Name: Mikroakışkan Karıştırma ile Formüle Edilen mRNA-Lipid Nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo Etkinliğinin Test Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan karıştırma ile mRNA-lipid nanopartikül formülasyonunu ve HepG2 hücreleri ile C57BL/6 farelerinde in vitro ve in vivo etkinlik testlerini. Bu yöntem, gen tedavisi araştırmalarında tekrarlanabilir nanopartikül geliştirme için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.J.M., ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü'nden (DP2 TR002776), Scientific Interface'de (CASI) Burroughs Wellcome Fund Kariyer Ödülü'nden, ABD Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödülünden (CBET-2145491) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 ve NIDDK R01 DK123049) ek fon sağladığını kabul eder.

NOT: Yüzeyleri ve ekipmanı RNazlar ve DNA için bir yüzey dekontaminantı ile silerek mRNA-LNP'leri formüle ederken her zaman RNaz içermeyen koşulları koruyun. Yalnızca RNaz içermeyen uçlar ve reaktifler kullanın.
Tüm hayvan prosedürleri, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna ve Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Ön formülasyon hazırlığı
<ol><li>Temiz bir 4 L'lik kabı 200-300 mL taze 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun.<ol><li>1x PBS'lik bir beher elde etmek için beherdeki 10x PBS'yi ultra saf suyla 10 kat seyreltin. 1x PBS'nin son hacminin 2-3 L arasında olduğundan emin olun.</li>
		<li>LNP formülasyonu için uygun kapasiteye sahip diyaliz kasetlerini (20 kDa moleküler ağırlık kesme [MWCO]) nemlendirmek için doldurulmuş behere yerleştirin. NOT: Diyaliz kasetleri kullanılmadan önce nemlendirilmesi için en az 2 dakika gerektirir.</li>
		<li>Behere bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve kabı alüminyum folyo ile örtün.</li>
		<li>Kapalı kabı manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Karıştırma plakasını açın ve 300-400 rpm'de dönmeye ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA seyreltmesi için kullanılan 10 mM sitrik asit tamponunu oluşturmak için 100 mM sitrik asit tampon stoğunu (pH 3) ultra saf suyla 10 kat seyreltin.</li>
	<li>Her bir lipidi %100 etanol içinde çözerek C12-200 iyonize olabilen lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve lipid bağlantılı PEG (lipid-PEG) stok çözeltileri yapın. Lipid bileşenlerinin konsantrasyonları Tablo 1'de detaylandırılmıştır.<ol><li>Tamamen çözündüklerinden emin olmak için stok çözeltilerini 37 °C'de ısıtın ve karıştırın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lipid ve nükleik asit karışımlarının hazırlanması
<ol><li>İstenen molar orana ve iyonlaşabilir lipid/mRNA ağırlık oranına göre gerekli iyonlaşabilir lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve lipit-PEG hacimlerini hesaplayın (Tablo 1). Formülasyon sırasında şırıngalardaki ölü hacmi hesaba katmak için organik fazın %10 ekstra hacmini hazırlayın.<ol><li>Farklı lipit bileşenlerinin hesaplanan hacimlerini konik bir tüpte birleştirin.</li>
		<li>Lipitleri% 100 etanol ile, LNP'nin nihai hacminin% 25'ini temsil eden son hacim V'ye seyreltin.</li>
	</ol></li>
	<li>İyonlaşabilir lipid/mRNA ağırlık oranına ve gereken toplam mRNA-LNP hacmine dayalı olarak formülasyon için gereken mRNA miktarını hesaplayın (Tablo 1).<ol><li>Ateşböceği lusiferaz kodlayan mRNA'yı buz üzerinde çözün.</li>
		<li>mRNA'yı, 10 mM sitrik asit tamponunda organik fazın hacminin üç katı olan 3V'luk son hacme seyreltin. NOT: Her lipid hacmi, V, 3 V'ta seyreltilmiş mRNA için yeterli iyonize edilebilir lipid içermelidir. Bu, istenen iyonlaşabilir lipid / mRNA ağırlık oranına karşılık gelir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. mRNA-LNP'lerin mikroakışkan formülasyonu
<ol><li>RNazlar ve DNA için bir yüzey dekontaminantı ile hassas bir görev mendili püskürtün ve mikroakışkan aletin içini iyice silin.<ol><li>Yeni bir mikroakışkan kartuş açın ve giriş kanalları aşağı ve uzağa bakacak şekilde yerleştirin.</li>
		<li>Konik boru kolunun iki adet 15 mL konik boru tuttuğundan ve en sağa doğru konumda olduğundan emin olun.</li>
		<li>Tutucu üzerinde kapaklar kapalıyken iki adet steril 15 mL konik tüp yapılandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>5 mL'lik bir şırıngayı, 10 mM sitrik asit tamponunda seyreltilmiş mRNA içeren mRNA çözeltisiyle doldurun.<ol><li>3 mL'lik bir şırıngayı, saf% 100 etanol içinde seyreltilmiş lipitleri içeren lipit çözeltisiyle doldurun.</li>
		<li>Mikroakışkan cihazdaki kartuş tutucuyu yukarı çevirin.</li>
		<li>mRNA içeren 5 mL'lik şırıngayı iğnesiz olarak kartuşun sol girişine yerleştirin.</li>
		<li>Lipid içeren 3 mL'lik şırıngayı iğnesiz olarak kartuşun sağ girişine yerleştirin.</li>
		<li>Kartuş tutucuyu tekrar aşağı çevirin ve mikroakışkan aletin kapağını kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Cihazın arkasında bulunan anahtarı kullanarak mikroakışkan aleti açın.<ol><li>Hızlı Çalıştır'ı seçin.</li>
		<li>Takılan 5 mL ve 3 mL şırıngalar için doğru şırınga tiplerini seçin.</li>
		<li>mRNA-LNP formülasyonu için parametreleri Tablo 2'de açıklandığı gibi 3:1 sulu/organik akış hızı oranında girin.</li>
		<li>Bir sonraki ekrana gitmek için İleri düğmesine basın.</li>
		<li>Doğru parametrelerin girildiğini onaylayın.</li>
		<li>mRNA-LNP'leri formüle etmek için Başlat düğmesine basın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. mRNA-LNP'lerin formülasyon sonrası işlenmesi ve karakterizasyonu
<ol><li>Sağ konik tüpte toplanan mRNA-LNP'leri önceden hidratlanmış diyaliz kasetlerine yükleyin. NOT: mRNA-LNP'leri yüklerken kasetin zarını delmeyin veya zarar vermeyin. Membran hasar görürse, yükleme sırasında mRNA-LNP'ler kaybolacaktır.<ol><li>mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini 1x PBS içeren behere geri yerleştirin ve en az 2 saat diyalize bırakın.</li>
