Name: Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Keşfedin Z-REX yöntemiyle zebra balığı embriyolarında reaktif küçük molekül sinyalizasyonunu ve bağışıklık hücresi yanıtlarını analiz etmeyi. Bu teknik kanser tedavileri için hedefli ilaç geliştirmede yüksek hassasiyet sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman: Novartis FreeNovation, NCCR ve EPFL.

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

Keşfi REX teknolojileri tarafından sağlanan izoforma özgü küçük moleküllü kinaz inhibitörleri patent başvurusu için dosyalanmıştır

Bu protokolde açıklanan Z-REX, canlı balıklarda elektrofil-hedef çifti araştırması ve sinyal yolu dekonvolüsyonu için sağlam bir strateji göstermektedir. Yakınlığa yönelik dağıtım, elektrofilik bileşik tedavisinin dozajını ve mekansal kontrolünü sağlar. Konuşlandırılan elektrofilin suprafizyolojik konsantrasyonlarının sıklıkla hedef dışı sorunlara yol açtığı geleneksel bolus dozlama yöntemlerinden farklı olarak, sisteme salınan nispeten küçük elektrofil miktarı Z-REX'i büyük ölçüde invaziv olmayan hale getirir. Zebra balığı embriyolarında 0.1-6 μM Ht-PreHNE (alkin) kullandık ve sonuçlar tedavinin embriyo gelişimine zararlı olmadığını gösterdi11.
Z-REX prosedürü genellikle kültürlenmiş hücrelerde elektrofil algılayıcı proteinleri taramak / incelemek için kullanılan bir teknik olan T-REX'ten daha uzundur. Deneyin amacının elektrofil-hedef etkileşimlerini taramak olduğunu varsayalım; öncelikle kültürlenmiş hücrelerde T-REX ile kapsamlı tarama yapılmasını ve in vivo validasyon ve fenotipik/yolak analizi için Z-REX kullanılmasını öneriyoruz. Hücre kültürü ile karşılaştırıldığında, Z-REX gerçekleştirmek için gerekenler, T-REX'in gerektirdiği biyokimyasal deneysel becerilere ek olarak temel balık yetiştiriciliği teknikleridir. Z-REX için tipik bir zaman dilimi (balık geçişinden ışığa indüklenebilir elektrofil dağıtımına kadar) 2-3 gündür, bu da transfekte canlı hücreler üzerinde bir T-REX deneyi için tipik süreden 1 günden fazla değildir. Fenotipik analiz için canlı görüntüleme, ışık aydınlatmasından 2-10 saat sonra yapılabilir; aşağı çekme testi için biotin-azide ile tıklama bağlantısı 3 gün sürer; Transkripsiyonel yanıtın tahlili için qRT-PCR 3 gün sürer; IF boyama 5 gün sürer. Bu adımlar kabaca hücre kültürü eşdeğerlerine benzer, ancak verilerin yorumlanması balık fizyolojisi ve muhabir suşlarının anlaşılmasını gerektirir.
Çok değişkenli bir prosedür12 olarak, Z-REX'in sonuçlardaki belirsizlikleri dışlaması için birkaç kontrol grubu gereklidir (Şekil 1D). Yaygın kontrol grupları şunlardır: (1) Yalnızca DMSO/araç tedavisi; (2) prob tedavisi, ancak ışık aydınlatması olmadan; (3) ışık aydınlatması, ancak prob tedavisi olmadan; (4) Halo ve POI'nin ayrı ayrı ifade edildiği, böylece yakınlık dağıtımının ablatlandığı P2A-bölünmüş yapı; ve (5) önceki çalışmalarda kullandığımız Akt3 (C119S)6 ve Keap1 (C151S, C273W, C288E)5 gibi elektrofil algılama kalıntıları mutasyona uğramış / mutasyona uğramış hipomorfik mutantlar.
Aşağı akış testleri batı leke analizini içeriyorsa, hasattan önce deyolking yapılmalıdır. Yumurta sarısı proteinleri, lizat konsantrasyonu değerlendirmelerinin doğruluğunu azaltır ve spesifik olmayan antikorlara bağlanabilir. Canlı balık görüntüleme veya tam montajlı IF boyama yaparken, yumurta sarısı kesesinde, muhtemelen yumurta sarısı kesesindeki otofloresan proteinlerden veya antikorların kendilerinin spesifik olmayan bağlanmasından kaynaklanan spesifik olmayan floresan sinyalleri de gözlemledik. Otofloresan sinyali sinyale müdahale ederse, yumurta sarısı kesesini nicelemeden çıkarmanızı veya farklı bölgeleri ayrı ayrı ölçmenizi öneririz. Dekorinasyon, canlı balık görüntüleme ve tüm montajlı IF boyama testi için gereklidir. Koryon görüntülemeye ve daha sonra nicelleştirme / hücre sayımına müdahale edebilir. Bununla birlikte, dekorinasyon sadece 1 dpf'den daha eski embriyolar için geçerlidir; blastülasyon/gastrulasyon/segmentasyon aşamalarındaki genç embriyolar dekoryona edilemeyecek kadar kırılgandır.
Burada açıklanan Z-REX protokolü, mRNA güdümlü ektopik POI ekspresyonuna dayanmaktadır. Prosedür, transgenik balık hatlarının kullanılmasına/üretilmesine kıyasla hızlıdır. mRNA güdümlü ekspresyon her yerde bulunur ve geçicidir ve bu protokolde kullanılan mRNA'lar için en az 2 gün sürer. Bununla birlikte, ifade süresinin diğer durumlarda değişmesi muhtemeldir. Bu nedenle, bu yaklaşım, birkaç yüksek verimli / yüksek içerikli tahlille uyumlu, belirli bir elektrofil etiketleme olayının etkilerine yönelik hızlı ve daha küresel bir araştırma penceresi sağlar. Belirli dokularda stabil Halo-POI ekspresyonuna sahip transgenik çizgiler de Z-REX11 ile uyumludur. Bu tür çizgiler, daha kesin bir soru sorulması gerektiğinde, örneğin belirli bir organdaki bir fenotipin hücre kültürü verilerinden tahmin edildiğinde veya mRNA enjeksiyon deneylerinden tarama, belirli bir organın bir elektrofil etiketleme olayına duyarlı olduğunu öngördüğünde en iyi şekilde kullanılır. Z-REX yoluyla kalbe özgü bir antioksidan yanıt indüksiyonu, önceki yayınımız11'de Tg (gstp1: GFP; DsRed-P2A-myl7: Halo-TeV-Keap1) balıkları kullanılarak gösterilmiştir. Z-REX'i 2 dpf'den daha yaşlı transgenik balıklarda da yapmak mümkün olabilir.

