Mikroakışkan Karıştırma ile Formüle Edilen mRNA-Lipid Nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo Etkinliğinin Test Edilmesi

Bu protokol, MRA'yı kapsülleyen tutarlı lipid nanopartiküllerini formüle etmek için kullanılabilir. Formülasyon parametreleri ayarlanabilir ve çeşitli lipid nanopartikülleri potens ve biyolojik dağılımları açısından değerlendirilebilir. Lipid nanopartikül formülasyonu ve in vitro ve in vivo testler için standartlaştırılmış bir protokol, birbirleriyle karşılaştırılabilen tutarlı lipid nanopartiküllerini formüle etmek için kullanılabilir.

Nanopartikül potansiyelini formüle ederken ve değerlendirirken akılda tutulması gereken birçok küçük ayrıntı vardır, ancak hangi ayrıntılar hesaba katılır? Formülasyonun hazırlanması zor olmamalıdır. Temiz, dört litrelik bir beheri 200 ila 300 mililitre taze 10X PBS ile doldurarak ve ultra saf suyla 1X'e seyrelterek başlayın.

PBS'nin son hacminin iki ila üç litre arasında olduğundan emin olun. Lipid nanopartikül veya LNP formülasyonu için uygun kapasiteye sahip diyaliz kasetlerini tarla kabına yerleştirin. mRNA seyreltmesi için 100 milimolar sitrik asit tamponu oluşturmak için ultra saf su kullanarak 10 milimolar sitrik asit tampon stoğunun on kat seyreltmesini yapın.

Daha sonra, her bir lipiti %100 etanol içinde çözerek C 12 200 iyonize edilebilir lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve lipid bağlantılı PEG veya lipid PEG stok çözeltileri yapın. Stok çözeltilerinin 37 santigrat derecede ısıtılıp karıştırılarak tamamen çözüldüğünden emin olun. Farklı lipit bileşenlerinin hesaplanan hacimlerini konik bir tüpte birleştirin.

Lipitleri% 100 etanol ile, LNP'nin nihai hacminin% 25'ini temsil eden son V hacmine seyreltin. İyonlaşabilir lipid/mRNA ağırlık oranına ve toplam mRNA-LNP hacmine dayalı olarak formülasyon için gereken mRNA miktarını hesaplayın. Ardından, mRNA'yı kodlayan ateşböceği lusiferazı buz üzerinde çözün.

Daha sonra mRNA'yı 10 milimolar sitrik asit tamponu kullanarak organik fazın üç katı nihai hacme seyreltin. RNA'lar ve DNA için bir yüzey dekontamine ile hassas bir görev mendili püskürtün ve mikroakışkan aletin içini iyice silin. Ardından, yeni bir mikroakışkan kartuş açın ve giriş kanalları aşağı ve uzağa bakacak şekilde yerleştirin.

Kapakları kapalı olarak tutucuya iki adet steril 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin. Bittiğinde, beş mililitrelik bir şırıngayı 10 milimolar sitrik asit tamponunda seyreltilmiş mRNA içeren mRNA çözeltisiyle doldurun. Daha sonra üç mililitrelik bir şırıngayı% 100 etanol içinde seyreltilmiş lipitleri içeren lipit çözeltisi ile doldurun.

Şırıngalardaki havayı çıkardığınızdan emin olun. Daha sonra iğne olmadan, mRNA çözeltisini içeren beş mililitrelik şırıngayı kartuşun sol girişine yerleştirin ve lipit çözeltisini içeren üç mililitrelik şırıngayı kartuşun sağ girişine yerleştirin. Mikroakışkan enstrümanı açın ve hızlı çalıştırmayı seçin.