		<li>Diyalizden sonra, mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini steril bir biyogüvenlik kabinine getirin ve iğneli bir şırınga kullanarak mRNA-LNP'leri çıkarın.</li>
		<li>0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak mRNA-LNP'leri steril olarak filtreleyin ve steril bir konik tüpte toplayın.</li>
		<li>Karakterizasyon amacıyla 65 μL mRNA-LNP çözeltisini 1.5 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Dinamik ışık saçılımı kullanarak hidrodinamik boyut ve polidispersite indeksinin ölçümü için bir küvette 10 μL mRNA-LNP'yi 990 μL 1x PBS'de 1:100 oranında seyreltin.</li>
	<li>Bir floresan testi (yani RiboGreen) kullanarak mRNA-LNP'lerin konsantrasyonunu ve kapsülleme verimliliğini değerlendirin.<ol><li>20x TE tamponunu moleküler biyoloji suyu ile seyrelterek 1x TE tamponundan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Triton X-100'ü 1x TE tamponu ile seyrelterek% 1 Triton X-100 tamponundan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Reaktif stoğunu 1:200 oranında 1x TE tamponu ile seyrelterek floresan reaktifi hazırlayın.</li>
		<li>mRNA-LNP'leri 100x TE tamponunda 1:100 ve siyah duvarlı siyah tabanlı 96 oyuklu bir plakada 100 μL'de %1 Triton X-100 tamponu seyreltin.</li>
		<li>RNA standardını üreticinin talimatlarına göre seyrelterek düşük aralıklı bir standart eğri hazırlayın ve standart eğriyi 96 oyuklu plakada plakalayın.</li>
		<li>Seyreltilmiş mRNA-LNP veya seyreltilmiş standart içeren her bir oyuğa 100 μL seyreltilmiş floresan reaktif ekleyin.</li>
		<li>96 oyuklu plakayı bir plaka okuyucunun içine yerleştirin ve 1 dakika çalkalayın, ardından 4 dakika bekleyin.</li>
		<li>Her bir kuyucuğun floresan yoğunluğunu, üreticinin protokolüne göre 480 nm/520 nm'lik bir uyarma/emisyonda ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan değerlerini konsantrasyonlara dönüştürmek için standart eğriyi kullanın.<ol><li>LNP'lerin TE tamponunda (kapsüllenmemiş mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değeri, LNP'lerin %1 Triton X-100'de (toplam mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değerden çıkararak ve LNP'lerin %1 Triton X-100'de seyreltilmesinden elde edilen değere bölerek kapsülleme verimliliğini hesaplayın, denklem 4.4'e göre.</li>
		<li>Hücre ve hayvan çalışmaları için kullanılan mRNA-LNP konsantrasyonunu, TE tamponunda (kapsüllenmemiş mRNA) LNP'lerin seyreltilmesinden elde edilen değeri, LNP'lerin %1 Triton X-100'de (toplam mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değerden çıkararak hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>6-(p-toluidino)-2-naftalinsülfonil klorür (TNS) testi yaparak mRNA-LNP'lerinpKA'sını ölçün.<ol><li>Ultra saf suda 0.16 mM'lik bir TNS çözeltisi oluşturarak TNS reaktifini hazırlayın. NOT: Reaktifi kullanırken, bozulmayı önlemek için buz üzerinde ve ışıktan uzak tuttuğunuzdan emin olun.</li>
		<li>0,5'lik artışlarla 2 ila 12 arasında değişen farklı pH değerlerine ayarlanmış 150 mM sodyum klorür, 20 mM sodyum fosfat, 25 mM amonyum sitrat ve 20 mM amonyum asetat tamponlu çözeltiler hazırlayın.</li>
		<li>Siyah duvarlı siyah tabanlı 96 oyuklu bir plakada her bir pH ayarlı tampon çözeltisine 2,5 μL LNP ekleyin.</li>
		<li>Nihai TNS konsantrasyonu 6 μM olacak şekilde her bir oyuğa TNS reaktifi ekleyin.</li>
		<li>96 oyuklu plakayı karanlık bir yerde 5 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Bir floresan plaka okuyucu kullanarak 322 nm/431 nm'lik bir uyarma/emisyonda floresansı ölçün.</li>
		<li>Verileri sigmoidal bir eğriye sığdırın ve maksimum yoğunluğun %50'sinin gözlemlendiğipH'ı bulmak için uygun denklemi kullanarak p K a'yı hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA-LNP hidrodinamik boyutu, PDI, kapsülleme verimliliği ve pKa için temsili sonuçlar Tablo 3'te gösterilmektedir.</li>
</ol>5. HepG2 hücrelerinin in vitro transfeksiyonu
NOT: HeLa hücreleri veya HEK-293T hücreleri gibi çeşitli diğer hücre hatları, LNP'lerin transfeksiyon verimliliğini in vitro olarak değerlendirmek için kullanılabilir. LNP transfeksiyon çalışmalarından önce tüm hücreler mikoplazma için negatif test yapmalıdır.
<ol><li>Plaka: 100 μL tam hücre kültürü ortamında beyaz duvarlı şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 5.000 HepG2 hücresi (DMEM% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir)<ol><li>Hücreleri, 37 ° C ve% 5 CO 2'de kontrollü bir CO2 inkübatörde gece boyunca yapışmaya bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA-LNP'leri tam hücre kültürü ortamında seyreltin, böylece toplam doz 100 μL olarak verilir.<ol><li>Tüm ortamı kuyulardan çıkarın.</li>
		<li>Hücreleri, istenen dozlarda tam hücre kültürü ortamında seyreltilmiş mRNA-LNP'ler veya tam ortam (kontrol) ile tedavi edin.</li>
		<li>Tedavi edilen hücreleri içeren 96 oyuklu plakayı 24 saat boyunca kontrollü CO2 inkübatörüne geri yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir lusiferaz testi yaparak transfeksiyon verimliliğini değerlendirin.<ol><li>Lusiferaz reaktifini ve 1x hücre lizis tamponunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.</li>
		<li>Hücreleri içeren 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve bir biyogüvenlik kabinine getirin.</li>
		<li>Hücre kültürü ortamını 96 oyuklu plakanın her oyuğundan çıkarın.</li>
		<li>Her bir oyuğa 20 μL 1x lizis tamponu ve ardından önceden hazırlanmış 100 μL lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin.</li>
