Name: Ağ Farmakolojisi Akciğer Adenokarsinomuna Karşı Trikosantiz-Fritillaria Thunbergii Etki Mekanizmasının Tahmini ve Deneysel Validasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:35:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Keşfedin ağ farmakolojisi yöntemiyle akciğer adenokarsinomuna karşı Trichosanthes-Fritillaria thunbergii etki mekanizmasını ve PI3K/AKT yolunun rolünü. Deneysel validasyon destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi İnovasyon Eğitim Programı (No: 202110026036) tarafından desteklenmiştir.

Tüm ağ farmakolojisi prosedürleri, Ağ Farmakolojisi Değerlendirme Yöntemleri Kılavuzu18'e uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel prosedürler Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'nin laboratuvar yönetimi yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Ağ farmakolojik tahmini
<ol><li>Aktif bileşenlerin seçimi<ol><li>HERB veritabanını (http://herb.ac.cn)19 açın ve iki ilacın bileşenlerini elde etmek için anahtar kelimeler olarak "Gualou" ( Trichosanthes kirilowii Maxim'in Çince adı) ve "Zhebeimu" (Bulbus Fritillariae thunbergii'nin Çince adı) kullanın. İki ilacın ilgili bileşenlerinin listesini ve kanonik SMILES yapılarını indirin.</li>
		<li>Elde edilen bileşenin etkin bileşen olup olmadığını belirleyin.<ol><li>HERB grup veritabanında oral biyoyararlanım (OB) ve ilaç benzeri (DL) değerlere sahip olanları aktif bileşenler olarak dahil edin (yani, OB ≥% 30 ve DL ≥ 0.18 olan bileşenler)20,21.</li>
			<li>Bileşenin OB ve DL değerleri yoksa, her bileşenle ilgili bilgileri edinmek için bileşeni İsviçre ADME veritabanına (http://www.swissadme.ch/index.php)22 girin. "Yüksek" GI emilimine sahip bileşenleri ve en az iki "Evet" DL değerini etkin bileşenler olarak dahil edin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Aktif bileşenlerin hedef tahmini<ol><li>HERB veritabanını (http://herb.ac.cn) açın. Etkin bileşenlerin kurallı SMILES yapılarını arayın ve kopyalayın.</li>
		<li>SEA (Benzerlik topluluğu yaklaşımı, http://sea.bkslab.org) veritabanı23'ü açın. Etkin bileşenlerin kurallı SMILES yapılarını arama kutusuna yapıştırın ve her etkin bileşenin Hedef anahtarını, Hedef adını, P-Değerini ve MaxTC'sini almak için SEA'yı Dene'ye tıklayın.</li>
		<li>Verileri bir elektronik tabloya kopyalayın ve etkin bileşenlerin hedeflerini Hedef anahtarına (İnsan, P < 0,05 ve MaxTC > 0,5) göre filtrelemek için elektronik tablo dosyasının filtreleme işlevini kullanın.</li>
		<li>Tüm hedefleri bir elektronik tabloya kopyalayın ve ilaç hedeflerini elde etmek için yinelenenleri kaldırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hastalık hedeflerinin tahmini<ol><li>GeneCards veritabanını (https://www.genecards.org)24 ve Online Mendel Inheritance in Man veritabanını (OMIM, https://www.omim.org)25 açın ve akciğer adenokarsinomunun hastalık hedeflerini elde etmek için anahtar kelime olarak Akciğer Adenokarsinomunu kullanın.</li>
		<li>Hastalık hedeflerinin elektronik tablolarını indirin. LUAD hedeflerini elde etmek için yinelenen hedefleri silin.</li>
	</ol></li>
	<li>İlaç-bileşen-hastalık-hedef ağının oluşturulması<ol><li>LUAD ile ilgili hedefleri ve ilaç hedeflerini yeni bir elektronik tabloda aynı sütuna kopyalayın. LUAD ile ilgili hedeflerin ve Trichosanthes-Fritillaria thunbergii etkin bileşenle ilgili hedeflerin kesişim hedeflerini elde etmek için araç çubuğundaki Veri - Yinelenenleri Tanımla işlevini kullanın.</li>
		<li>Cytoscape 3.8.0'ı açın. Menü çubuğunda Dosya'ya tıklayın ve ardından elektronik tablo dosyasını içe aktarmak için Dosyadan > Ağı İçe Aktar'ı seçin. Sol kontrol panelindeki stil çubuğu aracılığıyla ağ düğümlerinin boyutunu ve rengini optimize edin.</li>
