Name: Palmitik Asit Kaynaklı In Vitro Modelde Platycodin Dnin Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığı Üzerindeki Koruyucu Etkilerinin İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Keşfedin, platycodin D'nin palmitik asit kaynaklı AML-12 hücre modelinde alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı üzerindeki koruyucu etkilerini. Bu yöntem, oksidatif stresi azaltarak ve otofaji akışını geri kazanarak erken aşama ilaç geliştirmede hayvan modellerine pratik bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Chongqing Bilim ve Teknoloji Komisyonu (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 ve jbky20210029) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No. 2021MD703919) tarafından desteklenmektedir.

AML-12 hücreleri (normal bir fare hepatosit hücre hattı) hücre bazlı çalışmalar için kullanılır. Hücreler ticari bir kaynaktan elde edilir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. NAFLD'yi in vitro modellemek için AML-12 hücrelerinin ön muamelesi
<ol><li>Hücreleri normal hücre kültürü ortamında (DMEM artı Ham'ın F12 [1:1], 0.005 mg/mL insülin, 5 ng/mL selenyum, 0.005 mg/mL transferrin, 40 ng/mL deksametazon ve %10 fetal sığır serumu [FBS] içeren 37 °C'de %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde tutun.</li>
	<li>Hücreleri 2.8 x 105 hücre/kuyu yoğunluğuna sahip 12 delikli plakalara (1 mL/kuyu) tohumlayın. NOT: Tüm hücre sindirimi ve ortam değişim işlemleri, hücrelerin kirlenmesini önlemek için bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.</li>
	<li>Gece inkübasyonundan sonra hücrelerin kültür ortamını çıkarın (~ 10 saat) ve ardından hücreleri iki kez 1 mL serumsuz ortam (kuyucuk başına) ile yıkayın.</li>
	<li>12 kuyucuklu hücre plakasını soldan sağa, (1) kontrol grubu, (2) PD ile tedavi edilen grup, (3) PA ile tedavi edilen grup ve (4) PA + PD ile tedavi edilen grup dahil olmak üzere dört farklı tedavi grubuna bölün. NOT: Her deneysel tedavi grubunun üç replikası, aynı 12 delikli hücre plakası üzerinde yukarıdan aşağıya doğru düzenlenmiştir.</li>
	<li>Kontrol grubuna ve PD ile tedavi edilen gruba normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin ve PA ile tedavi edilen ve PA + PD ile tedavi edilen gruba 300 μM PA ile desteklenen normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin.</li>
	<li>24 saatlik inkübasyondan sonra hücrelerin kültür ortamını çıkarın ve ardından hücreleri iki kez 1 mL serumsuz ortam (kuyucuk başına) ile yıkayın.</li>
	<li>Kontrol grubuna bir araçla (dimetil sülfoksit, DMSO,% 0.1 v / v) desteklenmiş normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin; PD ile tedavi edilen gruba 1 μM PD ile desteklenmiş normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin; PA ile tedavi edilen gruba 300 μM PA ile desteklenmiş normal hücre kültürü ortamı (1 mL / kuyu) ekleyin; PA + PD ile tedavi edilen gruba 300 μM PA ve 1 μM PD ile desteklenmiş normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin.</li>
	<li>Ek bir 24 saat inkübasyondan sonra, 2′,7′-dikloro-dihidro-floresein diasetat (DCFH-DA) boyama (adım 2), JC-1 boyama (adım 3) ve batı lekeleme (adım 4) kullanarak PD'nin hücreler üzerindeki koruyucu etkilerini araştırın. NOT: Tüm inkübasyon işlemleri 37 °C'de %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde yapılır.</li>
</ol>2. ROS üretimindeki değişimin ölçülmesi
NOT: Hücrelerdeki hücre içi ROS seviyeleri, DCFH-DA boyama testine dayanarak değerlendirilir.
<ol><li>Tedavi süresinin sonunda (adım 1.8), hücreleri kuyucuk başına 1 mL fosfat tamponlu salin (1x PBS, pH 7.4) ile üç kez yıkayın ve ardından hücreleri kuyucuk başına 100 μL 10 μM DCFH-DA ile boyayın (bkz. Hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. NOT: 30 dakikalık inkübasyondan sonra belirgin bir yeşil floresan gözlenmezse, probun ve hücrelerin kuluçka süresi uygun şekilde arttırılabilir (30-60 dakika). 30 dakikalık inkübasyondan sonra yeşil floresan değerinin aşırı maruziyeti gözlenirse, probun ve hücrelerin kuluçka süresi uygun şekilde azaltılabilir (15-30 dakika).</li>