Sayısız hücresel sinyal olayı, küçük reaktif moleküller (hücrede endojen olarak üretilen veya ilaçlar gibi ksenobiyotikler / ksenometabolitler) ile protein hedefleri arasındaki reaksiyonları içerir. Birçok durumda, bu tür kovalent bağlanma olaylarının substokiyometrik bir seviyesi, hücresel yanıtları tetikleyebilir, bu da örneğin gelişim, metabolizma, apoptoz ve / veya bağışıklık tepkisinde değişikliklere yol açabilir1. Bununla birlikte, spesifik bağlanma olaylarını fenotipik sonuçlarına bağlayarak etki tarzını (MOA) yapıbozuma uğratmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Reaktif türlerin yüksek konsantrasyonlarının uygulanmasını içeren geleneksel bolus dozlama yöntemleri, genellikle çok sayıda proteinin modifiye edilmesine ve model organizma2'ye aşırı toksisiteye neden olur. Bu koşullar ideal olmaktan uzaktır. Hücre kültüründeki bu sorunları, T-REX (hedeflenebilir reaktif elektrofiller ve oksidanlar)3 olarak adlandırılan doğal bir hücresel bağlamda hassas lokalize elektrofil dağıtımı kullanarak çözmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Aradan geçen yıllarda, odak noktası, dönüştürülmemiş hücrelerde belirli hücresel bağlamlarda proteinleri inceleme fırsatı veren tüm organizmalardaki deneylere yöneldi. Bu nedenle, tekniği Danio rerio embriyo modelleri de dahil olmak üzere çeşitli modellerle uyumlu olacak şekilde genişlettik. Burada Z-REX (reaktif elektrofilleri ve oksidanları hedef alan zebra balığı) sunulmuştur (Şekil 1).
Z-REX'i anlamak için, bu makale ilk olarak REX teknolojilerini ve bunların altında yatan kavramları sunmaktadır. Özünde, bu teknikler, doğal elektrofillerin mekansal zamansal hassasiyetle in vivo olarak nasıl yerel olarak üretildiğini taklit ederek endojen fizyolojik reaktif elektrofilik türlerin (RES) sinyalini modellemektedir. İlgilenilen protein (POI), Halo'ya bir füzyon yapısı olarak ifade edilir; ikincisi, fotokafesli RES'i taşıyan doku geçirgen ve inert probu 1: 1 stokiyometride sabitler. Böyle bir endojen RES, Ht-PreHNE probunda fotokaged olan 4-hidroksinonenaldir (bundan böyle HNE olarak anılacaktır). Birçok durumda, HNE ile temelde aynı biyolojik özelliklere sahip, ancak tıklama kimyası ile etiketlenebilen HNE'nin alkin işlevli bir versiyonunu [yani, HNE (alkin)] kullanıyoruz. Halo ile reaktivite için bir kloroalkan ile de işlevselleştirilen prob, Ht-PreHNE (alkin) olarak adlandırılır. Halo-POI füzyonunun kompleksi ve bu şekilde oluşan prob, RES'in UV ışığı ile ışınlandıktan sonra kaynaşmış POI'ye proksimal olarak verilmesini sağlar. POI, serbest bırakılan RES ile hızlı bir şekilde reaksiyona girerse, POI'nin RES ile kovalent olarak etiketlenmesi, kinetik olarak ayrıcalıklı sisteinleri tanımlamamıza izin verir.
Z-REX, REX teknolojilerinin yukarıda belirtilen avantajlarını alır ve bunları canlı balıklarda belirli sinyal yollarını incelemek için geniş çapta uygular. Bu protokol, zebra balığı (D. rerio) için optimize edilmiştir, çünkü bunlar gelişim sırasında şeffaf olan genetik olarak izlenebilir omurgalı organizmalardır ve bu nedenle REX teknolojileri gibi opto-kimyasal / genetik teknikler için idealdir. Bununla birlikte, benzer bir stratejinin diğer genetik olarak izlenebilir balık türleri üzerinde de iyi çalışması muhtemeldir, çünkü yöntemin geniş uygulanabilirliği, lipit kaynaklı elektrofil (LDE) dağıtımının psödo-moleküler mekanizmasından kaynaklanmaktadır. Gerçekten de, prosedür oldukça biyouyumludur, çünkü balıklar Z-REX fotokafesli-elektrofil [örneğin, Ht-PreHNE (alkin)] ile en az 48 saat boyunca gelişim üzerinde gözle görülür bir etki yaratmadan tedavi edilebilir. Benzer bir protokol C. elegans 4,5'te de işlev görür.
Protokol ilk olarak, embriyonik zebra balığı modellerinde, döllenmeden 1-1.5 gün sonra (dpf) doğal olmayan bir Halo-POI füzyon yapısının geçici bir ekspresyonunu üretmek için mRNA enjeksiyonunun kullanımını açıklar. Bu, ektopik proteinin belirli dokularda veya lokalizasyonlarda değil, balık içindeki hücrelerin çoğunda (bundan böyle 'her yerde 'her yerde bulunan' olarak anılacaktır) ekspresyonuyla sonuçlanır; Bununla birlikte, veriler belirli durumlarda hücreye özgü etkilerin gözlenebileceğini göstermektedir. Enjeksiyondan sonra, embriyolar döllenme sonrası 30.5 saate kadar (hpf) probun düşük konsantrasyonu [0.3-5 μM Ht-PreHNE (alkin)] ile inkübe edilir. Daha sonra, kullanıcı tarafından öngörülen bir zamanda, RES'in balık içindeki POI'ye verilmesi, 2-5 dakika boyunca fotouncaging ile gerçekleştirilir. RES'in fotounksajını takiben, önümüzdeki 2-10 saat içinde çeşitli aşağı akış fenotipik tahliller yapılabilir: 1) muhabir hatlarının canlı görüntülenmesi (Şekil 2A); 2) batı leke analizi ile hedef etiketleme değerlendirmesi (Şekil 3); 3) transkriptomik analiz (Şekil 4); veya 4) tam montajlı immünofloresan (Şekil 5).
Muhabir hatlarının canlı görüntülenmesine bir örnek olarak, Z-REX, belirli bir elektrofil sensörü POI'sinin (yani Keap1) RES modifikasyonunun sırasıyla nötrofil ve makrofaj seviyelerini nasıl azalttığını ölçmek için balık hatlarının, Tg (lyz: TagRFP) ve Tg (mpeg1: eGFP) canlı görüntülemesi ile birlikte gösterilmiştir. Bununla birlikte, daha önce POI etiketlemesinin ve T-REX çalışmalarından elde edilen sonuç yol sinyalinin, birkaç protein için Z-REX kullanılarak çoğaltılabileceğini gösterdik: Akt3 6, Keap17 ve Ube2v26. Genel olarak, Z-REX ile bilim adamları, POI'lerin RES tarafından kovalent modifikasyonunun sonuçlarını, birkaç karmaşık redoks yolu bağlamında inceleyebilirler. Bu teknik, kovalent ilaç tasarımı ve yeni ilaç mekanizmaları için hedefleri ve fonksiyonel kalıntılarını daha bağlamsal olarak alakalı bir bütün hayvan modelinde belirlemek için hazırlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri kapları</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>2 