		<li>Ağ topolojisi analizi için Ağı Analiz Et işlevini kullanın. Menü çubuğunda Araçlar'a tıklayın ve ardından Ağı Analiz Et'i seçin. Tablo panelinde, bileşenleri azalan düzende dereceye göre düzenlemek için başlık çubuğundaki Derece'yi tıklatın. İlk on bileşeni ve hedefi ana aktif bileşenler ve temel hedefler olarak alın.</li>
	</ol></li>
	<li>PPI ağının inşası ve çekirdek proteinlerin taranması<ol><li>STRING veritabanı (https://cn.string-db.org/)26'yı açın. Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin LUAD'a karşı olası hedeflerinin metin biçimindeki listesini İsim Listesi iletişim kutusuna yapıştırın. Organizmalarda Homo sapiens'i seçin ve ARA > DEVAM ET düğmelerine tıklayın.</li>
		<li>Sonuçlar mevcut olduğunda, Ayarlar'a tıklayın ve Temel Ayarlar'da Yüksek Güvenilirlik (0,700) seçeneğini > Minimum Gerekli Etkileşim Puanı'nı işaretleyin. Gelişmiş Ayarlar'da Ağdaki Bağlantısı Kesilmiş Düğümleri Gizle'yi işaretleyin ve ardından GÜNCELLE düğmesine tıklayın.</li>
		<li>Başlık çubuğunda Dışa Aktarımlar'a tıklayın ve PPI ilişkisinin kısa tablo metnini TSV formatında indirin.</li>
		<li>Cytoscape 3.8.0'ı açın. TSV formatındaki dosyayı görsel analiz için içe aktarmak üzere Dosya'ya tıklayın > Dosyadan > Ağı İçe Aktar'a tıklayın.</li>
		<li>Topolojik analizi gerçekleştirmek için Ağ Çözümleyicisi işlevini kullanın. Sol kontrol panelindeki stil çubuğu aracılığıyla ağ düğümlerinin boyutunu ve rengini optimize edin.</li>
	</ol></li>
	<li>KEGG zenginleştirme analizi<ol><li>Metascape (https://metascape.org/)27 platformunu açın. Potansiyel terapötik hedeflerin metin biçimindeki listesini iletişim kutusuna yapıştırın ve ardından Gönder düğmesine tıklayın. Hem Tür Olarak Giriş hem de Tür Olarak Analiz'de H. sapiens'i işaretleyin ve ardından Özel Analiz düğmesine tıklayın. Zenginleştirme'yi seçin, yalnızca KEGG Yolu'nu işaretleyin ve ardından Zenginleştirme Analizi'ne tıklayın. İlerleme çubuğu %100'e ulaştıktan sonra, zenginleştirme sonuçları için Analiz Raporu Sayfası turuncu düğmesine tıklayın.</li>
		<li>Zenginleştirme sonucunu indirmek için All in One Zip File (Bir Zip Dosyasında Tümü) öğesine tıklayın ve ardından sonucu elde etmek için Enrichment_GO klasöründeki _ FINAL_GO.csv dosyasını açın.</li>
		<li>R yazılımını açın (https://cran.r-project.org/). ggplot2 R paketinin kurulumu için R içine install.package ("ggplot2") ve kitaplık (ggplot2) yazın. KEGG görselleştirme programını çalıştırmak için Enter tuşuna basın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Deneysel doğrulama
<ol><li>İlaç hazırlama NOT: Fritillaria thunbergii Miq ve Trichosanthes kirilowii Maxim, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ne bağlı Dongzhimen Hastanesi'nden satın alınmıştır.<ol><li>50 g Fritillaria thunbergii Miq ve 50 g Trichosanthes kirilowii Maxim'i karıştırın. Karışımı 20 dakika boyunca 1 L damıtılmış suya batırın ve ardından karışımı 1 saat boyunca normal basınç altında 100 ° C'de kaynatın.</li>
		<li>Çift kat steril tıbbi gazlı bez içeren bir filtrat elde etmek için kaynatma işlemini filtreleyin ve ardından ekstraktı daha fazla filtrelemek için 80 μm filtre kağıdı kullanın. Yukarıdaki işlemi üç kez tekrarlayın.</li>
		<li>Yaklaşık 1.2 L'lik bir kaynatma elde etmek için filtratı karıştırın. Çözeltiyi döner bir evaporatörün şişesine yerleştirin. Dönüş hızını 37 °C sıcaklıkta 50 rpm'ye ayarlayın. Kaynatma maddelerini karıştırın ve viskoz bir sıvı elde etmek için 6 saat boyunca döner evaporatördeki bir ekstrakt halinde yoğunlaştırın.</li>
		<li>Sıcaklığı -40 °C'ye soğutmak için vakumlu dondurarak kurutma mekanizmasını açın. Elde edilen ekstraktı malzeme tepsisine koyun ve dondurmak için soğuk tuzağa yerleştirin.</li>