	<li>Hücreleri 1x PBS (1 mL/kuyu) ile üç kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 1 mL 1x PBS ekleyin.</li>
	<li>12 delikli plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından hücrelerin morfolojisini gözlemlemek için 20x'lik bir hedef kullanın (büyütme: 200x).</li>
	<li>480 nm uyarma dalga boyuna ve 530 nm emisyon dalga boyuna sahip yeşil floresan kanalı kullanarak floresan mikroskobundaki her bir kuyucuk için üç temsili floresan görüntüsü (büyütme: 200x) yakalayın. NOT: DCFH-DA'yı tespit etmek için 480 nm uyarma dalga boyuna ve 530 nm emisyon dalga boyuna sahip yeşil floresan kanal önerilir. Ek olarak, DCFH-DA, floresan mikroskobu35,36'da GFP ve FITC parametre ayarları ile tespit edilebilir.</li>
	<li>Son olarak, görüntüleri görüntü yakalama yazılımıyla işleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından her grubun ortalama floresan yoğunluğunu veya farklı grupların oranlarını hesaplamak için ImageJ yazılımını kullanın. NOT: Görüntüleme çalışmaları için kullanılan floresan mikroskobu ve Image J yazılımının teknik detayları daha önce37,38 olarak açıklanmıştır.</li>
</ol>3. Mitokondriyal membran potansiyelindeki değişimin ölçülmesi
NOT: Mitokondriyal membran potansiyelindeki değişiklikler JC-1 boyama testi ile izlenir.
<ol><li>Tedavi süresinin sonunda (adım 1.8), hücreleri üç kez kuyucuk başına 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra karanlıkta 37 ° C'de 30 dakika boyunca 100 μL 5 μg / mL JC-1 çalışma çözeltisi ile ( bkz. NOT: 30 dakikalık inkübasyondan sonra belirgin bir yeşil floresan gözlenmezse, probun ve hücrelerin kuluçka süresi uygun şekilde arttırılabilir (30-60 dakika). 30 dakikalık inkübasyondan sonra yeşil floresan değerinin aşırı maruziyeti gözlenirse, probun ve hücrelerin kuluçka süresi uygun şekilde azaltılabilir (15-30 dakika).</li>
	<li>Hücreleri 1x PBS (1 mL/kuyu) ile üç kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 1 mL 1x PBS ekleyin.</li>
	<li>12 delikli plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve ardından hücrelerin morfolojisini gözlemlemek için 20x'lik bir hedef kullanın (büyütme: 200x).</li>
	<li>Sırasıyla 485 nm ve 535 nm uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip yeşil floresan kanalı ve sırasıyla 550 nm ve 600 nm uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip kırmızı floresan kanalı kullanarak floresan mikroskobundaki her bir kuyucuk için üç temsili floresan görüntüsü (büyütme: 200x) yakalayın. NOT: Depolarize mitokondri 39,40,41 olarak kabul edilen JC-1 monomerini tespit etmek için 485 nm uyarma dalga boyuna ve 535 nm emisyon dalga boyuna sahip yeşil floresan kanalı kullanılır ve JC-1 dimerini tespit etmek için 550 nm uyarma dalga boyuna ve 600 nm emisyon dalga boyuna sahip kırmızı floresan kanalı, polarize mitokondri 39,40,41 olarak kabul edilir.</li>
	<li>Son olarak, görüntüleri görüntü alma yazılımıyla işleyin ve ardından her grubun ortalama floresan yoğunluğunu veya farklı grupların oranlarını hesaplamak için Image J yazılımını kullanın. NOT: Görüntüleme çalışmaları için kullanılan floresan mikroskobu ve Image J yazılımının teknik detayları daha önce37,38 olarak açıklanmıştır.</li>
</ol>4. LC3-II / LC3-I ve p62 / SQSTM1 protein ekspresyon seviyelerinin ölçülmesi
<ol><li>İşlemden sonra (adım 1.8), hücreleri 4 ° C'de önceden soğutulmuş 1x PBS (1 mL / kuyu) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>12 kuyucuklu plakaya proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli (1x) ile desteklenmiş RIPA lizis tamponu (100 μL / kuyu) ekleyin (bkz.</li>