		<li>Plakayı ışıktan koruyun ve her bir kuyucuğun biyolüminesan sinyalini ölçmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin. NOT: HepG2 hücrelerinin önceden formüle edilmiş C12-200 mRNA-LNP'ler ile tedavisini gösteren temsili sonuçlar Şekil 1'de gösterilmektedir.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Kuyruk damarı enjeksiyonunu takiben farelerde mRNA-LNP'lerin in vivo değerlendirmesi
<ol><li>mRNA-LNP çözeltisini steril 1x PBS ile seyreltin, böylece 20 g'lık bir fare için yaklaşık 0,1 mg/kg'lık bir vücut ağırlığı dozuna karşılık gelen 100 μL'lik bir kuyruk damarı enjeksiyon hacminde 2 μg toplam mRNA bulunur.</li>
	<li>Her fareyi onaylanmış bir yöntem kullanarak kısıtlayın ve kuyruğu% 70 alkolle nemlendirilmiş bir bezle silin.<ol><li>29 G'lik bir insülin şırıngasını 100 μL mRNA-LNP (2 μg) veya 100 μL 1x PBS ile doldurun. Şırıngadaki kabarcıkları çıkarın.</li>
		<li>İğneyi, eğimi yukarı bakacak şekilde farenin yan kuyruk damarına sokun ve 100 μL mRNA-LNP veya 1x PBS'yi yavaşça enjekte edin.</li>
		<li>İğneyi çıkarın ve hemostaz elde edilene kadar basınç uygulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Enjeksiyondan 6 saat sonra steril 1x PBS'de 15 mg / mL d-lusiferin potasyum tuzu stok çözeltisi hazırlayın.<ol><li>In vivo görüntüleme sistemini (IVIS) açın ve görüntüleme yazılımını açın.</li>
		<li>Enstrümanı veri toplamaya hazırlamak için Başlat'a basın.</li>
		<li>Lüminesans'ın yanındaki kutuyu işaretleyin ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın. Görüntülenen fare sayısı için doğru görüş alanının seçildiğinden emin olun.</li>
		<li>Daha önce tedavi edilen farelere intraperitoneal olarak 200 μL d-lusiferin (vücut ağırlığının kg'ı başına 150 mg lusiferin) uygulayın.</li>
		<li>Fareleri %2,5 izofluran ve 2,0 L/dk oksijen akış hızına ayarlanmış bir anestezi odasına yerleştirin.</li>
		<li>mRNA-LNP ile tedavi edilen fareleri görüntülemeden önce lusiferaz sinyalinin stabilize olması için 10 dakika bekleyin.</li>
		<li>Farelerin tamamen uyuşturulduğundan emin olun ve görüntüleme odasının içindeki burun konileri yoluyla izofluran uygulamak için anestezi hattını yönlendirin.</li>
		<li>Fareleri burun konilerine aktarın ve karınları açıkta kalacak şekilde sırt üstü olduklarından emin olun.</li>
		<li>Oda kapısını kapatın ve biyolüminesans görüntüleri elde etmek için yazılımdaki Al düğmesine tıklayın. NOT: mRNA-LNP veya 1X PBS tedavisini takiben fare tüm vücut görüntülemesi için temsili sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+organ+targeting+%28SORT%29+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li>
<li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509(2018).</li>
<li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+of+patisiran%2C+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li>
<li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li>
<li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li>
<li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery%3A+Applications+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li>
<li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li>
<li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li>
<li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118(2021).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li>
<li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111(2021).</li>
<li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983(2020).</li>
<li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li>
<li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+%28LNPs%29+designed+for+oligonucleotide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).</li>
<li>Granot, Y., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+the+right+message%3A+Challenges+and+opportunities+in+lipid+nanoparticles-mediated+modified+mRNA+therapeutics-An+innate+immune+system+standpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint.</a> Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+containing+constrained+phospholipids+deliver+mRNA+to+liver+immune+cells+in+vivo+without+targeting+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161(2020).</li>
<li>Patel, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li>
<li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li>
<li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-like+materials+for+low-dose%2C+in+vivo+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li>
<li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li>
<li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li>
<li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li>
<li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li>
<li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279(2013).</li>
<li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li>
<li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li>
<li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+administration+of+CRISPR%2FCas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li>
<li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308(2018).</li>
<li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li>
<li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493(2018).</li>
<li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095(2022).</li>
<li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li>
<li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li>
<li>Tombácz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CD4%2B+T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4%2B+cell-homing+mRNA-LNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano%22%5BJournal%5D)">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li>
<li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li>
</ol>

Beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu iş akışıyla, çeşitli mRNA-LNP'ler in vitro ve in vivo verimlilikleri için formüle edilebilir ve test edilebilir. İyonlaşabilir lipitler ve eksipiyanlar, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip mRNA-LNP'ler üretmek için farklı molar oranlarda ve farklı iyonlaşabilir lipid / mRNA ağırlık oranlarında değiştirilebilir ve birleştirilebilir22. Burada, molar oranı 35/16/46.5/2.5 (iyonlaşabilir lipid: yardımcı lipid: kolesterol: lipid-PEG) olan C12-200 mRNA-LNP'leri 10:1 iyonize edile...

Lipid nanopartikülleri (LNP'ler) son yıllarda viral olmayan gen terapisi alanında büyük umut vaat etmektedir. 2018'de Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), kalıtsal transtirenin amiloidozu 1,2,3,4'ün tedavisi için ilk RNA interferansı (RNAi) terapötik olan Onpattro by Alnylam'ı onayladı. Bu, lipid nanopartikülleri ve RNA bazlı tedaviler için ileriye doğru atılmış önemli bir adımdı. Daha yakın zamanlarda, Moderna ve Pfizer/BioNTech, SARS-CoV-2 4,5'e karşı mRNA-LNP aşıları için FDA onayları aldı. Bu LNP bazlı nükleik asit tedavilerinin her birinde, LNP, kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı korumaya ve güçlü hücre içi iletimi kolaylaştırmaya hizmet eder 6,7. LNP'ler RNAi tedavilerinde ve aşı uygulamalarında başarı elde ederken, mRNA-LNP'ler ayrıca protein replasman tedavilerinde8 kullanım için ve ayrıca Cas9 mRNA'nın birlikte verilmesi ve gen düzenleme için CRISPR-Cas9 sisteminin verilmesi için RNA'yı yönlendirmek için araştırılmıştır9. Bununla birlikte, tüm uygulamalar için uygun olan tek bir spesifik formülasyon yoktur ve LNP formülasyon parametrelerindeki ince değişiklikler, in vivo 8,10,11 gücünü ve biyolojik dağılımı büyük ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, her LNP bazlı tedavi için optimal formülasyonu belirlemek için bireysel mRNA-LNP'ler geliştirilmeli ve değerlendirilmelidir.
LNP'ler genellikle dört lipid bileşeni ile formüle edilir: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen-glikol (PEG) konjugatı (lipit-PEG)11,12,13. LNP'ler tarafından kolaylaştırılan güçlü hücre içi iletim, kısmen iyonlaşabilir lipid bileşeni12'ye dayanır. Bu bileşen fizyolojik pH'ta nötrdür, ancak endozom11'in asidik ortamında pozitif yüklü hale gelir. İyonik yükteki bu değişikliğin endozomal kaçışa önemli bir katkıda bulunduğu düşünülmektedir12,14,15. İyonize olabilen lipide ek olarak, fosfolipid (yardımcı lipid) bileşeni, yükün kapsüllenmesini iyileştirir ve endozomal kaçışa yardımcı olur, kolesterol stabilite sağlar ve membran füzyonunu arttırır ve lipid-PEG, dolaşımda LNP agregasyonunu ve opsonizasyonu en aza indirir10,11,14,16. LNP'yi formüle etmek için, bu lipit bileşenleri organik bir fazda, tipik olarak etanolde birleştirilir ve nükleik asit kargosunu içeren sulu bir faz ile karıştırılır. LNP formülasyon işlemi, çok sayıda fizikokimyasal özelliğe sahip birçok LNP formülasyonunu formüle etmek için farklı bileşenlerin kolayca ikame edilmesine ve farklı molar oranlarda birleştirilmesine izin vermesi bakımından çok yönlüdür10,17. Bununla birlikte, bu çok çeşitli LNP'leri keşfederken, karakterizasyon ve performanstaki farklılıkları doğru bir şekilde ölçmek için her formülasyonun standart bir prosedür kullanılarak değerlendirilmesi çok önemlidir.
Burada, mRNA-LNP'lerin formülasyonu ve hücrelerde ve hayvanlarda performanslarının değerlendirilmesi için eksiksiz iş akışı özetlenmiştir.