		<li>Soğuk tuzak sıcaklığı −50 ° C'ye ulaştığında ve malzeme 2 saat boyunca dondurulduğunda, dondurulmuş malzemeleri soğuk tuzağa yerleştirilmiş bir kurutma rafına aktarın. Liyofilizasyon işlemini başlatmak için vakum pompasını açın. Dondurularak kurutulmuş tozu çıkarın ve daha sonra kullanmak üzere buzdolabında -20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre yetiştiriciliği<ol><li>DMEM komple ortamını %89 DMEM temel ortamı, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile yapılandırın.</li>
		<li>A549 hücrelerini sıvı azottan çıkardıktan sonra, hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin ve şişedeki ortam eriyene kadar karıştırın.</li>
		<li>Erimiş hücrelere dört kat hacimli DMEM tam ortamı ekleyin. Hücreleri santrifüj edin (4 °C, 679 x g, 5 dakika) ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Çökeltilmiş hücreleri 6 mL DMEM tam ortamı ile yeniden askıya alın, bir T25 kültür şişesinde kaplayın ve şişeyi 37 ° C,% 5 CO2'de bir hücre inkübatöründe inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre canlılığının tespiti<ol><li>Logaritmik büyüme fazı A549 hücrelerini 37 ° C'de 1 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin ile sindirin. Tripsini nötralize etmek için 1 mL DMEM tam ortam ekleyin ve hücre dökülmesini teşvik etmek için hafifçe üfleyin. Hücre peletini elde etmek için karışımı santrifüj edin (4 °C, 192 x g, 5 dk). DMEM tam ortamını kullanarak elde edilen hücreleri yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu bir hemositometreye ekleyin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın. DMEM komple ortamını kullanarak 5 x 104 hücre/mL'ye seyreltin.</li>
		<li>1 g Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktını 10 mL PBS çözeltisinde çözün ve 0.22 μm'lik bir filtreden geçirerek filtreleyin-sterilize edin. PBS kullanarak karışımı 90 mg/mL, 80 mg/ml, 70 mg/mL, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/mL ve 10 mg/mL'ye seyreltin.</li>
		<li>Seyreltilmiş hücreleri 96 delikli plakalar üzerinde kuyucuk başına 100 μL ile plakalayın. Hücre yapışmasından sonra, her bir kuyucuğun konsantrasyonunu 900 μg / mL, 800 μg / mL, 700 μg / mL, 600 μg / mL, 500 μg / mL, 400 μg / mL, 300 μg / mL, 200 μg / mL ve 100 μg / mL'ye ayarlamak için farklı konsantrasyonlarda 1 μL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktları ekleyin.</li>
		<li>24 saatlik kültürden sonra orijinal ortamı atın ve 37 ° C'de 2 saat daha fazla inkübasyon için 100 μL DMEM bazik ortamı,% 5 CO2 ekleyin.</li>
		<li>Yukarıdaki işlemden sonra, 20 μL MTS çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 1 saat daha inkübe edin.</li>
		<li>İnkübe edilen karışımı farklı bir plakaya aktarın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı (OD) 490 nm dalga boyunda ölçün. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre canlılığını hesaplayın: Canlılık (%) = 100 × (işlem görmüş numunenin OD'si -ortamın OD'si)/(kontrol numunesinin OD'si -ortamın OD'si). NOT: IC50'ye yakın minimum konsantrasyon, yüksek doz olarak tanımlanır. Hücre proliferasyonunun inhibe edilmeye başlandığı konsantrasyon düşük doz konsantrasyon olarak tanımlanır ve ara değer, sonraki deneysel çalışmalar için orta doz konsantrasyon olarak tanımlanır. Bu çalışmada düşük, orta ve yüksek doz olarak 400 μg/mL, 600 μg/mL ve 800 μg/mL kullanılmıştır.</li>
	</ol></li>
	<li>İlaç müdahalesi ve numune toplama NOT: Günlük fazını belirlemek için hücre büyümesi zamana karşı çizilmiştir.<ol><li>Logaritmik büyüme fazı A549 hücrelerini 5 x 105 hücre/mL ile seyreltin. 6 delikli bir plakaya 2 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 12 saat boyunca büyüyün.</li>