	<li>Hücre lizatını 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Standart prosedürleri izleyerek BCA yöntemi ile süpernatantların protein konsantrasyonunu belirleyin42.</li>
	<li>SDS-PAGE numune yükleme tamponunu (5x, bakınız Malzeme Tablosu) hücre lizat süpernatantlarına ekleyin (hacim oranı = 1:4).</li>
	<li>Vorteksleme ile karıştırın (~ 15 s için yüksek hızda) ve proteini denatüre etmek için karışık numuneleri 5 dakika boyunca 100 ° C'de ısıtın.</li>
	<li>12-iyi hazırlanmış% 12 SDS-PAGE jelini elektroforez tankına koyun ve ardından ultra saf suyla seyreltilmiş SDS yukarı numune tamponunu (1x) yükseklik sınırı konumuna ekleyin. NOT: SDS-PAGE jeli, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılarak hazırlanmıştır.</li>
	<li>Protein işaretleyicisini (5 μL / kuyucuk) ve numuneleri (20 μg / kuyucuk) SDS-PAGE jelinin farklı kuyucuklarına ekleyin.</li>
	<li>Kararlı voltaj modunu 100 V'a ayarlayın ve elektroforezi 80 dakika boyunca gerçekleştirin.</li>
	<li>SDS-PAGE elektroforezinden sonra, proteinlerin daha önce yayınlanmış raporları takiben bir poliviniliden florür (PVDF) membranına (0.45 μM, bakınız Malzeme Tablosu) elektrotransferini gerçekleştirin43,44.</li>
	<li>Proteinlerin elektrotransferinden sonra, PVDF membranını oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda iki kez (5 dakika / saat) 10 mL TBST (1x TBS,% 0.1 Tween 20) ile yıkayın.</li>
	<li>PVDF membranını 5 mL sığır serum albümini (BSA, %5) ile oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 1 saat boyunca bloke edin.</li>
	<li>PVDF membranını 10 mL TBST ile üç kez (10 dakika/saat) yıkayın. Daha sonra, PVDF membranını, LC3 (fare mAb, 1:2.000), p62/SQSTM1 (bundan böyle p62, fare mAb, 1:2.000 olarak anılacaktır) ve β-aktin (fare mAb, 1:2.000) için bloke edici tamponda seyreltilmiş spesifik primer antikorların 5 mL'sinde gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>PVDF membranı oda sıcaklığında üç kez (10 dakika/saat) 10 mL TBST ile yıkayın. Daha sonra, PVDF membranını, oda sıcaklığında bloke edici tamponda (1:10.000) seyreltilmiş tavşan anti-fare IgG (HRP) ikincil antikoru ile inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 2 saat boyunca ışıktan korunun.</li>
	<li>PVDF membranı oda sıcaklığında üç kez (10 dakika/saat) 10 mL TBST ile yıkayın. Ardından, PVDF membranını plastik ambalajın üzerine yerleştirin, uygun miktarda ECL çalışma çözeltisi (200 μL / membran) ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve 2 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, ECL çalışma solüsyonunu çıkarın ve görüntü geliştirme için görüntüleme sistemindeki PVDF membranını açığa çıkarın. Son olarak, her bandın gri değerlerini analiz etmek için Image J yazılımını kullanın. NOT: Görüntüleme çalışmaları için kullanılan western blotting ve Image J yazılımının teknik detayları daha önce45,46 olarak açıklanmıştı.</li>
</ol>5. İstatistiksel analiz
<ol><li>Deneylerden elde edilen verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun.</li>
	<li>Daha önce açıklanan istatistiksel yazılım aracı ile anlamlılık analizinigerçekleştirin 47.</li>
	<li>Bir t-testi kullanarak iki grup arasındaki istatistiksel farklılıkları hesaplayın. 0,05'in altındaki bir P-değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Çalışmalar, NAFLD'nin yağlı karaciğerden NASH'ye kadar değişen, siroz ve karaciğer kanserine ilerleyebilen klinikopatolojik bir sendrom olduğu gerçeğini vurgulamıştır51. Yüksek yağlı bir diyet ve aktif olmayan bir yaşam tarzı NAFLD için tipik risk faktörleridir. NAFLD tedavisi için hem ilaç dışı tedaviler hem de ilaç tedavileriaraştırılmıştır 51,52,53. Bununla birlikte, NAFLD'nin patogenezi tam olarak ayd...