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>%30 Akrilamid ve bis-akrilamid çözeltisi</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>All Blue Prestained Protein Standartları</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-dPEG11-azid</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Boya</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal tüpler</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA içermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu (TBTA)</td> <td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-fare-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Eşek anti-sıçan-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>ECL substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>ECL-Plus substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Uçtan uca döndürücü</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Enstrüman A.Ş.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Floresan stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Forseps (künt)</td><td>keskin</td><td>forsepsleri körelterek kendi kendine yapılan (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td>Forseps (keskin)Fine Science Tools Dumont #5, 11252-40 Jel yükleme ucu Fisher 02-707-181 Jel/leke görüntüleyici Vilber <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Fusion FX görüntüleyici</td><td></td></tr><tr><td>Cam boncuklar</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>Cam sahne mikrometresi</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile etkisiz hale getirilmiş FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Isıtmalı ultrasonik banyo</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek kapasiteli streptavidin agaroz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE alkin probu</td><td>kendi kendine yapılmış</td><td>-</td><td>Parvez, S. ve ark. Canlı hücrelerde T-REX isteğe bağlı redoks hedeflemesi. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Görüntüleme plakası (canlı embriyolar için %10 HBSS tamponu)</td><td></td><td></td><td>Petri kabı ile yapılmıştır ve %10 HBSS tamponunda %2 agaroz</td></tr><tr><td>Görüntüleme plakası (PBS, formaldehitle sabitlenmiş embriyolar için)</td><td></td><td></td><td>Petri kabı ile yapılmıştır ve PBS'de %2 agaroz</td></tr><tr><td>Enjeksiyon plakası</td><td></td><td></td><td>Mikroenjeksiyon kalıbı, Petri kabı ve %10 HBSS tamponu</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr> <tr><td>içinde %2 agaroz ile yapılmıştırMetanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon kalıbı</td><td>Uyarlanabilir Bilim Araçları</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mikro enjeksiyon için mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop ışık kaynağı</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Transkripsiyon Kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti- ve beta;-aktin-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>Fare anti-HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>Çok modlu okuyucu</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>Nükleik asit agaroz jel elektroforez cihazı</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Sistemleri</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özelleştirilmiş: (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>Turuncu G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp;</td><td>kendi kendine klonlanmış-Prof</td><td></td><td>. Yimon AYE'nin EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8'deki grubundan temin edilebilir Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td>kendinden klonlu-Prof</td><td></td><td>. Yimon AYE'nin EPFL Pneumatic PicoPump'taki grubundan temin edilebilir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>WPI SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Protein elektroforezi ekipmanı ve malzemeleri</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-aktif Kaspaz-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Rat anti-HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF ve WB)</td></tr><tr><td>Rat anti-RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT rekombinant ribonükleaz inhibitörü</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap RNA dekontaminasyon solüsyonu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan Çalkalayıcı</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III ters transkriptaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-Butanol</td><td>Sigma</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV proteaz (S219V)</td> <td>kendi kendine yapılan</td><td></td> <td>Parvez, S. ve ark. Canlı hücrelerde T-REX isteğe bağlı redoks hedeflemesi. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>Zebra Balığı Uluslararası Kaynak Merkezi (ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>Zebra Balığı Uluslararası Kaynak Merkezi (ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Analytik Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Glisin max (soya fasulyesi)</td> <td>Sigma</td><td>T9003'ten</td><td></td>tripsin inhibitörü</tr><tr><td>Tween 20 Fisher</td><td></td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>365 nm ışıklı UV lambası</td><td>Spektroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>UV ölçer&nbsp;</td><td>Spectroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Bilimsel Endüstrileri, Inc.</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Transfer ekipman ve malzemeleri</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot veya Criterion Blotter&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Evde zebra balığı yetiştiriciliği ve yetiştirme ekipmanları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirkonya boncukları</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