		<li>Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının 80 mg / mL, 60 mg / mL ve 40 mg / mL PBS seyreltmelerini elde etmek için adım 2.3.3'ü tekrarlayın. PBS çözeltisinin 20 μL'sini, 40 mg / mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının 20 μL'sini, 60 mg / mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının 20 μL'sini ve 80 mg / mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının 20 μL'sini boş kontrol grubuna, düşük konsantrasyon grubuna, orta konsantrasyon grubuna ve yüksek konsantrasyon grubuna ekleyin, sırasıyla. 24 saatlik müdahaleden sonra süpernatantı atın ve hücreleri PBS ile üç kez temizleyin. NOT: Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının boş kontrol grubu, düşük konsantrasyon grubu, orta konsantrasyon grubu ve yüksek konsantrasyon grubunun konsantrasyonları sırasıyla 0 μg / mL, 400 μg / mL, 600 μg / mL ve 800 μg / mL idi.</li>
		<li>Her bir oyuğa 250 μL RIPA tamponu (% 1 PMSF ve% 1 fosfataz inhibitörü içeren) ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca lize edin. Santrifüjleme için lizatı toplayın (4 ° C, 6.714 x g, 10 dakika) ve süpernatanı elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Batı lekelenmesi<ol><li>Numunelerin protein konsantrasyonunu, üreticinin talimatlarına göre BCA yöntemiyle tespit edin. Her numunenin konsantrasyonunu tutarlı olacak şekilde ayarlamak için RIPA arabelleğini kullanın.</li>
		<li>40 μL protein numunesini 10 μL 5x yükleme tamponu ile karıştırın ve 100 °C'de 5 dakika kaynatın. Santrifüj (4 °C, 6,714 x g, 10 dk) sonraki deneyler için süpernatant elde etmek için karışımı.</li>
		<li>120 V dikey elektroforez kullanarak proteinleri jel elektroforezi ile izole edin.</li>
		<li>Elektrikli bir "sandviç" hazırlayın (sünger - filtre kağıdı - jel - PVDF membran - filtre kağıdı - sünger). Transfer aparatını bir buz banyosuna batırın ve proteini 60 dakika boyunca 70 V'ta PVDF membranlarına aktarın.</li>
		<li>%5 sütü yapılandırmak için 100 mL TBST çözeltisi (%0,05 [v/v] Ara-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) ve 5 g yağsız süt tozu kullanın. AKT ve p-AKT antikorlarını antikor seyreltici ile 1:1.000 oranında önceden seyreltin.</li>
		<li>PVDF membranını çalkalayarak 1 saat boyunca% 5 yağsız süt tozu içinde bloke edin. Bloke ettikten sonra, bloke edici sütü atın ve 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon için seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin.</li>
		<li>Birincil antikoru çıkardıktan sonra, PVDF membranını her biri 5 dakika boyunca beş kez yıkamak için TBST çözeltisi kullanın.</li>
		<li>Sekonder antikoru antikor seyreltici ile 1:5.000 oranında önceden seyreltin. İkincil antikoru ekleyin ve 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. İkincil antikoru çıkardıktan sonra, PVDF membranını her biri 5 dakika boyunca beş kez yıkamak için TBST çözeltisi kullanın.</li>
		<li>Bir kemilüminesans algılama sistemi kullanarak proteini tespit edin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Moleküler yerleştirme
<ol><li>UniProt veritabanını açın (https://www.uniprot.org)28. Hedef sembolleri arama kutusuna yazın ve ARA düğmesine tıklayın. Yapı alt başlığında, protein hedeflerinin 3B yapıları için İndir'e tıklayın.</li>
	<li>RCSB PDB veritabanı (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29'u açın. Arama kutusuna protein makromoleküllerinin adını yazın. Protein makromolekül yapılarını PDB formatında indirin.</li>
	<li>UCSF Chimera 1.16 yazılımı (https://vina.scripps.edu/) ve AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/) kurulum paketini indirin. UCSF Chimera 1.16 yazılımını yükleyin ve açın. Reseptör proteinini görüntülemek için Dosya > Aç'a tıklayın.</li>