Platycodon grandiflorus (PG), Platycodon grandiflorus'un (Jacq.) kurutulmuş köküdür. A.DC., geleneksel Çin tıbbında (TCM) kullanılır. Esas olarak Çin1'in kuzeydoğu, kuzey, doğu, orta ve güneybatı bölgelerinde üretilmektedir. PG bileşenleri arasında triterpenoid saponinler, polisakkaritler, flavonoidler, polifenoller, polietilen glikoller, uçucu yağlar ve mineraller2 bulunur. PG, Asya'da gıda ve bitkisel ilaç olarak kullanılma konusunda uzun bir geçmişe sahiptir. Geleneksel olarak, bu bitki akciğer hastalıklarına karşı ilaç yapmak için kullanılmıştır. Modern farmakoloji ayrıca PG'nin diğer hastalıkların tedavisinde etkinliğine dair kanıtlar sağlar. Çalışmalar, PG'nin çeşitli ilaca bağlı karaciğer hasarı modelleri üzerinde terapötik bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. PG veya platikodin ekstraktlarının diyet takviyesi, yüksek yağlı diyete bağlı obeziteyi ve buna bağlı metabolik hastalıkları iyileştirebilir 3,4,5. PG'den polisakkaritler, farelerde LPS / D-GalN'nin neden olduğu akut karaciğer hasarının tedavisi için kullanılabilir6. Ayrıca, PG köklerinden gelen saponinler, yüksek yağlı diyete bağlı alkolsüz steatohepatiti (NASH) iyileştirir7. Ayrıca, PG'nin en önemli terapötik bileşenlerinden biri olan platikodin D (PD), insan hepatosellüler karsinom (HepG2) hücrelerinde düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ekspresyonunu ve düşük yoğunluklu lipoprotein alımını artırabilir8. Ayrıca, PD ayrıca apoptozu indükleyebilir ve HepG2 hücrelerinde adezyon, migrasyon ve invazyonu inhibe edebilir 9,10. Bu nedenle, bu çalışmada, fare hepatoma AML-12 hücreleri in vitro model yapımında ve bu modelde PD'nin farmakolojik etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını daha fazla incelemek için kullanılmıştır.
Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) terimi, basit steatoz, NASH, siroz ve hepatosellüler karsinom11'i içeren bir grup karaciğer hastalığını ifade eder. NAFLD'nin patogenezi tam olarak anlaşılamamış olsa da, klasik "iki isabetli" teoriden mevcut "çoklu vuruş" teorisine kadar, insülin direncinin NAFLD patogenezinde merkezi olduğu düşünülmektedir12,13,14. Çalışmalar, hepatositlerdeki insülin direncinin, karaciğerde biriken trigliseritleri oluşturan ve karaciğerin yağlı olmasına neden olan serbest yağ asitlerinin artmasına neden olabileceğini göstermiştir15,16. Yağ birikimi lipotoksisiteye, oksidatif strese bağlı mitokondriyal disfonksiyona, endoplazmik retikulum stresine ve inflamatuar sitokin salınımına yol açarak NAFLD17,18'in patogenezine ve ilerlemesine neden olabilir. Ek olarak, otofaji, hücresel insülin duyarlılığını, hücresel lipid metabolizmasını, hepatosit hasarını ve doğuştan gelen bağışıklığı düzenlemede rol oynadığı için NAFLD'nin patogenezinde de rol oynar 19,20,21.
NAFLD22,23'ün patogenezini ve potansiyel terapötik hedeflerini araştırmak için bir temel oluşturmak üzere çeşitli hayvan modelleri ve hücresel modeller oluşturulmuştur. Bununla birlikte, tek hayvan modelleri NAFLD24'ün tüm patolojik süreçlerini tam olarak taklit edemez. Hayvanlar arasındaki bireysel farklılıklar farklı patolojik özelliklere yol açar. NAFLD'nin in vitro çalışmalarında karaciğer hücre hatlarının veya primer hepatositlerin kullanılması, deneysel koşullarda maksimum tutarlılık sağlar. Hepatik lipid metabolizması disregülasyonu, NAFLD25'te daha yüksek seviyelerde hepatosit lipid damlacık birikimine yol açabilir. Oleik asit ve palmiye yağı gibi serbest yağ asitleri, in vitro modelde, yüksek yağlı bir diyetin neden olduğu NAFLD'yi taklit etmek için kullanılmıştır26,27. İnsan hepatoblastoma hücre hattı HepG2, in vitro NAFLD modellerinin yapımında sıklıkla kullanılır, ancak bir tümör hücre hattı olarak, HepG2 hücrelerinin metabolizması normal fizyolojik koşullar altında karaciğer hücrelerininkinden önemli ölçüde farklıdır28. Bu nedenle, ilaç taraması için in vitro NAFLD modelini oluşturmak için primer hepatositleri veya fare primer hepatositlerini kullanmak, tümör hücre hatlarını kullanmaktan daha avantajlıdır. Hem hayvan modellerinde hem de in vitro hepatosit modellerinde ilaç etkilerinin ve terapötik hedeflerin sinerjik incelemesi karşılaştırıldığında, in vitro NAFLD modelini oluşturmak için fare hepatositlerinin kullanılmasının daha iyi uygulama potansiyeline sahip olduğu görülmektedir.
