Parçalanma, Homojenizasyon ve Seri Filtrasyon Kombinasyonu Kullanılarak İzolasyonu

Bu protokolde, çevirici ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemi ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, bir Cyp17a1-Cre fare hattına geçilen NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomunun ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için optimize edilmiştir.

Fare yumurtalık epigenomu ve transkriptomunun hücreye özgü eşleştirilmiş sorgulaması

Bu makale, sığır teka ve granüloza hücrelerinin bir ko-kültür modelini sunmaktadır. Bu yöntem, folikül içindeki somatik hücreler arasında parakrin iletişim ve substrat taşınması çalışmasına odaklanan analizler için güvenilir bir temel oluşturma potansiyeline sahiptir.

Sığır Yumurtalığındaki Granüloza-Teka Hücre Etkileşimlerini Anlamak için Modifiye Edilmiş Bir Ko-Kültür Sistemi

Bu protokol, foliküler sıvıyı, somatik hücreleri ve olgunlaşmamış oositleri IVF prosedürlerinden izole etmek ve işlemek için standartlaştırılmış yöntemleri özetlemekte ve yüksek kaliteli moleküler ve hücresel analizlere olanak sağlamaktadır. Bu yaklaşımlar, tipik olarak klinik bakımda atılan materyalleri kullanarak doğurganlık, üreme yaşlanması ve yumurtalık disfonksiyonuna ilişkin translasyonel araştırmaları destekler.

İn Vitro Fertilizasyon Uygulanan Bireylerden İnsan Foliküler Sıvısı, Folikül Somatik Hücreleri ve Olgunlaşmamış Oositlerin Toplanması

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Öğrenin, insan over foliküllerini enzimatik ve mekanik izolasyonla sağlam tutarak gen ifade analizleri için nasıl izole edeceğinizi. Bu yöntem, over hastalıkları ve toksik ajanlara maruz kalmayla ilgili gen ifade eksikliklerini anlamak için kullanılabilir.

İnsan Foliküllerinde Gen İfade Analizleri

Daha fazla video keşfet