	<li>Dock Prep'> Yapı Düzenleme > Araçlar'a tıklayın ve suyu kaldırmak, hidrojenasyon ve dengeleme ücretleri eklemek için açılır pencerede Çözücüyü Sil, Hidrojen Ekle ve Ücret Ekle'yi işaretleyin. Reseptör proteinini mol2 formatında kaydetmek için Mol2 Dosyası Yaz'a tıklayın. Aynı adımı ligand üzerinde de gerçekleştirin.</li>
	<li>UCSF Chimera 1.16 yazılımında mol2 formatlı ligandı görüntülemek için Dosya > Aç'a tıklayın. AutoDock Vina> Yüzey/Bağlanma Analizi >Araçları'nda, Reseptör çubuğunu reseptör proteininin adına ve Ligand çubuğunu ligandın adına ayarlayın. Yeni geliştirilen alanı ayarlamak için Merkez ve Boyut'un arkasındaki kutuya bir değer girin, böylece ligand ve reseptörü tamamen kuşatmayı mümkün kılar.</li>
	<li>Reseptöre ligand bağlanması için en uygun yeri elde etmek üzere moleküler kenetlenme sanal taraması için Tamam'a tıklayın. Bağlama enerjisi değerini optimum konumda kaydedin.</li>
</ol>4. İstatistiksel analiz
<ol><li>SPSS 26.0 istatistik yazılımını açın. Veri yükleme için Dosya > Verileri İçe Aktar'a tıklayın.</li>
	<li>Deneysel verileri ortalama ± standart sapma olarak sunun.</li>
	<li>Tek yönlü ANOVA kullanarak birden fazla grubu karşılaştırın. NOT: Bu çalışmada P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Genel olarak, tam bir ağ farmakolojisi çalışması, veritabanlarından aktif bileşenlerin tanımlanmasını, aktif bileşenlere ve hastalıklara karşılık gelen hedeflerin elde edilmesini, bir ilaç-bileşen-hastalık-hedef ağının oluşturulmasını ve çekirdek hedeflerin ve yolların tahmin edilmesini içerir. Aktif bileşenler ve çekirdek proteinler arasındaki ilişki (moleküler kenetlenme) bilgisayar teknolojisi tarafından önceden tahmin edilir ve son doğrulama bir deney kullanılarak gerçekleştirilir.
İlgili ...

Akciğer kanseri, skuamöz hücreli karsinom, adenokarsinom, büyük hücreli karsinom ve küçük hücreli karsinom1 dahil olmak üzere akciğer bronşiyal mukozasından köken alan malign tümörleri ifade eder. Akciğer adenokarsinomu (LUAD) en sık görülen akciğer kanseri türüdür ve toplam akciğer kanseri vakalarının yaklaşık% 40'ını oluşturur2. Çoğu hastaya ileri evrede tanı konulur veya uzak metastazı vardır ve bu nedenle ameliyat fırsatını kaybeder3. Mevcut klinik tedavide, eşzamanlı kemoradyoterapi LUAD tedavisinde en yaygın stratejidir, ancak ciddi advers reaksiyonlar nedeniyle uygulaması sınırlıdır4.
Geleneksel Çin tıbbı (TCM), LUAD hastalarının klinik semptomlarını etkili bir şekilde hafifletebilir ve radyoterapi ve kemoterapinin neden olduğu advers reaksiyonları azaltabilir ve böylece bir araştırma noktası haline gelmiştir 5,6,7. Geleneksel Çin tıbbında, akciğer kanseri "akciğer birikimi" ve "pulmoner petroz" kategorisine aittir. Qi eksikliği ve balgam, staz ve zehir etkileşimi akciğer kanserinin patogenezinde önemlidir. Bu nedenle, Qi'yi tonlamak ve balgam ve kan stazını ortadan kaldırmak, TCM teorisi9'a göre akciğer kanseri için ana klinik tedavi8 yöntemidir. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) ve Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu), akciğer kanseri tedavisinde yaygın bir ilaç çiftini temsil eder ve bu kombinasyon, ısıyı temizleme ve balgam10,11,12'yi azaltma etkilerine sahiptir. Bununla birlikte, etki mekanizması hala belirsizdir ve daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.
Ağ farmakolojisi, çoklu ilaçlar ve hastalıklar arasındaki karmaşık ağ ilişkilerini ortaya çıkarmayı amaçlayan sistem biyolojisi ve çok yönlü farmakoloji teorisine dayanan kapsamlı bir yöntemdir13. Geleneksel Çin reçeteleri çok bileşenli ve çok hedefli olma özelliklerine sahiptir, yani ağ farmakolojisi çalışması için çok uygundurlar14,15. Son zamanlarda, ağ farmakolojisi TCM formüllerinin çalışmasında güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkmış ve bir araştırma noktası haline gelmiştir16,17.
Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, ağ farmakolojisi ile ilgili tüm araştırmalar metin olarak sunulmaktadır. Bu teknolojiyi video yoluyla sunmak, öğrenme eşiğini büyük ölçüde azaltacak ve bu makalenin avantajlarından biri olan bu teknolojinin tanıtımını kolaylaştıracaktır. Bu çalışmada, ağ farmakolojisi tahmini ve deneysel validasyonu gerçekleştirmek için akciğer adenokarsinomuna karşı Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'yi örnek olarak aldık.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>A549&nbsp; hücre hattı</td><td>Procell</td><td>CL-0016</td><td></td></tr><tr><td>AKT antikoru</td><td>CST</td><td>4691S</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Test Kiti</td><td>Solarbio</td><td>PC0020</td><td></td></tr><tr><td>Kemilüminesans tespit sistemi</td><td>Şangay Qinxiang Bilimsel Enstrüman Fabrikası</td><td>ChemiScope 6100</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)</td> <td>Solarbio</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) kiti&nbsp;</td><td>ABklonal</td><td>RM00021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ScienCell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>HRP Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>ABklonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>MTS test kiti</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT antikoru</td><td>CST</td><td>6040S</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin</td><td>Gibco</td><td>C14-15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td><td>Solarbio</td><td>P0100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz inhibitörü</td><td>Beyotime</td><td>P1081</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Poliviniliden diflorür (PVDF) membranlar</td><td>Kırlangıç</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lizis çözeltisi</td><td>Solarbio</td><td>R0010</td><td></td></tr><tr><td>Döner evaporatör</td><td>Şangay Yarong Biyokimyasal Alet Fabrikası</td><td>RE52CS-1</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu dondurarak kurutma mekanizması</td><td>Ningbo Scientz Biyoteknoloji</td><td>SCIENTZ-10</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -Aktin antikoru</td><td>ABklonal</td><td>AC026</td><td></td></tr></tbody></table>

ağ farmakolojisi akciğer adenokarsinomuna karşı trikosantiz-fritillaria thunbergii etki mekanizmasının tahmini ve deneysel validasyonu

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Akciğer adenokarsinomunun (LUAD) tedavisinde Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin mekanizmasını ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulamaya dayalı olarak incelemeyi amaçladık. Trichosanthis ve Fritillaria thunbergii'nin etkili bileşenleri ve potansiyel hedefleri, geleneksel Çin tıbbının yüksek verimli deney ve referans rehberliğinde (HERB) veritabanı ve benzerlik topluluğu yaklaşımı (SEA) veritabanı ile toplandı ve LUAD ile ilgili hedefler GeneCards ve İnsanda Çevrimiçi Mendel Kalıtım (OMIM) veritabanları tarafından sorgulandı. Cytoscape yazılımı tarafından bir ilaç-bileşen-hastalık-hedef ağı oluşturulmuştur. Protein-protein etkileşimi (PPI) ağı, gen ontolojisi (GO) fonksiyonu ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirme analizleri, çekirdek hedefleri ve anahtar yolları elde etmek için yapılmıştır. Sonraki deneysel doğrulama için Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ve A549 hücrelerinin sulu bir ekstraktı kullanıldı. HERB veri tabanı ve literatür taraması yoluyla, 31 etkili bileşik ve Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin 157 potansiyel hedef geni tarandı, bunlardan 144'ü akciğer adenokarsinomunun tedavisinde Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin düzenleyici hedefleriydi. GO fonksiyonel zenginleştirme analizi, Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin akciğer adenokarsinomuna karşı etki mekanizmasının esas olarak protein fosforilasyonu olduğunu göstermiştir. KEGG yol zenginleştirme analizi, akciğer adenokarsinomunun Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ile tedavisinin esas olarak PI3K / AKT sinyal yolunu içerdiğini göstermiştir. Deneysel doğrulama, Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin sulu bir ekstraktının A549 hücrelerinin çoğalmasını ve AKT'nin fosforilasyonunu inhibe edebileceğini göstermiştir. Ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulama yoluyla, PI3K / AKT sinyal yolunun akciğer adenokarsinomunun tedavisinde Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin etkisinde hayati bir rol oynadığı doğrulanmıştır.

21 Trichosanthes-Fritillaria thunbergia bileşeni ve 144 karşılık gelen hedef dahil olmak üzere toplam 31 Trichosanthes-Fritillaria thunbergia ile ilişkili aktif bileşen tanımlanmıştır. Genel olarak, sırasıyla GeneCards veritabanından ve OMIM veritabanından 9.049 ve 67 LUAD ile ilişkili gen çıkarıldı. Kopyalanan genleri sildikten sonra, LUAD ile ilgili 9.057 gen tanımlandı. LUAD ile ilişkili genlerin ve Trichosanthes-Fritillaria thunbergii aktif bileşen ile ilişkili hedeflerin kesişimi,...

