Name: IS200/IS605 Ailesi ile İlişkili TnpBnin Transpozon Aktivitesi Üzerindeki Etkilerinin Gerçek Zamanlı Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile Escherichia coli hücrelerinde TnpB'nin transposon aktivitesini nasıl artırdığını. Bu yöntem, tek hücre düzeyinde eksizyon istatistiklerini ölçerek genetik dinamikleri anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma için finansal destek, Kaliforniya Üniversitesi'nden başlangıç fonları tarafından sağlandı.

1. Bakteri kültürlerinin hazırlanması
<ol><li>E. coli suşu MG1655'i plazmid transpozon yapıları (daha önce Kim ve ark.8'de tanımlanmıştır) ile LB'de gece boyunca uygun antibiyotiklerle (25 μg / mL kanamisin, bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'de büyütün. NOT: Kullanılan yapıların dizileri ve ilgili diziler GenBank20 katılım numaraları OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 ve OP717085 olarak mevcuttur.</li>
	<li>Kararlı durum üstel büyüme elde etmek için, kültürleri ≥100 kat M63 ortamına (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2 SO 4, 0.5 μg / mL tiamin [B1 vitamini]) ve uygun antibiyotiklerle (bkz.</li>
	<li>600 nm'deki (OD600) optik yoğunluk ~ 0,2'ye ulaşana kadar kültürleri 37 ° C'de büyütün. Kültürler kullanıma hazırdır.</li>
</ol>2. Slayt hazırlama
<ol><li>Agarozu eritmek ve tamamen erimiş ve iyi karıştırıldığından emin olmak için M63'ü mikrodalgada% 0.5 w / v glikoz ve% 1.5 w / v agaroz ile kaynatarak bir slayt hazırlayın.</li>
	<li>Antibiyotik ve indükleyiciler eklemeden önce karışımın ~ 55 ° C'ye soğumasını bekleyin (25 μg / mL Kanamisin ve 10 ng / μL anhidrotetrasiklin [aTc], bakınız Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Çalışma tezgahına bir mikroskop slaytı yerleştirin. İlkine dik iki slayt daha istifleyin ve alt slayda paralel olarak üste bir slayt daha yerleştirin. Alt ve üst slaytlar arasında bir slayt kalınlığına eşit bir boşluk olduğundan emin olun. Pipet, M63 agaroz karışımının ~1 mL'si arasındaki bu boşluğa yavaşça küçük bir jel kare oluşturacak şekilde kaydırır.</li>
	<li>Jel katılaştıktan sonra (~ 10-15 dakika), çıkarmak için üst slaytı kaydırın. Agarose pedini bir tıraş bıçağı veya bıçakla kesin. Daha sonra kültürün 2,5 μL'sini pipet (adım 1.3) ve kapak kapağını üstüne koyun.</li>
	<li>Kızak ve kapak kapağı arasındaki boşluğu epoksi ile kapatın (bkz. Epoksinin kurumasına ve hücrelerin 37 ° C'de en az 1 saat boyunca agaroz pedine yerleşmesine izin verin.</li>
</ol>3. Timelapse floresan mikroskopi
<ol><li>Hazırlanan numuneyi (adım 1.3) bir floresan mikroskobuna (bakınız Malzeme Tablosu) ısıtılmış ve 37 °C'de muhafaza edilmiş bir ortama yerleştirin.<ol><li>Görüntü alma için kullanılan fotoğraf makinesine uygun pozlama sürelerini ayarlayın. Fotobeyazlatmayı en aza indirmek için aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. NOT: Bu çalışmada her dalga boyu için 2 sn maruz kalma süresi kullanılmıştır.</li>
		<li>Her dalga boyu için, minimum floresan içeren bir Görüş Alanı (FOV) bulun. Arka plan çıkarma için analiz sırasında kullanmak üzere görüntüler edinin.</li>
	</ol></li>
	<li>Farklı dalga boylarında ve düzenli zaman aralıklarında bir ızgaradaki görüntüleri almak için bir protokol ayarlayın.<ol><li>Zaman atlamalı fotoğrafçılığı protokole kodlayın. Edinme sıklığını istenen zaman aralığına (burada 20 dakika) ve toplam zaman atlama süresini istenen uzunluğa (24 saat) ayarlayın.</li>
		<li>Uygun dalga boylarını protokole kodlayın (kullanılan yapıya bağlı olarak). NOT: mCherry uyarma zirvesi 587 nm ve emisyon zirvesi 610 nm21'dir; mVenüs 515 nm ve 527 nm12'de, mCerulean3 ise 433 nm ve 475 nm11'dedir.</li>
		<li>İstenilen FOV sayısı arasında yakalanacak ızgara boyutunu ayarlayın. NOT: Burada gösterilen temsili veriler 8 x 8 FOV kullanmıştır.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Görüntü analizi
<ol><li>Adım 3.1.2'de edinilen ilgili arka plan görüntülerini kullanarak her renk kanalında arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin. Tüm analiz adımları için, açık kaynaklı platform Fiji22'de standart modüller kullanıyoruz ( bkz.</li>
	<li>mCerulean kanalını eşik haline getirerek ve eşik alanını ortalama hücre alanına bölerek zamanın her noktasındaki toplam popülasyona yaklaşın.</li>
	<li>Benzersiz eksizyon olaylarını saymak için, mCerulean3 kanalının zaman türevini kullanın. Bunu, mCerulean3 kanalındaki ardışık görüntüleri çıkararak gerçekleştirin. Eksizyon olayları, zaman türevinde parlak bir floresan parlaması olarak tespit edilecektir.<ol><li>İstenmeyen floresanı ortadan kaldırmak için eksizyon olayları yığınını eşik haline getirin. Bu işlemin eksizyonların bazı kısımlarını eşik hale getireceğini unutmayın. Bunu düzeltmek için, eksizyonları orijinal boyutlarına geri yüklemek üzere görüntüleri genişletin. NOT: Benzer eşik ve görüntü analizi teknikleri kullanılarak yapılan analizler diğer floresan kanallarında da yapılabilir (örneğin; eksizyon olaylarını transpozaz TnpA [sarı Venüs floresan] ve TnpB [kırmızı mCherry floresan] seviyeleri ile ilişkilendirin].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Canlı hücrelerde transpoze edilebilir element aktivitesinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için burada sunulan benzersiz yöntem, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak transpozisyonu doğrudan tespit edebilen ve bu aktiviteyi aksesuar proteinlerin ekspresyonu ile ilişkilendirebilen hassas bir testtir. Verim, toplu yöntemlerle elde edilebilenden daha düşük olsa da, bu yöntem bireysel canlı hücrelerde TE aktivitesinin ve protein ekspresyonunun ayrıntılı ölçümlerini sağlar.
Gerçek zamanlı görünt...