Takılan beş ve üç mililitrelik şırıngalar için doğru şırınga tiplerini seçtikten sonra, mRNA-LNP'leri formüle etmek için başlat düğmesine basmadan önce LNP formülasyonu parametrelerini üçe bir sulu / organik akış hızı oranında girin. Sağ konik tüpte toplanan mRNA-LNP'leri, kaset zarını delmeden veya dokunmadan bir şırınga kullanarak önceden hidratlanmış diyaliz kasetlerine yükleyin, mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini PBS içeren behere geri yerleştirin ve en az iki saat diyalize bırakın. Diyalizden sonra, mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini steril bir biyogüvenlik kabinine getirin ve mRNA-LNP'leri iğneli bir şırınga kullanarak çıkarın.

mRNA-LNP'leri 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak steril filtreleyin ve steril bir konik tüpte toplayın. Daha sonra karakterizasyon için 65 mikrolitre mRNA-LNP çözeltisini 1.5 mililitrelik bir mikrotüpe yerleştirin. Beyaz bir duvarda plaka 5.000 HepG2 hücresi, berrak taban, 100 mikrolitre tam hücre kültürü ortamında 96 oyuklu plaka ve hücreleri% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecede kontrollü bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin.

Hücrelerin mRNA-LNP'lerle işlenmesinden önce, tüm ortamı kuyulardan çıkarın. Daha sonra, hücrelere istenen dozlarda tam hücre kültürü ortamında seyreltilmiş 100 mikrolitre mRNA-LNP veya 24 saatlik bir inkübasyondan önce 100 mikrolitre tam ortam ile muamele edin. İnkübasyondan sonra, hücre kültürü ortamını 96 oyuklu plakadan çıkarın, her oyuğa 20 mikrolitre lizis tamponu ve ardından 100 mikrolitre lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin.

Plakayı ışıktan koruyun ve biyolüminesan sinyalini ölçmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin. mRNA-LNP çözeltisini steril PBS kullanarak seyreltin, böylece kuyruk damarı enjeksiyon hacminin 100 mikrolitresinde iki mikrogram toplam mRNA bulunur. 29 gauge insülin şırıngasını 100 mikrolitre mRNA-LNP veya 100 mikrolitre PBS ile doldurun ve şırıngadaki kabarcıkları çıkarın.

İğneyi, eğimi yukarı bakacak şekilde farenin yan kuyruk damarına sokun ve 100 mikrolitre mRNA-LNP veya PBS'yi yavaşça enjekte edin. Enjeksiyondan altı saat sonra, steril PBS'de mililitre başına 15 miligramlık bir D-Luciferin potasyum tuzu çözeltisi hazırlayın. In vivo görüntüleme sistemi veya IVIS için görüntüleme yazılımında, cihazı veri toplamaya hazırlamak için başlat düğmesine basmadan önce lüminesansın yanındaki kutuyu seçin.

Daha sonra, daha önce tedavi edilen farelere intraperitoneal olarak 200 mikrolitre D-Luciferin uygulayın ve fareleri uyuşturmadan önce lusiferaz sinyali stabilize olana kadar 10 dakika bekleyin. Anestezi uygulanmış fareleri in vivo görüntüleme sisteminin içindeki burun konilerine aktarın ve oda kapısını kapatmadan önce karınları açıkta kalacak şekilde sırt üstü olduklarından emin olun. Görüntüleme yazılımında, doğru görüş alanının seçildiğinden emin olun ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın, biyolüminesans görüntüleri elde etmek için yazılımdaki al düğmesine tıklayın.

mRNA-LNP'lerin kapsülleme etkinliği, burada gösterilen modifiye floresan testi ve denklemi kullanılarak %92.3 olarak belirlendi. 5.000 HepG2 hücresinin artan dozlarda mRNA-LNP ile tedavisi üzerine artan biyolüminesans gözlenmiştir. Lusiferaz ekspresyonu, bu çalışmanın kuyu başına en düşük beş nanogram dozunda kolayca tespit edildi.

Formüle edilmiş LNP'lerle tedavi edilen farelerin üst karnında güçlü bir biyolüminesans sinyali gözlendi. Toplam ışıldayan akıyı hesaplamak için karaciğer sinyallerinin etrafına ilgi bölgeleri çizildi. Toplam ışıldayan akı yaklaşık beş kez 10 üzeri 9 idi.

LNP'leri formüle ederken her zaman iyonlaşabilir lipid / nükleik asit ağırlık oranını koruyun. Organik fazın her hacmi, sulu fazın üç hacminde mRNA'ya karşılık gelen iyonlaşabilir lipid içermelidir.