<table><tbody><tr><td>0.1 M Hidroklorik Asit</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m Şırınga Filtreleri</td><td>Genesee</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 mL BD Kayma Uçlu Şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi (polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu) (C14-PEG2000)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>880150P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850725P</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik Tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>200 kanıt Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>23G İğneler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-6C</td><td></td></tr><tr><td>3 mL BD Luer-Lok uçlu Tek Kullanımlık Şırıngalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Diyaliz Kasetler</td><td>Thermo Scientific</td><td>A52976</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyu Siyah Duvar Siyah Alt Plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-135</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyu Beyaz/Şeffaf Alt Plaka, TC Yüzey</td><td>Thermo Scientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Asetat, 1 Kilogram</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>&nbsp; 631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Sitrat dibazik</td><td>SIgma</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Şırınga steril, tek kullanımlık, 5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>C12-200 İyonize Edilebilir Lipid</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>36699</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 Fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7202</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık küvetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955129</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potasyum Tuzu</td><td>Thermo Scientific</td><td>L2916</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Exel İnsülin Şırıngaları - 0,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1484132</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hep G2 [HEPG2]</td> <td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyPure Moleküler Biyoloji Sınıf Su</td><td>Cytiva</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>Sonsuz 200 PRO Plaka Okuyucu</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spektrumu In Vivo Görüntüleme Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-11D</td><td></td></tr><tr><td>Lusiferaz Test Kiti</td><td>Promega</td><td>E4550</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Ateşleme Kartuşları - Klasik - 100'lü Paket</td><td>Hassas Nanosistemler</td><td>NIN0065</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Ateşleme Cihazı</td><td>Hassas Nanosistemler</td><td>NIN0001</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Fosfat Tamponlu Salin (10x) pH 7.4, RNaz içermeyen</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>QB Sitrat Tamponu, (Sitrat 100 mM) pH 3.0</td><td>Teknova</td><td>Q2442</td><td></td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen RNA Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Reporter Lysis 5x Tampon</td><td>Promega</td><td>E3971</td><td></td></tr><tr><td>RNase Uzak Yüzey Dekontaminant</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat</td><td>Sigma</td><td>7601-54-9</td><td></td></tr><tr><td>TNS reaktifi (6- (p-Toluidino) -2-naftalinsülfonik asit sodyum tuzu)</td> <td>Sigma</td><td>T9792</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Panalitik</td><td>NanoZS</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroakışkan karıştırma ile formüle edilen mrna-lipid nanopartiküllerin in vitro ve in vivo etkinliğinin test edilmesi