Transpoze edilebilir elementler (TE'ler), konakçı genomlarında eksizyon veya katalizör kopyalama ve ardından genomik yeniden entegrasyon ile harekete geçen genetik elementlerdir. TE'ler yaşamın tüm alanlarında bulunur ve transpozisyon, konakçı genomunu yeniden yapılandırır, kodlamayı mutasyona uğratır ve bölgelerikontrol eder 1. Bu, evrim2,3, gelişim 4,5 ve kanser7 dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarındaönemli bir rol oynayan mutasyonlar ve çeşitlilik üretir.
Transpozisyonel aktivitenin yönlerini floresan muhabirlere bağlayan yeni genetik yapıları kullanarak, önceki çalışmamız, yaygın IS200 / IS605 TE'ler ailesinin bir temsilcisi olan bakteriyel TE IS608'e dayanan deneysel bir sistemin geliştirilmesini tanımladı ve bu da bireysel canlı hücrelerde transpozisyonun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi8 (Şekil 1). TE sistemi Şekil 1A'da gösterilmiştir. TE, TnpA'nın tanıma ve eksizyon bölgeleri olan Sol Uç (LE) ve Sağ Uç (RE) kusurlu palindromik tekrarlar (IP'ler) ile çevrili transpozaz kodlama dizisi tnpA'yı içerir. tnpA, tet baskılayıcı tarafından bastırılan ve anhidrotetrasiklin (aTc)9 ile indüklenebilen promotör PLTetO1 kullanılarak ifade edilir. TE, mavi muhabir mCerulean3 11 için kurucu bir PlacIQ1 promotörü 10'un -10 ve -35 dizilerini böler. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, tnpA üretimi indüklendiğinde, TE, promotör resulanmasına yol açacak şekilde eksize edilebilir. Üretilen hücre mCerulean3 eksprese eder ve mavi floresan yapar. TnpA'nın N-terminüsü, sarı muhabir Venüs12 ile kaynaştırılır ve TnpA seviyelerinin sarı floresan ile ölçülmesine izin verir.
IS608 ve IS200/IS605 transpozon ailesinin diğer üyeleri de tipik olarak şimdiye kadar bilinmeyen fonksiyonun ikinci bir geni olan tnpB13'ü kodlar. TnpB proteinleri, genellikle sadece tnpB16'dan oluşan birkaç bakteri ve arkeal TE'ler14,15 tarafından kodlanan muazzam derecede bol fakat kusurlu bir şekilde karakterize edilmiş bir nükleaz ailesidir. Ayrıca, son zamanlarda yapılan çalışmalar, TnpB'nin çeşitli koşullar altında dsDNA veya ssDNA kırılmaları verecek CRISPR / Cas benzeri programlanabilir RNA rehberliğinde endonükleaz olarak işlev gördüğünü bularak TnpB'ye olan ilgiyi yenilemiştir17,18. Bununla birlikte, TnpB'nin transpozisyonun düzenlenmesinde hangi rolü oynayabileceği belirsizliğini korumaktadır. TnpB'nin IS608 transpozisyonu üzerindeki etkilerinin gerçek zamanlı görselleştirmesini gerçekleştirmek için, kırmızı floresan protein mCherry'ye N-terminal füzyonu ile TnpB'nin kodlama bölgesi de dahil olmak üzere transpozonun bir versiyonu oluşturuldu.
Kuhlman laboratuvarı19 tarafından gerçekleştirilen daha ayrıntılı toplu düzey çalışmaları tamamlayarak, transpozon aktivitesinin gerçek zamanlı görüntülenmesinin TnpB'nin veya diğer aksesuar proteinlerin transpozisyonel dinamikler üzerindeki etkisini nicel olarak nasıl ortaya çıkarabileceği burada gösterilmiştir. TnpB'yi mCherry ile kaynaştırarak, bireysel transpozisyonel olaylar mavi floresan ile tanımlanır ve TnpA (sarı floresan) ve TnpB (kırmızı floresan) ekspresyon seviyeleri ile ilişkilendirilir.