Bu çalışma, ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulamaya dayanarak akciğer adenokarsinomunun tedavisinde Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin mekanizmasını ortaya koymaktadır. Çalışma ayrıca, PI3K / AKT sinyal yolunun Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin akciğer adenokarsinomunun tedavisinde etkisinde hayati bir rol oynadığını göstermektedir.

Ağ Farmakolojisi Akciğer Adenokarsinomuna Karşı Trikosantiz-Fritillaria Thunbergii Etki Mekanizmasının Tahmini ve Deneysel Validasyonu

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Geleneksel Çin Tıbbı'nda, hedefin çok bileşenli özelliklerinden bahsedeceğiz. Ağ ve Biyolojik araştırmalar için en temel kutu budur. Eşiği düşürecek teknolojinin bir gösterimini yaptık.Ağ Farmakolojisi sistematik analitik teknolojidir, çok faktörlü etkileşim ağı çalışmasının araçlarını oluşturur. Geleneksel Çin Tıbbı'nın tek yolunu etkili bir şekilde tahmin edebilir Ağ Farmakolojisinin verileri veritabanından gelir, ancak ilaçlar, proteinler ile olan ilişkiyi tahmin edemez ve bunun hala sonraki deneylerle doğrulanması gerekir. Başlamak için HERB Veritabanını açın ve iki ilacın bileşenlerini elde etmek için anahtar kelimeler olarak Gua Liu ve Zhebimu'yu kullanın.İki ilacın ilgili bileşenlerinin listesini ve kanonik SMILES yapısını indirin. Şimdi, oral biyoyararlanım ve ilaç benzeri değerlere sahip bileşenleri HERB Grup Veritabanına dahil ederek elde edilen bileşenin aktif olup olmadığını belirleyin. Bileşenin oral biyoyararlanımı ve ilaç benzeri değerleri yoksa, her bileşen hakkında bilgi edinmek için bileşeni İsviçre ADME Veritabanına girin.Yüksek GI emilimine sahip bileşenleri ve aktif bileşenler olarak en az iki evet ilaç benzeri değeri dahil edin. Etkin bileşenlerin hedefini tahmin etmek için HERB Veritabanı'nı açın. Etkin bileşenlerin kurallı SMILES yapılarını arayın ve kopyalayın.Ardından benzerlik topluluğu yaklaşımını açın ve etkin bileşenlerin kurallı SMILES yapılarını arama kutusuna yapıştırın. Hedef anahtar hedef adını, P-değerini ve her etkin bileşenin maksimum TC'sini elde etmek için SEA'yı dene'ye tıklayın. Verileri bir elektronik tabloya kopyalayın ve etkin bileşen hedeflerini hedef anahtara göre filtrelemek için elektronik tablo dosyaları filtreleme işlevini kullanın.Tüm hedefleri bir elektronik tabloya kopyalayın ve ilaç hedeflerini elde etmek için kopyaları kaldırın. Şimdi hastalık hedeflerini tahmin etmek için gen kartları veritabanını ve insanda çevrimiçi Mendel kalıtımını açın. Akciğer Adenokarsinomunun hastalık hedeflerini elde etmek için anahtar kelime olarak Akciğer Adenokarsinomunu kullanın.Akciğer Adenokarsinom hedeflerini elde etmek için hastalık hedeflerinin tablolarını indirin ve tekrarlanan hedefleri silin. Akciğer adenokarsinomu ile ilgili hedefleri ve ilaç hedeflerini yeni bir elektronik tabloda aynı sütuna kopyalayarak bir ilaç bileşeni hastalık hedef ağı oluşturun. Akciğer Adenokarsinomu ile ilgili hedeflerin ve Trichosanthes Fritillaria Thunbergia aktif bileşen ile ilgili hedeflerin kesişim hedeflerini elde etmek için araç çubuğundaki veri tanımlama yineleme işlevini kullanın.Cytoscape 3.8.0'ı açın. Menü çubuğunda dosyaya tıklayın ve içe aktar'ı seçin. Ardından dosyadan ağ.Elektronik tablo dosyasını içe aktarmak için, sol kontrol panelindeki stil çubuğundan ağ düğümlerinin boyutunu ve rengini en iyi duruma getirin. Ağ topolojisi analizi için ağ çözümleme işlevini kullanın. Menü çubuğundaki araçlara tıklayın ve ağı analiz et'i seçin.Tablo panelinde, bileşenleri azalan düzende dereceye göre düzenlemek için başlık çubuğundaki dereceye tıklayın. En iyi 10 bileşeni ve hedefi ana aktif bileşenler ve temel hedefler olarak alın. PPI ağını oluşturmak ve çekirdek proteinleri taramak.Dize