larva zebra balıklarında hedef sinyalizasyon yanıtlarının İzlenmesi - z-rex elektrofilik İlaçların ve metabolitlerin hassas mekanizmalarının maskesini Çıkarır

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reaktif metabolitler ve ilgili elektrofilik ilaçlar, incelenmesi en zor küçük moleküller arasındadır. Bu tür moleküllerin etki tarzını (MOA) yapıbozumuna uğratmaya yönelik geleneksel yaklaşımlar, deneysel örneklerin belirli bir reaktif türün fazlalığı ile toplu muamelesinden yararlanır. Bu yaklaşımda, elektrofillerin yüksek reaktivitesi, proteomun zamana ve bağlama bağlı bir şekilde ayrım gözetmeksizin etiketlenmesini sağlar; Redoksa duyarlı proteinler ve süreçler de dolaylı olarak ve sıklıkla geri dönüşü olmayan bir şekilde etkilenebilir. Sayısız potansiyel hedefin ve dolaylı ikincil etkilerin böyle bir zemininde, fenotipi spesifik hedef katılımına bağlamak karmaşık bir görev olmaya devam etmektedir. Larva zebra balıklarında kullanılmak üzere uyarlanmış isteğe bağlı bir reaktif-elektrofil dağıtım platformu olan reaktif elektrofilleri ve oksidanları (Z-REX) hedefleyen zebra balığı, elektrofilleri aksi takdirde bozulmamış canlı balık embriyolarında belirli bir ilgi alanına (POI) ulaştırmak için tasarlanmıştır. Bu tekniğin temel özellikleri, dozaj, kemotip ve mekansal olarak kontrol edilen hassas elektrofil dağıtımı ile birlikte düşük bir invazivlik seviyesini içerir. Bu nedenle, benzersiz bir kontrol paketi ile birlikte, bu teknik, hayvanların reaktif elektrofillere ve pleiotropik elektrofilik ilaçlara kontrolsüz toplu maruz kalmasını takiben gözlemlenen, hedef dışı etkilerden ve sistemik toksisiteden kaçınır. Z-REX'ten yararlanan araştırmacılar, bireysel stres tepkilerinin ve sinyal çıktılarının, bozulmamış canlı hayvanlarda fizyolojik koşullara yakın koşullar altında, belirli bir POI ile spesifik reaktif ligand etkileşiminin bir sonucu olarak nasıl değiştiğinin anlaşılmasında bir dayanak noktası oluşturabilirler.