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Lipid nanopartikülleri (LNP'ler), Moderna ve Pfizer/BioNTech tarafından COVID-19 mRNA aşılarının başarılı bir şekilde geliştirilmesiyle son zamanlarda büyük ilgi görmüştür. Bu aşılar, mRNA-LNP terapötiklerinin etkinliğini göstermiş ve gelecekteki klinik uygulamalar için kapıyı açmıştır. mRNA-LNP sistemlerinde, LNP'ler, mRNA kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı koruyan ve hücre içi iletimlerine aracılık eden dağıtım platformları olarak hizmet eder. LNP'ler tipik olarak dört bileşenden oluşur: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen glikol (PEG) konjugatı (lipid-PEG). Burada, ateşböceği lusiferazı kodlayan mRNA'yı kapsülleyen LNP'ler, LNP lipid bileşenlerini içeren organik fazın ve mRNA içeren sulu fazın mikroakışkan karışımı ile formüle edilir. Bu mRNA-LNP'ler daha sonra biyolüminesan plaka bazlı bir test kullanılarak HepG2 hücrelerinde transfeksiyon verimliliklerini değerlendirmek için in vitro olarak test edilir. Ek olarak, mRNA-LNP'ler, lateral kuyruk damarı yoluyla intravenöz bir enjeksiyonu takiben C57BL/6 farelerinde in vivo olarak değerlendirilir. Tüm vücut biyolüminesans görüntüleme, in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. mRNA-LNP özellikleri, HepG2 hücrelerindeki transfeksiyon etkinlikleri ve C57BL/6 farelerinde toplam ışıldayan akı için temsili sonuçlar gösterilmiştir.

mRNA-LNP'ler, ortalama hidrodinamik çapı 76.16 nm ve polidispersite indeksi 0.098 olan bir mikroakışkan alet kullanılarak formüle edildi. mRNA-LNP'lerin pKa'sı , TNS testi18 yapılarak 5.75 olarak bulundu. Bu mRNA-LNP'ler için kapsülleme verimliliği, modifiye floresan testi ve <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64810/64810eq01.jpg" style="margin: auto;"></p...

Burada, ateşböceği lusiferazını kodlayan mRNA'yı kapsülleyen lipid nanopartiküllerini (LNP'ler) formüle etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu LNP'ler, HepG2 hücrelerinde in vitro ve C57BL / 6 farelerinde in vivo potansiyelleri açısından test edildi.

Mikroakışkan Karıştırma ile Formüle Edilen mRNA-Lipid Nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo Etkinliğinin Test Edilmesi