Karaciğere giren serbest yağ asitleri enerji üretmek için oksitlenir veya trigliseritler olarak depolanır. Önemli ölçüde, serbest yağ asitleri belirli bir lipotoksisiteye sahiptir ve hücresel disfonksiyon ve apoptozu indükleyebilir12. Palmitik asit (PA), insan plazmasında en bol bulunan doymuş yağ asididir29. Yağ dışı dokudaki hücreler uzun süre yüksek konsantrasyonlarda PA'ya maruz kaldığında, bu reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini uyarır ve oksidatif strese, lipit birikimine ve hatta apoptoza neden olur30. Bu nedenle, birçok araştırmacı PA'yı karaciğer hücrelerini ROS üretmeye teşvik etmek için bir indükleyici olarak kullanır ve böylece in vitro yağlı karaciğer hastalığı modelini oluşturur ve bazı aktif maddelerin hücreler üzerindeki koruyucu etkilerini değerlendirir31,32,33,34. Bu çalışma, PD'nin PA tarafından indüklenen NAFLD'nin bir hücre modeli üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmak için bir protokol sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>%5 BSA Engelleme Tamponu</td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>SW3015</td><td></td></tr><tr><td>AML12 (alfa fare karaciğeri 12) hücre hattı</td><td>Procell Yaşam Bilimleri ve Technology Co., Ltd, Çin</td><td>AML12</td><td></td></tr><tr><td>Beyo ECL&nbsp; Artı</td><td>Beyotime, Şangay, Çin</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>Biyo-güvenlik kabini</td><td>Esco Micro Pte Ltd, Singapur</td><td>AC2-5S1 A2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus, Tokyo, Japonya</td><td>1.8</td><td></td></tr><tr><td>Kültür CO2 İnkübatörü</td><td>Esco Micro Pte Ltd, Singapur</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Beyotime, Şangay, Çin</td><td>ST125</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Hidroklon,&nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; ABD</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Hyclone, Tauranga, Yeni Zelanda</td><td>SH30406.05</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad yazılımı</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ABD</td><td>8.0</td><td></td></tr><tr><td>HRP Keçi Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>ABclonal, Wuhan, Çin</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik PVDF Transfer Membranı</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin, Transferrin, Selenyum Çözeltisi, 100 kez;</td><td>Beyotime, Şangay, Çin</td><td>C0341</td><td></td></tr><tr><td>MAP LC3&beta; Antikor</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji (Shanghai) Co., Ltd</td><td>SC-376404</td><td></td></tr><tr><td>JC-1 ile Mitokondriyal Membran Potansiyel Test Kiti</td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>M8650</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Ters Mikroskop IX53</td><td>Olympus, Tokyo, Japonya</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>Palmitik Asit</td><td>Sigma, Almanya</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (100x)</td><td>Hiklon,&nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; ABD</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil&nbsp; florür</td><td>Beyotime, Şangay, Çin</td><td>ST506</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Çözelti</td><td>Hidroklonu,&nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; ABD</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Platycodin D</td><td>Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, Çin</td><td>CSA: 58479-68-8</td><td></td></tr><tr><td>Genel kullanım için proteaz inhibitör kokteyli, 100x</td><td>Beyotime, Şangay, Çin</td><td>P1005</td><td></td></tr><tr><td>Protein Marker</td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>PR1910</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif Oksijen Türleri Test Kiti</td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>CA1410</td><td></td></tr><tr><td>RİPA&nbsp; Lizis&nbsp; Tampon</td><td>Beyotime, Şangay, Çin</td><td>P0013E</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Jel Hızlı Hazırlama Kiti</td><td>Beyotime, Şangay, Çin</td><td>P0012AC</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Numune Yükleme Tamponu, 5x</td><td>Beyotime, Şangay, Çin</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Santrifüj</td><td>Sigma, Almanya</td><td>3K15</td><td></td></tr><tr><td>SQSTM1 / p62 Antikor</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji (Şangay) Co, Ltd</td><td>SC-28359</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Sonsuz 200 PRO&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH, Avusturya</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>WB Transfer Tamponu, 10x</td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>D1060</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -aktin fare mAb</td><td>ABclonal, Wuhan, Çin</td><td>AC004</td><td></td></tr></tbody></table>