Z-REX ile tedavi edilen transgenik nötrofil / makrofaj muhabir balıkları, Tg (lyz: TagRFP) ve Tg (mpeg1: EGFP) canlı görüntüleme.Keap1 HNEilasyon yoluyla nötrofil/makrofaj apoptozunun indüksiyonu. (Ayrıca bakınız Şekil 2). Keap1'in elektrofil etiketlemesinin nötrofil ve makrofaj seviyeleri üzerindeki etkisi, Tg (lyz: TagRFP) veya Tg (mpeg1: EGFP) 'den türetilen heterozigot transgenik embriyoların Halo-Keap1'i kodlayan mRNA ile enjekte edilmesi ve daha sonra Ht-PreHNE (alkin) ile muamele edilmesiyle değerlendirildi. Adım 6.1-aşağı akış testi için prosedürler izlendikten sonra Seçenek 1-HNE (alkin) serbest bırakıldı ve Keap1 etiketlendi. Nötrofil ve makrofaj düzeyleri sırasıyla Tg(lyz:TagRFP) ve Tg(mpeg1:eGFP) muhabir hatlarının canlı görüntülenmesiyle değerlendirildi. Her iki hücre tipinin seviyesi, HNE'nin Keap1'e verildiği Z-REX tedavisinden sonra% 30-40 oranında azalmıştır. Aksine, Z-REX teknik kontrol gruplarında [ışık ve Ht-PreHNE (alkin), tek başına ışık veya tek başına Ht-PreHNE (alkin) olmadan] nötrofil veya makrofaj kaybı görülmedi (Şekil 1D ve Şekil 2A-D).
Nötrofil / makrofaj apoptozunun indüksiyonu, Z-REX yoluyla Keap1'e başarılı HNE dağıtımını gösterdi. Yol analizi ve apoptoz mekanizması ile ilgili detaylar yayınlanmıştır5. HNE'nin (alkin) hedef dışı etkilerini hesaba katmak için çeşitli kontroller kullanılmıştır. (1) Aynı deney koşulları altında, Halo-TeV-Keap1 mRNA yerine, embriyolara Halo-P2A-Keap1 mRNA enjekte edildi. P2A bağlayıcı, Halo ve Keap1 proteinlerinin bağımsız olarak ifade edilmesine izin verdi. Bu senaryoda, Halo'dan salınan HNE (alkin), artık Halo'ya yakın olmadığı için Keap1'i etiketleyemedi (Şekil 1D); Bu nedenle, apoptoz sinyal yolu tetiklenmedi. Bu grupta makrofaj veya nötrofil düzeylerinde herhangi bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 2A,B). (2) Aynı deneysel koşullar, HNE'ye (alkin) cevap vermeyen bir Keap1 mutantı olan Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) kodlayan mRNA kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Şekil 1D). Makrofaj veya nötrofil düzeylerinde herhangi bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 2G,H).
Biotin azide tıklama kuplajı ve biyotin aşağı çekme testi. Hedef etiketleme değerlendirmesi. (Ayrıca bakınız Şekil 3). Hedef etiketleme değerlendirmesi, Halo-TeV-Keap1-2xHA (Halo-POI füzyon yapısı) veya Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (Halo ve Keap1'in kaynaşmadığı P2A-bölünmüş yapı; Şekil 1D). Etiketli Keap1 proteini sadece füzyon proteinini ifade eden grupta aşağı çekildi ve Z-REX (üst anti-HA lekesinde ikinci şerit) ile muamele edildi, ancak diğer kontrol gruplarında (mRNA enjeksiyonu yok, Z-REX olmadan füzyon yapısı veya P2A-bölünmüş yapı) tedavi edilmedi. Sonuçlar, HNE'nin (alkin) Keap1'e başarıyla teslim edildiğini ve modifiye Keap1'in daha sonra tıklama reaksiyonu yoluyla biyotin ile konjuge edildiğini ve biyotin etiketli Keap1'in streptavidin reçinesi tarafından aşağı çekildiğini göstermektedir.
Transkripsiyonel analiz. RNA-seq ve qRT-PCR. (Ayrıca bakınız Şekil 4). Z-REX tedavisi sonrası transkripsiyonel değişiklik RNA-seq ve qRT-PCR ile değerlendirildi. RNA-seq'te, Z-REX'ten sonra immün ile ilgili birkaç gen aşağı regüle edildi. Buna karşılık, Z-REX'ten sonra birçok antioksidan yanıt (AR) ile ilişkili gen, Keap110 üzerinde HNEylation üzerine Keap1-Nrf2-AR yolunun indüksiyonundan kaynaklanan yukarı regüle edilmiştir (Şekil 4A). qRT-PCR analizinde, immün ile ilişkili üç gen (lyz, mpeg1.1 ve coro1a) analiz edildiğinde benzer sonuçlar bulunmuştur (Şekil 4B). İlgili genlerin yukarı ve aşağı regülasyonu, Keap1 HNEilasyonunun aracılık ettiği yolakların başarılı bir şekilde indüklendiğini göstermiştir.
Tam montajlı (ko-) immünofloresan boyama testi ve kolokalizasyon analizi. (Ayrıca bakınız Şekil 5). Eksojen Halo-TeV-Keap1-2xHA ve Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA ekspresyonu tam montajlı immünofloresan (IF) boyaması ile değerlendirildi (Şekil 5A,B). P2A-split-construct, TeV-fusion-construct'tan iki kat daha fazla HA etiketine sahipti, bu da P2A-split-construct-mRNA-enjekte edilen grupta diğerinden iki kat daha yüksek bir anti-HA sinyaline karşılık geliyor ve bu da iki yapının ekspresyon seviyesinin benzer olduğunu gösteriyor (Şekil 5C). Halo-TeV-Keap1 (wt) ve Halo-TeV-Keap1'in (C151S, C273W, C288E) ekspresyon seviyeleri de anti-Halo ile sondalama yaparken benzer bulunmuştur (Şekil 5D, E). Z-REX ile tedavi edilen Tg'de (lyz:TagRFP) nötrofillerin ve aktif kaspaz 3'ün kolokalizasyonu, anti-RFP ve anti-aktif-Kaspaz 3 ile birlikte immünoboyama ile gözlendi (Şekil 5F). Aktif Kaspaz 3, apoptoz olaylarının bir göstergesidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> Şekil 1: Z-REX iş akışı. (A,B) 1-4 hücre evreli zebra balığı embriyosuna Halo-POI (örneğin, Halo-Keap1) kodlayan (morfolino ve) mRNA enjekte edilir. Enjekte edilen embriyolar daha sonra bir HaloTag ligandından oluşan bir prob ve B'deki Ht-PreHNE (alkin) gibi bir alkin fonksiyonel grubu ile eklenmiş bir fotokaged elektrofil ile