<table><tbody><tr><td>2 Ton Şeffaf Epoksi</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Anhidrotetrasiklin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>Argon Lazer</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>Mavi Filtre Küpü</td><td>Chroma</td><td>Örn: Z457/10X, Em: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Mikroskobu</td><td>Nikon,</td><td></td><td>Üretimi Durdurulan</td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Kutuları ve Doldurma Tepsileri, Hacim: 0,1 ila 10 &mikro; L, Uzunluk: 3,4 cm, 1,33 inç, PP (Polipropilen)</td><td>Eppendorf Kuzey Amerika Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Kutuları ve Doldurma Tepsileri, Hacim: 50 ila 1000 &mikro; L, Uzunluk: 7,1 cm, 2,79 inç, PP (Polipropilen)</td><td>Eppendorf Kuzey Amerika Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Demir Sülfat Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>Fiji (imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;LB Et Suyu, Miller (Granül)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kapaklı</td><td>Kaydırak Fisher Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Isıtıcı</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III Aşama</td><td>Öncesi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Filtre Küpü</td><td>Chroma Ex</td><td>: ET560 / 40X, Em: ET645 / 75M</td><td></td></tr><tr><td>Safir 561 LP Lazer</td><td>Tutarlı</td><td>1170412</td><td></td></tr><tr><td>Slayt, Mikroskop</td><td>Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>Tiamin Hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td> <td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 Lazer Lansmanı</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sarı Filtre</td><td>Küpü Chroma</td><td>Örn: Z514 / 10X, Em: ET535 / 30M</td><td></td></tr></tbody></table>

is200/is605 ailesi ile İlişkili tnpb'nin transpozon aktivitesi Üzerindeki etkilerinin gerçek zamanlı Ölçümü