palmitik asit kaynaklı in vitro modelde platycodin d'nin alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı Üzerindeki koruyucu etkilerinin İncelenmesi

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) görülmesi dünya çapında endişe verici bir oranda artmaktadır. Platycodon grandiflorum , çeşitli hastalıkların tedavisi için geleneksel bir etnotilaç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve günlük diyete dahil edilebilecek tipik bir fonksiyonel besindir. Çalışmalar, Platycodon grandiflorum'daki ana aktif bileşenlerden biri olan platycodin D'nin (PD) yüksek biyoyararlanıma sahip olduğunu ve NAFLD'nin ilerlemesini önemli ölçüde azalttığını ileri sürmüştür, ancak bunun altında yatan mekanizma hala belirsizdir. Bu çalışma, PD'nin NAFLD'ye karşı terapötik etkisini in vitro olarak araştırmayı amaçlamaktadır. AML-12 hücreleri, NAFLD'yi in vitro olarak modellemek için 24 saat boyunca 300 μM palmitik asit (PA) ile ön işlemden geçirildi. Daha sonra, hücreler ya PD ile tedavi edildi ya da 24 saat boyunca PD tedavisi almadı. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyeleri 2′,7′-dikloro-dihidro-floresein diasetat (DCFH-DA) boyaması kullanılarak analiz edildi ve mitokondriyal membran potansiyeli JC-1 boyama yöntemi ile belirlendi. Ayrıca, hücre lizatlarındaki LC3-II / LC3-I ve p62 / SQSTM1 protein ekspresyon seviyeleri batı lekelenmesi ile analiz edildi. PD'nin, PA ile tedavi edilen grupta ROS ve mitokondriyal membran potansiyel düzeylerini kontrol grubuna göre anlamlı derecede azalttığı bulundu. Bu arada, PD, kontrol grubuna kıyasla PA ile tedavi edilen grupta LC3-II / LC3-I seviyelerini arttırdı ve p62 / SQSTM1 seviyelerini düşürdü. Sonuçlar, PD'nin oksidatif stresi azaltarak ve otofajiyi uyararak NAFLD'yi in vitro olarak iyileştirdiğini göstermiştir. Bu in vitro model, NAFLD'de PD'nin rolünü incelemek için yararlı bir araçtır.