tedavi edilir. Fazla miktarda probu çıkardıktan sonra, embriyo ilgilenilen elektrofili serbest bırakmak için ışığa maruz kalır [örneğin, HNE veya analogu, HNE (alkin)]. Aşağı akış analizi, verili/kullanıcı tanımlı bir zaman noktasında gerçekleştirilir. (C) Farklı lipit türevli elektrofillere (LDE) uygulanabilen Ht-PreLDE probunun tasarımı ve mekanizması. (D) Z-REX için negatif/teknik kontrol grupları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> Resim 2: Z-REX'e tabi tutulan transgenik nötrofil/makrofaj muhabir balıklarının canlı görüntülemesi. Z-REX aracılı Keap1 HNEylation, nötrofil/makrofaj apoptozunu indükler. (A) Halo-TeV-Keap1 (füzyon yapısı) veya Halo-P2A-Keap1 (bölünmüş yapı) ifade eden ve negatif kontrol koşullarına maruz kalan Tg(lyz:TagRFP ) balıklarının temsili görüntüleri [tedavi yok, tek başına ışık veya tek başına Ht-PreHNE (alkin) veya Z-REX]. Embriyo yaşı: 36 hpf. (B) A'daki nötrofil seviyelerinin kantitasyonu. (C) Z-REX tedavisi olan veya olmayan Halo-TeV-Keap1'i ifade eden Tg(mpeg1:eGFP) balıklarının temsili görüntüleri. Embriyo yaşı: 34 hpf. (D) C'deki makrofaj seviyelerinin kantitasyonu. (E,F) Z-REX tedavisinden sonra (E) nötrofil ve (F) makrofaj seviyelerinin zaman boyu ölçümü. (G) HNE algılama yeteneğine sahip olmayan bir mutant olan Halo-TeV-Keap1 (WT) veya Halo-TeV-Keap1'i (C151S, C273W, C288E) ifade eden balıklardaki A'dakine benzer bir deney. (H) G'deki nötrofil seviyelerinin kantitasyonu. Ölçek çubukları: 500 μm. Tüm grafikler ortalama ± SEM ile sunulmuştur. p değerleri tek yönlü ANOVA (mavi) ve iki kuyruklu Student t-testi (siyah) ile hesaplanmıştır. Bu rakam Poganik ve ark.7'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> Şekil 3: Biotin pull-down testi. Halo-TeV-Keap1-2XHA veya Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA eksprese eden WT embriyoları Z-REX veya ilgili negatif kontrol koşulları ile tedavi edildi (bu durumda prob tedavisi yok). Hasattan sonra, embriyolar lize edildi ve biyotin aşağı çekme testinden önce TeV proteaz ile tedavi edildi. Sonuçlar batı lekelenmesi ile analiz edildi. Bu rakam Huang ve arkadaşlarından değiştirilmiştir. Z-REX: Reaktif elektrofilleri dokuya özgü veya her yerde ifade edilen spesifik proteinlere çobanlık yapmak ve larva balıklarında ortaya çıkan fonksiyonel elektrofil kaynaklı redoks tepkilerini kaydetmek. Bu rakam Huang ve arkadaşlarından değiştirilmiştir.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> Şekil 4: Transkripsiyonel analiz. (A) Z-REX-ile tedavi edilen embriyoların RNA-seq sonuçları. İstatistiksel olarak anlamlı diferansiyel olarak eksprese edilen (SDE) genler vurgulanmıştır. Bağışıklık ile ilişkili SDE genleri kırmızı renktedir. Antioksidan yanıt (AR) ile ilişkili genler yeşil renktedir. Diğer SDE genleri mavi renklidir. Tüm p değerleri CuffDiff ile hesaplandı. (B-D) A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 ve (D) coro1a'dan üç immünite ile ilişkili SDE geni qRT-PCR ile daha fazla analiz edildi ve sadece Z-REX ile tedavi edilen embriyolar bu transkriptlerin baskılandığını gösterdi. Tüm grafikler ortalama ± SEM ile sunulmuştur. p değerleri tek yönlü ANOVA (mavi) ve iki kuyruklu Student t-testi (siyah) ile hesaplanmıştır. Bu rakam Poganik ve ark.7'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> Şekil 5: Tam montajlı immünofloresan boyama testi . (A,B) (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA veya (B) Anti-HA ile immün boyalı Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA eksprese eden embriyoların temsili görüntüleri ve AlexaFluor568 ile konjuge edilmiş sekonder antikor. mRNA enjekte edilen balıklar, yaş uyumlu enjekte edilmemiş balıklarla karşılaştırıldı. (C) (A,B)'deki anti-HA sinyalinin nicelleştirilmesi. (D) Halo-TeV-Keap1 (WT) veya Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) eksprese eden embriyoların anti-Halo ve AlexaFluor647 ile konjuge edilmiş sekonder antikor ile immün boyanmış temsili görüntüleri. mRNA enjekte edilen balıklar, yaş uyumlu enjekte edilmemiş balıklarla karşılaştırıldı. (E) Anti-Halo sinyalinin D cinsinden nicelleştirilmesi. p değerleri iki kuyruklu Student t-testi ile hesaplandı. (F) Z-REX'e maruz kalan Tg (lyz: TagRFP) embriyoları, anti-RFP ve anti-aktif Kaspaz 3 ve ilgili florofor konjuge sekonder antikorlarla birlikte immünoboya tabi tutuldu. Beyaz kutu büyütülmüş alanı işaretler. Beyaz oklar, nötrofillerin ve aktif Kaspaz 3'ün kolokalizasyonlarını gösterir. Ölçek çubukları: 500 μm. Tüm grafikler ortalama ± SEM ile sunulmuştur. Bu rakam Poganik ve ark.7'den değiştirilmiştir. ve Huang ve ark.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan tamponların listesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Reaktif elektrofilleri ve oksidanları (Z-REX) hedefleyen zebra balığı, reaktif küçük moleküllü sinyalizasyonun araştırılması için kimyasal biyoloji tabanlı bir yöntemdir. Bu teknik, farklı gelişim aşamalarındaki canlı balıklara uygulanabilir. Burada, zebra balığındaki standart tahlilleri sinyal yolu analizi için Z-REX ile birleştiriyoruz.

Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Ve böylece Z-REX'ten yararlanan araştırmacılar, Zebra balığı larvalarında yakın fizyolojik koşullara ilgi duyan belirli bir proteinle etkileşime giren belirli bir reaktif ligand'a yanıt olarak bireysel sinyal tepkilerinin nasıl değiştirildiğini sorgulayabilirler. Toplu doz reaktif küçük moleküller gibi konvansiyonel yöntemler, hedeflere ve toksisiteye neden olur ve ligand hedef özgüllüğü üzerinde hiçbir kontrol sağlamaz. Z-REX, belirli bir ligand hedef etkileşimini yüksek uzaysal zamansal hassasiyete sahip belirli bir fenotiple bağlayabilir.Son zamanlarda, Z-REX tarafından keşfedilen ilişkili bir hedef ve yol olan reaktif metabolit HNE'nin, üçlü negatif meme kanserlerine karşı hassas izoforma özgü kinaz inhibitörlerinin geliştirilmesini nasıl sağladığını gösterdik. Embriyoları, taze% 10 Hank'in dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile doldurulmuş bir enjeksiyon plakasının oluklarına hizalayarak başlayın. İğne ucunu ortama batırın ve gerekirse, uçtaki hava kabarcıklarını gidermek için enjeksiyon darbeleri uygulayın Embriyoyu enjekte etmek için, koryon ve yumurta sarısı kesesine tek bir harekette nüfuz edin ve bir enjeksiyon darbesi uygulayın.Diğer embriyoları enjekte ettikten sonra, bir fışkırtma şişesi kullanarak taze HBSS ortamı içeren yeni bir Petri kabına durulayın. Enjekte edilmeyen embriyoları başka bir plakada toplayın. Z-REX tedavi analizi yapmak için, enjekte edilen embriyoları 10 santimetrelik kaplara dağıtarak başlayın.Kırmızı ışıklı karanlık bir odada, ortamı REX probunun bir mikromolarlı olsun veya olmasın 30 mililitre% 10 HBSS ile değiştirin. Embriyoları karanlıkta 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Döllenmeden 30 saat sonra, medyayı karanlıkta değiştirin.İnkübasyon ve ortam değişimini iki kez tekrarladıktan sonra, embriyoları her 30 saniyede bir dönen önceden ısıtılmış bir UV lambasından ışığa maruz bırakın. Fenotipik bir tahlil yapmak için, döllenmemiş veya ölü embriyoları anestezi uygulanan embriyoları içeren plakadan çıkarın. Keskin forseps kullanarak, embriyoların koryonunu çıkarın.Embriyoları %10 HBSS besiyeri ile hazırlanan %2'lik agaroz plakasına monte edin ve stereomikroskop altında gözlemleyin. Her balığın nötrofil ve makrofaj sayısını saymak için ImageJ'yi kullanın. Serbest El Seçimi'ni seçin ve tüm balığın etrafında dönün, ardından floresan hücreleri saymak için Maxima'yı Bul seçeneğini belirleyin Bu çalışmada, Z-REX ile tedavi edilen embriyolar nötrofil ve makrofaj kaybı göstermiştir.Bu etki tedavi edilmeyen gruplarda yoktu. Apoptoz sinyal yolu Halo-P2A-Keap1 grubunda tetiklenmedi ve değişmemiş makrofaj ve nötrofil seviyelerine neden oldu. Benzer sonuçlar, HNE'ye cevap vermeyen Halo-TEV-Keap1 mutantında da gözlenmiştir.Transkripsiyonel ve gerçek zamanlı kantitatif PCR analizleri, Z-REX sonrası immün ile ilişkili genlerin aşağı regülasyonunu ve antioksidan genlerin upregülasyonunu göstermiştir. İmmünofloresan boyama, P2A-split-construct'ın, benzer ekspresyon seviyelerinin göstergesi olan TeV-fusion-construct'tan iki kat daha fazla HA etiketine sahip olduğunu gösterdi. Vahşi tip ve mutant tip Halo-TeV-Keap1'in ekspresyon seviyeleri de benzerdi.Z-REX ile tedavi edilen transgenik nötrofil muhabir hattında, nötrofillerin ve aktif kaspaz 3'ün kolokalizasyonu da gözlendi. En önemli şey, belgelerinizin doğru şekilde ayarlanmasıdır. Sınırlama, sonuçlarınızı gerçekten iyileştirecektir.Localis-REX olarak bilinen bir ilaç tarama platformuna bir fikir olan Z-REX'i benimsedik. Şimdiye kadar başka hiçbir teknik bu kadar yerel, spesifik ve reaktif ligand veya hedef haritalaması başaramamıştır. Meme kanseri tedavisine yönelik elektrofilik ilaç adayları geliştirmemize yardımcı olmuştur.Kanser, immünoloji, yaşlanma vb. birçok alanda lokalize sinyalizasyonun artan önemi göz önüne alındığında, lokalize reaktif ligand tarafından yönlendirilen olayları haritalayabilen tek araç olan Z-Rex, çok sayıda alana yardımcı olmayı vaat ediyor.

