Morfolojik Gözlem ve Bakteriyel Hücre Hasar Analizi için Hızlı Bir Teknik Olarak Temas Modu Atomik Kuvvet Mikroskobu
30 Haziran 2023
Burada, atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) bakteriyel karakterizasyonu için basit ve hızlı bir yöntem olarak uygulanmasını sunuyoruz ve bakteri boyutu ve şekli, bakteri kültürü biyofilmleri ve nanopartiküllerin bakterisitler olarak aktivitesi gibi ayrıntıları analiz ediyoruz.
Bu protokol, belirli bir hastalık veya tedaviye bağlı olarak hücre morfolojisindeki değişiklikleri gözlemlemek için temas modu atomik kuvvet mikroskobunun kullanımını gösterir. Kontaminasyonu önlemek için bu prosedür için kapalı kapların kullanılması ve yaşlanmayı önlemek için sabit numunenin mümkün olan en kısa sürede analiz edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Numune kuruyana kadar slaytı birkaç kez yavaşça bir alevin üzerinden geçirerek numuneleri slayta sabitleyerek başlayın.
Sabit numuneleri bir Petri kabına yerleştirin ve gözlem için atomik kuvvet mikroskobu ekipmanına taşıyın. Ardından, bilgisayarı ve atomik kuvvet mikroskobunu açın. Ardından yazılımda temas modunu, ContAI-G problarını ve otomatik eğim seçeneklerini seçin.
Ayar noktasını 20 nanometreye, P kazancını 10.000'e, I kazancını 1.000'e, D kazancını sıfıra ve uç voltajını sıfır milivolta ayarlayarak Z denetleyicisi için varsayılan değerleri ayarlayın. 70 mikrometre tarama aralığı kafasını kullanarak numuneleri AFM temas moduna yerleştirin. Tarama kafasına entegre edilmiş iki lense monte edilmiş bir kamera kullanarak probun altındaki alanın yüzeyinin hızlı bir görünümünü elde edin.
Şimdi, XY düzleminde manuel olarak yer değiştirerek istediğiniz alanı seçin. Temas sağlanana kadar probun numune yüzeyine elektronik olarak yaklaşmasına izin verin. XY eğim yönünü azaltarak tarayıcının ve numune yüzeyinin XY ölçüm düzlemini elektronik olarak ayarlayın.
Yazılımın standart parametrelerini saniyede bir satıra ve satır başına 256 noktaya ayarlayın. Ardından, 70 x 70 mikrometrelik bir alanda tam bir tarama aralığı gerçekleştirin. Yakınlaştırma aracını kullanarak daha küçük alanı seçin.
Konsol elektronik olarak geri çekerek ve numuneyi XY düzlemi boyunca hareket ettirerek numuneden yeni bir alan seçin. Ardından, daha önce gösterildiği gibi yeni bir tarama gerçekleştirin. Ardından, veri işlemeyi gerçekleştirmek için filtre seçimindeki görüntünün araçlar menüsündeki satır satır seviyelendirmeyi kullanın.
En iyi görüntü çözünürlüğünü elde etmek için renk çubuğundaki maksimum ve minimum yüksekliği optimize edin. Son olarak, analiz menüsünü kullanarak görüntü analizini gerçekleştirin. Uzunluğu ve mesafeyi belirlemek için istediğiniz araçla başlangıç ve bitiş noktalarını seçin.
Bakteri kültürlerinin atomik kuvvet mikroskobik analizi, Staphylococcus aureus kültürlerinin kok agregaları olan bölgelere dağıldığını göstermiştir. Artan ölçekler, popülasyon dağılımı ve kok morfolojisinin daha fazla takdir edildiğini göstermiştir. AFM temas modu görüntüleri, ortalama 1.25 mikrometre genişliğini gösteren kokların boyutunun belirlenmesine izin verdi.
Pseudomonas hunanensis, yapışkan bir tek tabaka oluşturan tüm cam destek yüzeyinde homojen bir dağılım gösterdi. Kültürler 1.9 mikrometre uzunluğunda ve 0.9 mikrometre genişliğinde çubuk şeklindeydi. Staphylococcus aureus'un magnezyum oksit nanopartiküllerinin mikro seyreltmeye maruz kalması, ciddi hücresel yapı bozulması nedeniyle pürüzsüz bir yüzey ve homojen kontur kaybına neden olmuştur.
Vezikül oluşumu ve sitozolik materyal salınımı kültürlerde MIC'den daha yüksek konsantrasyonlarda gözlenmiştir. E.coli kültürlerinde de homojen çubuk benzeri şeklini vurgulayan pürüzsüz yüzeyler gösteren kontrollerle benzer sonuçlar elde edilmiştir. Yapı, sadece ayırt edilebilir siluetlerle 1.000 PPM nanopartikül maruziyetinde tamamen kayboldu.
Daha fazla analiz için gerekli olduğu için numune sabitlemenin doğru yapılması önemlidir. Görüntü filtresi, iyi görüntü çözünürlüğü ve örnek ayrıntılar sağlamaya yardımcı olur. Sabitleme yöntemi kullanılarak, mekanik özelliklerin incelenmesinde yardımcı olabilecek AFM temassız modları uygulanabilir.
Bu metodoloji, bakteriyel hücre hasarı analizine odaklanan tıbbi ve mikrobiyoloji araştırmaları için ucuz ve kullanışlı bir araç olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bakteri hücrelerinin boyutu, şekli, kültür biyofilmleri ve nanoparçacıkların bakterisidal etkilerine odaklanan detaylı bakteri karakterizasyonu için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanır. Protokol, bakteri hücrelerinde morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için dikkatli numune hazırlaması ve özel görüntüleme tekniklerini vurgular.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Mikrobiyoloji
- Bakteri karakterizasyonu
- Nanoparçacık araştırması
Arka Plan
- Atomik kuvvet mikroskobu, bakteri morfolojisini gözlemlemek için önemli bir araçtır.
- Bakteriyel biyofilm oluşumunu ve bakterisidlere verilen tepkiyi anlamak, tıbbi araştırmalara yardımcı olur.
- Numune hazırlaması, doğru görüntüleme ve analiz için kritik öneme sahiptir.
Kullanılan Yöntemler
- Temas modunda atomik kuvvet mikroskobu
- Staphylococcus aureus ve Pseudomonas hunanensis kültürleri
- Nanoparçacık maruziyet deneyleri
Ana Sonuçlar
- AFM analizi, bakteri hücrelerinin boyutunu ve dağılımını ortaya çıkardı, Staphylococcus aureus ortalama 1.25 mikrometre genişliğindeydi.
- Magnezyum oksit nanoparçacıklarının artan konsantrasyonları, bakteri hücrelerinde önemli morfolojik değişikliklere yol açtı.
- Çalışma, AFM'nin bakteri yapısal bütünlüğünü analiz etmede etkinliğini gösterir.
Sonuçlar
- Bu metodoloji, bakteri hasarı değerlendirmede AFM'nin yararını vurgular.
- Bulgular, bakterilerin tedavilere verilen tepkilerinin daha geniş anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