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

Bu protokol, MRA'yı kapsülleyen tutarlı lipid nanopartiküllerini formüle etmek için kullanılabilir. Formülasyon parametreleri ayarlanabilir ve çeşitli lipid nanopartikülleri potens ve biyolojik dağılımları açısından değerlendirilebilir. Lipid nanopartikül formülasyonu ve in vitro ve in vivo testler için standartlaştırılmış bir protokol, birbirleriyle karşılaştırılabilen tutarlı lipid nanopartiküllerini formüle etmek için kullanılabilir.Nanopartikül potansiyelini formüle ederken ve değerlendirirken akılda tutulması gereken birçok küçük ayrıntı vardır, ancak hangi ayrıntılar hesaba katılır? Formülasyonun hazırlanması zor olmamalıdır. Temiz, dört litrelik bir beheri 200 ila 300 mililitre taze 10X PBS ile doldurarak ve ultra saf suyla 1X'e seyrelterek başlayın.PBS'nin son hacminin iki ila üç litre arasında olduğundan emin olun. Lipid nanopartikül veya LNP formülasyonu için uygun kapasiteye sahip diyaliz kasetlerini tarla kabına yerleştirin. mRNA seyreltmesi için 100 milimolar sitrik asit tamponu oluşturmak için ultra saf su kullanarak 10 milimolar sitrik asit tampon stoğunun on kat seyreltmesini yapın.Daha sonra, her bir lipiti %100 etanol içinde çözerek C 12 200 iyonize edilebilir lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve lipid bağlantılı PEG veya lipid PEG stok çözeltileri yapın. Stok çözeltilerinin 37 santigrat derecede ısıtılıp karıştırılarak tamamen çözüldüğünden emin olun. Farklı lipit bileşenlerinin hesaplanan hacimlerini konik bir tüpte birleştirin.Lipitleri% 100 etanol ile, LNP'nin nihai hacminin% 25'ini temsil eden son V hacmine seyreltin. İyonlaşabilir lipid/mRNA ağırlık oranına ve toplam mRNA-LNP hacmine dayalı olarak formülasyon için gereken mRNA miktarını hesaplayın. Ardından, mRNA'yı kodlayan ateşböceği lusiferazı buz üzerinde çözün.Daha sonra mRNA'yı 10 milimolar sitrik asit tamponu kullanarak organik fazın üç katı nihai hacme seyreltin. RNA'lar ve DNA için bir yüzey dekontamine ile hassas bir görev mendili püskürtün ve mikroakışkan aletin içini iyice silin. Ardından, yeni bir mikroakışkan kartuş açın ve giriş kanalları aşağı ve uzağa bakacak şekilde yerleştirin.Kapakları kapalı olarak tutucuya iki adet steril 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin. Bittiğinde, beş mililitrelik bir şırıngayı 10 milimolar sitrik asit tamponunda seyreltilmiş mRNA içeren mRNA çözeltisiyle doldurun. Daha sonra üç mililitrelik bir şırıngayı% 100 etanol içinde seyreltilmiş lipitleri içeren lipit çözeltisi ile doldurun.Şırıngalardaki havayı çıkardığınızdan emin olun. Daha sonra iğne olmadan, mRNA çözeltisini içeren beş mililitrelik şırıngayı kartuşun sol girişine yerleştirin ve lipit çözeltisini içeren üç mililitrelik şırıngayı kartuşun sağ girişine yerleştirin. Mikroakışkan enstrümanı açın ve hızlı çalıştırmayı seçin.Takılan beş ve üç mililitrelik şırıngalar için doğru şırınga tiplerini seçtikten sonra, mRNA-LNP'leri formüle etmek için başlat düğmesine basmadan önce LNP formülasyonu parametrelerini üçe bir sulu / organik akış hızı oranında girin. Sağ konik tüpte toplanan mRNA-LNP'leri, kaset zarını delmeden veya dokunmadan bir şırınga kullanarak önceden hidratlanmış diyaliz kasetlerine yükleyin, mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini PBS içeren behere geri yerleştirin ve en az iki saat diyalize bırakın. Diyalizden sonra, mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini steril bir biyogüvenlik kabinine getirin ve mRNA-LNP'leri iğneli bir şırınga kullanarak çıkarın.mRNA-LNP'leri 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak steril filtreleyin ve steril bir konik tüpte toplayın. Daha sonra karakterizasyon için 65 mikrolitre mRNA-LNP çözeltisini 1.5 mililitrelik bir mikrotüpe yerleştirin. Beyaz bir duvarda plaka 5.000 HepG2 hücresi, berrak taban, 100 mikrolitre tam hücre kültürü ortamında 96 oyuklu plaka ve hücreleri% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecede kontrollü bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin.Hücrelerin mRNA-LNP'lerle işlenmesinden önce, tüm ortamı kuyulardan çıkarın. Daha sonra, hücrelere istenen dozlarda tam hücre kültürü ortamında seyreltilmiş 100 mikrolitre mRNA-LNP veya 24 saatlik bir inkübasyondan önce 100 mikrolitre tam ortam ile muamele edin. İnkübasyondan sonra, hücre kültürü ortamını 96 oyuklu plakadan çıkarın, her oyuğa 20 mikrolitre lizis tamponu ve ardından 100 mikrolitre lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin.Plakayı ışıktan koruyun ve biyolüminesan sinyalini ölçmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin. mRNA-LNP çözeltisini steril PBS kullanarak seyreltin, böylece kuyruk damarı enjeksiyon hacminin 100 mikrolitresinde iki mikrogram toplam mRNA bulunur. 29 gauge insülin şırıngasını 100 mikrolitre mRNA-LNP veya 100 mikrolitre PBS ile doldurun ve şırıngadaki kabarcıkları çıkarın.İğneyi, eğimi yukarı bakacak şekilde farenin yan kuyruk damarına sokun ve 100 mikrolitre mRNA-LNP veya PBS'yi yavaşça enjekte edin. Enjeksiyondan altı saat sonra, steril PBS'de mililitre başına 15 miligramlık bir D-Luciferin potasyum tuzu çözeltisi hazırlayın. In vivo görüntüleme sistemi veya IVIS için görüntüleme yazılımında, cihazı veri toplamaya hazırlamak için başlat düğmesine basmadan önce lüminesansın yanındaki kutuyu seçin.Daha sonra, daha önce tedavi edilen farelere intraperitoneal olarak 200 mikrolitre D-Luciferin uygulayın ve fareleri uyuşturmadan önce lusiferaz sinyali stabilize olana kadar 10 dakika bekleyin. Anestezi uygulanmış fareleri in vivo görüntüleme sisteminin içindeki burun konilerine aktarın ve oda kapısını kapatmadan önce karınları açıkta kalacak şekilde sırt üstü olduklarından emin olun. Görüntüleme yazılımında, doğru görüş alanının seçildiğinden emin olun ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın, biyolüminesans görüntüleri elde etmek için yazılımdaki al düğmesine tıklayın.mRNA-LNP'lerin kapsülleme etkinliği, burada gösterilen modifiye floresan testi ve denklemi kullanılarak %92.3 olarak belirlendi. 5.000 HepG2 hücresinin artan dozlarda mRNA-LNP ile tedavisi üzerine artan biyolüminesans gözlenmiştir. Lusiferaz ekspresyonu, bu çalışmanın kuyu başına en düşük beş nanogram dozunda kolayca tespit edildi.Formüle edilmiş LNP'lerle tedavi edilen farelerin üst karnında güçlü bir biyolüminesans sinyali gözlendi. Toplam ışıldayan akıyı hesaplamak için karaciğer sinyallerinin etrafına ilgi bölgeleri çizildi. Toplam ışıldayan akı yaklaşık beş kez 10 üzeri 9 idi.LNP'leri formüle ederken her zaman iyonlaşabilir lipid / nükleik asit ağırlık oranını koruyun. Organik fazın her hacmi, sulu fazın üç hacminde mRNA'ya karşılık gelen iyonlaşabilir lipid içermelidir.