monitoring-on-target-signaling-responses-larval-zebrafish-z-rex

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebra balığı larvalarının mikromanipülasyon ve elektroretinografi tekniklerini kullanarak elektroretinografik (ERG) analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu, zebra balığı larvalarının in vivo görsel işlevini test etmek için basit ve anlaşılır bir yöntemdir.

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

Burada, larva zebra balığı ve koca kafa minnow lokomotor aktivite ve bir otomatik izleme yazılımı kullanarak photomotor yanıt (PMR) incelemek için bir protokol mevcut. Ortak toksikoloji biyoanalizler dahil, bu davranışların analizleri kimyasal bioactivity incelemek için bir tanı aracı sağlarlar. Bu iletişim kuralı kafein, modeli neurostimulant kullanılarak açıklanmıştır.

Davranışsal yanıt profilleri larva balık incelenmesi için deneysel protokol: nöro-uyarıcı kafein uygulamaya

Burada, DEPDC5 geninin geçici inhibisyonundan kaynaklanan bir zebra balığı epilepsi modelinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balığı epilepsi modelinde davranışsal ve fizyolojik analiz

Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Burada, makrofaj-soy hücrelerine ilaç dağıtımını hedeflemek amacıyla ilaç yüklü lipozomların ve bunların mikroenjeksiyonunun larva zebra balığına sentezini anlatıyoruz.

Uyuşturucu Yüklü Lipozomenjekte ederek Larva Zebra balığı Makrofajlarına Yönelik İlaçların Hedeflenmesi

Zebra balığı embriyo titreşimi ürkütücü tepkisine dayalı olarak kimyasal bileşik toksisitesini değerlendirmek için bir tarama sisteminin iş akışını ve veri analizini açıklıyoruz. Sistem, zebra balığı embriyolarının bir titreşim uyaranına maruz kaldıklarında hareketlerini kaydeder ve genel toksisite/ölümcüllük ve nöromüsküler toksisitenin entegre bir değerlendirmesine izin verir.

Zebra Balığı Titreşim İrkilme Tepkisi Tarama Sistemi Kullanılarak Kimyasalların Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, zebra balığı larvalarında döllenmeden 3-7 gün sonra bir ilaç tarama prosedürünü ve ardından morfolojik değerlendirmeyi tanımlar.

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Keşfedin Z-REX yöntemiyle zebra balığı embriyolarında reaktif küçük molekül sinyalizasyonunu ve bağışıklık hücresi yanıtlarını analiz etmeyi. Bu teknik kanser tedavileri için hedefli ilaç geliştirmede yüksek hassasiyet sağlar.

Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır (Video) | JoVE Journal

Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır

Daha fazla video keşfet