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Burada, transpozisyona bağlı bir dizi floresan muhabir kullanarak canlı bakteri hücrelerinde transpoze edilebilir element aktivitesinin canlı, gerçek zamanlı görüntülenmesini gerçekleştirmek için bir protokol özetlenmiştir. Özellikle, TnpB aksesuar proteininin, IS200/IS605 transpoze edilebilir element ailesinin bir üyesi olan transpoze edilebilir element IS608'in aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için gerçek zamanlı görüntülemenin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. IS200 / IS605 transpoze edilebilir element ailesi, doğada bulunan en sayısız genden biri olan tnpB ile bağlantılı bol miktarda mobil elementtir. Sekans homolojileri, TnpB proteininin CRISPR / Cas9 sistemlerinin evrimsel bir öncüsü olabileceğini öne sürmektedir. Ek olarak, TnpB, Cas benzeri RNA rehberliğinde DNA endonükleazı olarak hareket ettiği gösterilerek yenilenmiş bir ilgi görmüştür. TnpB'nin IS608'in transpozisyon oranları üzerindeki etkileri ölçülmüştür ve IS608'in TnpB ekspresyonunun, TnpB ekspresyonundan yoksun hücrelere kıyasla ~ 5x artmış transpozon aktivitesi ile sonuçlandığı gösterilmiştir.

Canlı hücrelerdeki transpozon aktivitesini floresan mikroskobu ile görselleştirmenin bu yöntemi, toplu floresan ölçümlerinden daha düşük verime sahipken, bireysel canlı hücrelerde transpozon aktivitesinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Transpozon eksizyon olayları, mCerulean3 için promotörün yeniden sulandırılmasıyla sonuçlanır (Şekil 1), transpozon aktivitesi geçiren hücrelerin parlak mavi floresan ile tanımlanmasına izin verir (Şekil 2, TnpB +: Ek Film 1</strong...

Aksesuar protein TnpB'nin bireysel canlı Escherichia coli hücrelerinde transpozisyon dinamiklerini nasıl etkilediğini ölçmek için canlı gerçek zamanlı görüntüleme yapmak için bir protokol özetlenmiştir.

IS200/IS605 Ailesi ile İlişkili TnpB'nin Transpozon Aktivitesi Üzerindeki Etkilerinin Gerçek Zamanlı Ölçümü

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Bu protokol, toplu davranışa bakmak yerine, eksizyon istatistiklerini tek hücreli bir temelde ölçmemizi sağlar. Bu seviyede, bireysel hücrelerin zaman içindeki davranışlarını izleyebiliriz, TnpA ve TnpB seviyeleri de dahil olmak üzere, tüketim vergisi olmayan hücreler için TnpA ve TnpB seviyeleri, örneğin, tanımlanmış mutasyonel olayların büyüme hızı üzerindeki etkilerini ölçmemize izin verebilir. Bu yöntem, canlı hücre mutasyon dinamiklerini ölçmenin basit, düşük maliyetli bir yoludur.Genel yaklaşım, canlı hücre floresan görüntüleme gerektiren herhangi bir sistem için geçerlidir. Agarozu eritmek için mikrodalgada% 0.5 glikoz ve% 1.5 agaroz ile M63'ü kaynatarak bir slayt hazırlayın. Ortamın tamamen erimiş ve iyi karıştırılmış olduğundan emin olun.Antibiyotik ve indükleyiciler eklemeden önce karışımın 55 santigrat dereceye kadar soğumasını bekleyin. Çalışma tezgahına bir mikroskop slaytı yerleştirin. Bir slaytı birincisine dik olarak istifleyin.Alt ve üst kızak arasında bir slayt kalınlığına eşit bir boşluk olduğundan emin olun. Pipetle bir mililitrelik M63 agaroz karışımı arasındaki boşluğa yavaşça kaydırarak küçük bir jel kare oluşturur. Jel katılaştıktan sonra, çıkarmak için üst kaydırağı kaydırın.Agarose pedini bir tıraş bıçağı veya bıçakla kesin. Daha sonra pipet 2,5 mikrolitre bakteri kültürü ve kapağın üstüne kayar. Sürgü ile kapak kayması arasındaki boşluğu epoksi ile kapatın.Epoksinin kurumasına ve hücrelerin 37 santigrat derecede bir saat boyunca agaroz pedine yerleşmesine izin verin. Hazırlanan numuneyi floresan mikroskop üzerine ısıtılmış ve 37 santigrat derecede tutulan bir ortama yerleştirin. Her dalga boyu için, minimum floresan içeren görüş alanını bulun.Farklı dalga boylarında ve düzenli zaman aralıklarında bir ızgaradaki görüntüleri almak için bir protokol ayarlayın. Transpozon eksizyon olayları, mCerulean3 için promotörün yeniden yapılandırılmasıyla sonuçlanır ve transpozon aktivitesi geçiren hücrelerin parlak mavi floresan ile tanımlanmasına izin verir. TnpB transpozon eksizyon oranını arttırır.Aksesuar protein TnpB'yi eksprese eden hücreler, TnpB-negatif hücrelere kıyasla dört ila beş kat daha yüksek transpozon aktivitesi seviyeleri yaşarlar. TnpB-pozitif hücrelerde, transpozon eksizyon olayları geçiren hücreler, genel popülasyondan daha yüksek mCherry TnpB ekspresyon seviyelerine sahiptir. Dahası, eksizyon olayları geçiren hücreler için, TnpB-pozitif hücreler, genel popülasyonun sarı floresansından daha yüksek olan TnpB-negatif hücrelerden sadece marjinal olarak daha yüksek venöz TnpA-transpozaz seviyelerini eksprese eder.Mücadele edilecek en muhtemel yer, deney için hücre kültürünün hazırlanmasıdır. Hücrelerin üstel faza büyütüldüğünden ve slaytın uygun sayıda hücreyle aşılandığından emin olmalısınız. Slaytı kapatırken kabarcıklara dikkat etmeyi unutmayın, böylece agaroz jeli kurumaz.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Kazi, M.I., vd. al., Yüksek Verimli Dizileme için Gram-Negatif Bakterilerde Transpozon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, kanamisin direncine dayalı olarak transpozon eklemeleri taşıyan Gram-negatif alıcı bakterilerin seçimini, miktarını ve korunmasını göstermektedir.