Hücrelerde hücre içi ROS AML-12 hücreleri 24 saat boyunca 300 μM PA ile indüklendi ve bir NAFLD hücre modeli oluşturuldu. Daha sonra, hücreler 24 saat boyunca PD ile tedavi edildi. Hücreler bir DCFH-DA floresan probu ile etiketlendi ve bir floresan mikroskobu altında ROS üretimi gözlendi. Hücrelerdeki hücre içi ROS'un DCFH-DA boyamasının sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir. Sonuçlar, PD'nin 300 μM PA (P &lt; 0.01) ile inkübe edilen hücrelerdeki hücre içi ROS sevi...

Bu protokol, palmitik asit kaynaklı in vitro modelde platikodin D'nin alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmaktadır.

Palmitik Asit Kaynaklı In Vitro Modelde Platycodin D'nin Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığı Üzerindeki Koruyucu Etkilerinin İncelenmesi

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Bu yöntem, model yapımına ve platikodin D'nin NAFLD üzerindeki koruyucu etkilerinin araştırılmasına izin verecek AML-12 hücrelerinin kullanımını göstermektedir. Hayvan modellerinin kullanımına aşırı bağımlılık, terapötik ilaç geliştirme yükünde artmaktadır. NAFLD ilaç geliştirmenin erken aşamasında hücre modellerinin kullanılması daha pratik ve uygun maliyetlidir.Bu TCM modeli, platikodin D'nin biyolojik fonksiyonunun anlaşılmasını geliştirmeye yardımcı olabilir ve NAFLD tedavisi için diğer TCM'lerin kullanımını incelemeye yardımcı olabilir. 12 delikli plakalarda kuyu başına bir mililitre AML-12 hücresi ekerek başlayın. Daha sonra 12 kuyucuklu plakayı dört farklı tedavi grubuna bölün ve bunları kontrol, PD ile tedavi edilen, PA ile tedavi edilen ve PA artı PD ile tedavi edilen grup olarak etiketleyin.Kontrole ve PD ile tedavi edilen gruba kuyu başına bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ekleyin. PA ile tedavi edilen ve PA artı PD ile tedavi edilen gruba 300 mikromolar palmitik asit ile desteklenmiş normal hücre kültürü ortamının bir mililitresini ekleyin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücrelerin kültür ortamını çıkarın ve ardından hücreleri iki kez bir mililitre serumsuz ortamla yıkayın.Daha sonra, kontrol grubuna bir araçla desteklenmiş bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ve PD ile tedavi edilen gruba bir mikromolar platikodin D ile desteklenmiş bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ekleyin. PA artı PD ile tedavi edilen gruba 300 mikromolar palmitik asit ile desteklenmiş bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ve 300 mikromolar palmitik asit ve bir mikromolar platikodin D ile desteklenmiş bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca tedavi ettikten sonra, hücreleri üç kez kuyucuk başına bir mililitre 1X PBS ile yıkayın.Daha sonra hücreleri kuyu başına 100 mikrolitre 10 mikromolar DCFH-DA ile boyayın. Hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücreleri üç kez 1X PBS ile yıkayın ve her bir oyuğa bir mililitre 1X PBS ekleyin.12 kuyucuklu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve hücrelerin morfolojisini 200X büyütmede gözlemlemek için 20X hedefi kullanın. Mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için, daha önce hazırlanan tedavi edilmiş hücreleri kuyucuk başına bir mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri mililitre JC-1 çalışma çözeltisi başına 100 mikrolitre beş mikrogram ile lekeleyin ve hücreleri karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra hücreleri üç kez 1X PBS ile yıkayın ve her bir oyuğa bir mililitre 1X PBS ekleyin. 12 kuyucuklu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve hücrelerin morfolojisini 200X büyütmede gözlemlemek için 20X hedefi kullanın. Tedavi edilen hücreleri lize edin ve hücre lizatını 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine toplayın.Tüpleri 12.000 G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, hücre lizat süpernatantına bir ila dört hacim oranında 5X SDS-PAGE numune yükleme tamponu ekleyin. Daha sonra, hazırlanan% 12 SDS-PAGE jelini 12 kuyucuklu elektroforez tankına yerleştirin ve önerilen yükseklik sınırına ultra saf su ile seyreltilmiş 1X SDS yukarı numune tamponu ekleyin.SDS-PAGE elektroforezinden sonra, proteinlerin 0.45 mikron PVDF membrana elektro transferini gerçekleştirin. Membranı, bloke edici tamponda seyreltilmiş birincil antikorların beş mililitresinde inkübe edin. LC-III, p62 ve beta-aktin için spesifik antikorlar kullanın.Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra PVDF membranını, bloke edici tamponda bir ila 10.000 arasında seyreltilmiş tavşan anti-fare LGG HRP ikincil antikoru ile inkübe edin. Membranı iki saat boyunca ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe edin.İnkübasyondan sonra, PVDF membranını plastik bir sargı üzerine yerleştirin. Uygun miktarda ECL çalışma çözeltisi ekleyin ve iki dakika boyunca inkübe edin. Ardından ECL çalışma solüsyonunu çıkarın ve görüntü geliştirme için görüntüleme sistemindeki PVDF membranını açığa çıkarın.DCFH-DA boyaması, platikodin D'nin ALM-12 hücrelerindeki hücre içi ROS seviyesini önemli ölçüde azaltabileceğini ve bu tedavinin hücresel oksidatif stresi azaltabileceğini göstermiştir. Dahası, JC-1 monomerlerini veya depolarize mitokondrileri temsil eden yeşil floresan, palmitik asitle muamele edilen hücrelerde tedavi edilmemiş hücrelerden daha yüksekken, JC-1 dimerlerini veya polarize mitokondrileri temsil eden kırmızı floresan, palmitik asitle muamele edilen hücrelerde, tedavi edilmemiş hücrelerden daha düşüktü ve bu da palmitik asit kaynaklı MMP depolarizasyonunu gösteriyordu. Ek olarak, model grubuyla karşılaştırıldığında, JC-1 monomerlerinin dimerlere oranı, platikodin D tedavi grubunda azalmıştır, bu da palmitik asit kaynaklı MMP'yi iyileştirebileceğini göstermektedir.Otofaji ile ilişkili proteinler LC-III ve p62'nin protein ekspresyon düzeyleri batı lekelenmesi ile araştırıldı. LC-32'nin LC-31'e oranı önemli ölçüde azaldı ve palmitik asit ile muamele edildikten sonra p62'nin protein ekspresyon seviyesi arttı. Öte yandan, platikodin D, p62'nin protein ekspresyon seviyesini önemli ölçüde azalttı ve LC-32'nin LC-31'e oranını arttırdı, bu da palmitik asit tarafından indüklenen otofajik akının restorasyonunu gösterdi.Negatif kontrol grubundaki hücrelerin floresan değeri nispeten yüksekse, floresan probların çalışma konsantrasyonları gerektiğinde ayarlanabilir.