testing-vitro-vivo-efficiency-mrna-lipid-nanoparticles-formulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

Burada, lipoprotein parçacıklarının yerel Micro-RNA içeriğinin (mutlak/göreceli) belirlenmesi için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon tabanlı protokol sunulur. Buna ek olarak, Mikro-RNA seviyesini artırmak için bir yöntem, hem de lipoprotein parçacıkları hücresel alımını oranını belirlemek için bir yöntem gösterilmiştir.

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Protokol, sendelenmiş herringbone micromixer microfluidics cihazını kullanarak termosensitli lipozomların hazırlanması için optimize edilmiş parametreleri sunar. Bu aynı zamanda lipozomlar içine doksorubisin ve indosiyanyeşil co-kapsülleme ve kontrollü / tetiklenen ilaç salınımı için doksorubisin fototermal tetiklenen serbest sağlar.

Lysolipid İçeren Sıcaklığa Duyarlı Lipozomların Mikroakışkan Üretimi

Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Kendinden montajlı bir peptid-poloksamin nanopartikülü (PP-sNp), in vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA'yı kapsüllemek ve iletmek için mikroakışkan bir karıştırma cihazı kullanılarak geliştirilmiştir. Tanımlanan mRNA / PP-sNp, in vitro kültürlenmiş hücreleri verimli bir şekilde transfekt edebilir.

Peptit-Poloksamin Nanopartikülleri Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde In vitro Transkribe mRNA'nın Verimli Transfeksiyonu

Bu protokol, yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının fiziksel özelliklerini, immün yanıtını ve in vivo koruyucu etkisini hazırlar ve değerlendirir.

Bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) Enfeksiyonuna Karşı İmmün Yanıtının Değerlendirilmesi

Bu protokol, deneysel tasarım yapımında öznel seçimleri en aza indiren karışım, sürekli ve kategorik çalışma faktörleri üzerinden formülasyon optimizasyonuna bir yaklaşım sağlar. Analiz aşaması için etkili ve kullanımı kolay bir modelleme montaj prosedürü kullanılır.

Lipid Nanopartikül (LNP) Formülasyon Optimizasyonu için Tasarlanmış Karışım-Proses Deneyleri ve Kendi Kendini Doğrulayan Topluluk Modelleri (SVEM) Kullanarak Bir İş Akışı

Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV'ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM'ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.

Endozom kaynaklı veziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yöntemi

İki jetli bir CIJ ve dört jetli çok girişli girdap karıştırıcı (μMIVM) dahil olmak üzere sınırlı çarpma jeti (CIJ) karıştırıcı teknolojileri kullanılarak lipid nanopartiküllerinin (LNP'ler) sentezlenmesi için ayrıntılı bir protokol gösterilmiştir. CIJ mikserleri, tekrarlanabilir, türbülanslı mikro karıştırma ortamları oluşturur ve bu da monodispers LNP'lerin üretilmesiyle sonuçlanır.

Lipid Nanopartiküllerinin Kapalı Çarpmalı Jet Karıştırıcılarda Türbülanslı Akışla Sentezlenmesi

Bu protokol, Rayleigh parçalanmasını viral olmayan mRNA vektörlerinin aerosolize edilmesi için hafif bir süreç olarak sunar. Aerosol mRNA vektörleri için bölgesel birikim, Alberta İdealize Burun Girişi (AINI) modeliyle değerlendirilmiştir. İnsan akciğer hücrelerinde yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu, aerosol sonrası mRNA vektörlerinin fizikokimyasal ve biyolojik işlevlerinin korunmasını temsil eder.

Rayleigh Parçalanma Aerosolleri Yoluyla MRNA Poliplekslerinin Burun İçinden Ulaşılması: Burun Biriktirme ve Fonksiyonel Test İçin Vitro Yöntem

Öğrenin, mikroakışkan karıştırma ile mRNA-lipid nanopartikül formülasyonunu ve HepG2 hücreleri ile C57BL/6 farelerinde in vitro ve in vivo etkinlik testlerini. Bu yöntem, gen tedavisi araştırmalarında tekrarlanabilir nanopartikül geliştirme için kritik öneme sahiptir.

Mikroakışkan Karıştırma ile Formüle Edilen mRNA-Lipid Nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo Etkinliğinin Test Edilmesi

Daha fazla video keşfet