Gram-Negatif Bakterilerin Genomik Transpozon Eklemeleri ile İzolasyonu

Burada, ekrana yüksek yoğunluklu ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için mini-transpozon himar1 mariner dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar izole edilmesi ve prototipik Pseudomonas aeruginosa'nın PAO1 in yeni alginat regülatörleri belirlemek.

Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emKullanma&gt; Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon dolayımlı mutagenez

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Burada, yetişkin yenilenen zebra balığı kuyruk yüzgecinde dokuya özgü gen ekspresyonu elde etmek için TetON sistemini kullanmak için iş akışını özetliyoruz.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

Burada, bir transposon-aracılı rasgele ekleme kodlamayan DNA öğesinin gücünü en iyi kromozom konumunu gidermek için kullanıldı.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

Burada sunulan Escherichia coli veya bakteriyel konjugasyon kullanarak Shigella flexneri yüksek yoğunluklu transposon ekleme kütüphane oluşturmak için basit bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bir transposon rastgele genomik ekleme tarafından bakterilerde benzersiz mutantlar, yüz binlerce topluluğu oluşturulmasına izin verir.

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Biz burada transposon mutagenesis tanımlamak ve transposon leptospiral mutantlar dokularda hamster bir meydan okuma sonra ölçmek için yüksek üretilen iş sıralama ile birleştirir bir tekniğini tanımlamak. Bu iletişim kuralı için hayatta kalma ve hayvanlar yayılmasında ekran mutantlar için kullanılabilir ve vitro çalışmalar için de uygulanabilir.

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Bu, Burkholderia faydalı bir symbiont'taki aday böcek kolonizasyon faktörlerini tanımlamak için uyarlanmış bir yöntemdir. Böcek konağı transposon mutajensis yoluyla oluşturulan rastgele bir mutant kütüphanesi ile enfektedir ve kolonileşmeden sonra kütüphane karmaşıklığı in vitroyetiştirilen bir kontrol ile karşılaştırılır.

Lagria villosa Böcekleri burkholderia gladioli Symbiont Bakteriyel Kolonizasyon Faktörlerini Elucidate için Bir Araç Olarak Transposon-ekleme Dizileme

Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile Escherichia coli hücrelerinde TnpB'nin transposon aktivitesini nasıl artırdığını. Bu yöntem, tek hücre düzeyinde eksizyon istatistiklerini ölçerek genetik dinamikleri anlamanıza yardımcı olur.

IS200/IS605 Ailesi ile İlişkili TnpB'nin Transpozon Aktivitesi Üzerindeki Etkilerinin Gerçek Zamanlı Ölçümü

Daha fazla video keşfet