investigating-protective-effects-platycodin-d-on-non-alcoholic-fatty

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Burada, hepatik steatozun in vivo ve in vitro modellerini oluşturmak ve steatotik fenotipleri ve ilgili fizyolojik parametreleri analiz etmek için optimize edilmiş yöntemler açıklanmaktadır.

Optimize Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Karaciğer Steatoz

Bu çalışmada, farklılaştırılmış HepaRG hücrelerinde yağ asidi tuz sodyum oleat ile karaciğer veziküler steatozis inducing için ayrıntılı bir protokol tarif ve tutarlı Anti-Stokes dahil lipid birikiminin tespiti ve ölçülmesi için yöntemler istihdam Raman saçılma (CARS) mikroskobu, sitofluorimetrik analiz, yağ kırmızı O boyama, ve qPCR.

Farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozu indükleyen ve karakterize etme

Bu protokol, steatozu ve hepatositlerin lipitlere aşırı maruz kalmasıyla ortaya çıkardığı moleküler, biyokimyasal, hücresel değişiklikleri incelemek için bir araç olması amaçlanmıştır.

Deneysel Steatoz İn VitroModeli : Lipid Aşırı Yük Şartlandırılmış Ortamda Hepatosit Hücre Kültürü

Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Bu protokol, Fructus Phyllanthi'nin hiperlipidemiye karşı temel hedeflerini ve mekanizmalarını araştırmak için ağ farmakolojisi tahmini ve metabolomik doğrulamaya dayanan entegre bir stratejiyi tanımlamaktadır.

Ağ Farmakolojisi Hiperlipidemiye Karşı Fructus Phyllanthi Mekanizmasının Tahmini ve Metabolomik Validasyonu

Bu protokol, lipit damlacıklarını (LD'ler) boyamak, yağ asidi kaynaklı yağlı hepatosit modelinde LD'lerin boyutunu ve sayısını hesaplamak ve canlı hücre görüntüleme ile küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma sürecini gözlemlemek için BODIPY 493/503'ün nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.

Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Büyüklüğü ve Füzyonunun Değerlendirilmesi

Bu makale, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı için bir model olarak oleik asit kaynaklı HepG2 hücrelerinin kullanımını açıklamaktadır.

Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığında Yağ Birikiminin İn Vitro Modellenmesi

Biz eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek bir beyin kesit modeli geliştirdik. Bu teknik açıdan olgun beyin dokusunu oluşturur ve kısmen sağlam nöronal devreleri, hücresel etkileşimleri ve postsinaptik bölmeleri korurken, deney için gerekli olan hayvan sayısı azalır.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Bu yöntem, fare modellerinde yeni ilaçların farmakokinetiğini değerlendirmek için, karotid arter yoluyla sabit bir ilaç çözeltisi sunmak amacı ile geliştirilmiştir.

Farelerde Taksanlar Farmakokinetik ve Farmakodinamik Analiz Karotis Arter İnfüzyonlar

Keşfedin, platycodin D'nin palmitik asit kaynaklı AML-12 hücre modelinde alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı üzerindeki koruyucu etkilerini. Bu yöntem, oksidatif stresi azaltarak ve otofaji akışını geri kazanarak erken aşama ilaç geliştirmede hayvan modellerine pratik bir alternatif sunar.

Palmitik Asit Kaynaklı In Vitro Modelde Platycodin Dnin Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığı Üzerindeki Koruyucu Etkilerinin İncelenmesi (Video) | JoVE Journal

Palmitik Asit Kaynaklı In Vitro Modelde Platycodin D'nin Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığı Üzerindeki Koruyucu Etkilerinin İncelenmesi

Daha fazla video keşfet