veritabanını açın ve Trichosanthes Fritillaria Thunbergia'nın Akciğer Adenokarsinomlarına karşı potansiyel hedeflerinin metin formatı listesini isimler listesinin diyalog kutusuna yapıştırın. Sonra organizmalarda homosapiens'i seçin. Ara'ya tıklayın ve devam et düğmelerini seçin, sonuçlar mevcut olduğunda ayarlar'a tıklayın Ve yüksek güvenilirlik 0,700'ü işaretleyin Temel ayarlarda, minimum gerekli etkileşim puanı altında, gelişmiş ayarlarda ağdaki yüksek bağlantısı kesilmiş düğümleri işaretleyin.Ardından güncelle düğmesine tıklayın. Ardından, başlık çubuğundaki dışa aktarmalara tıklayın ve PPI ilişkisinin kısa tablo metnini TSV formatında indirin. Cytoscape 3.8.0'ı açın.TSV formatındaki dosyayı görsel analiz için içe aktarmak üzere dosyaya tıklayın, seçin, içe aktarın, ardından dosyadan ağa tıklayın. Topolojik analizi gerçekleştirmek için ağ analizörü işlevini kullanın. Sol kontrol panelindeki stil çubuğu aracılığıyla ağ düğümlerinin boyutunu ve rengini optimize edin.Medscape platformunu açarak, potansiyel terapötik hedeflerin metin formatı listesini diyalog kutusuna yapıştırarak ve ardından gönder düğmesine tıklayarak KEGG zenginleştirme analizi gerçekleştirin. Hem tür olarak girdi hem de tür olarak analizde Homo sapiens'i işaretleyin ve ardından özel analiz düğmesine tıklayın. Zenginleştirme'yi seçin.Sadece KEGG yolunu işaretleyin ve ardından zenginleştirme analizine tıklayın. İlerleme çubuğu %100'e ulaştığında, zenginleştirme sonuçları için analiz raporu sayfası turuncu düğmesine tıklayın. Zenginleştirme sonucunu indirmek için tümü bir zip dosyasında 'üzerine tıklayın ve ardından sonucu elde etmek için Enrichment_GO' klasöründeki _FINAL_GO'csv dosyasını açın.Açık R-Software ve tip yükleme paketi GG arsa iki' ve kütüphane GG Plot iki'in R GG arsa iki R paketinin kurulumu için. KEGG Görselleştirme programını çalıştırmak için enter tuşuna basın. Hücre canlılığını tespit etmek için, logaritmik büyüme fazı A 549 hücrelerini, 37 santigrat derecede bir dakika boyunca bir mililitre% 0.25 Tripsin ile sindirin.Tripsin'i nötralize etmek için bir mililitre DMEM Complete Medium ekleyin ve hücre dökülmesini teşvik etmek için hafifçe üfleyin. Daha sonra hücre peletini elde etmek için karışımı santrifüj edin ve DMEM Complete Medium kullanarak elde edilen hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu bir Hemositometreye ekleyin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın, DMEM tam ortamını kullanarak mililitre başına beş kez 10 ila dördüncü hücrelere seyreltin Şimdi bir gram Trichosanthes Fritillaria Thunbergia su ekstraktını 10 mililitre PBS'de çözün ve filtreleyin 0.22 mikrometrelik bir filtreden geçirin.PBS kullanarak karışımı farklı konsantrasyonlarda seyreltin. Seyreltilmiş hücrelerin 100 mikrolitresini 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna plakalayın. Hücre yapışmasından sonra, her bir kuyucuğun konsantrasyonunu ayarlamak için farklı konsantrasyonlarda bir mikrolitre Trichosanthes Fritillaria Thunbergia su ekstraktı ekleyin.24 saatlik kültürden sonra orijinal ortamı atın ve 100 mikrolitre DMEM ekleyin. 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte iki saat boyunca daha fazla inkübasyon için temel ortam. İnkübasyonun sonunda, 20 mikrolitre MTS çözeltisi ekleyin ve hücreleri bir saat daha inkübe edin.İnkübe edilen karışımı farklı bir plakaya aktarın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, 490 nanometre dalga boyundaki emilimi ölçün ve hücre canlılığını hesaplayın. Logaritmik büyüme fazı A 549 hücrelerini mililitre başına beş kez 10 ila beşinci hücrelere seyreltin.Altı kuyucuklu bir plakaya iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve 12 saat boyunca büyütün. Daha önce gösterildiği gibi Trichosanthes Fritillaria Thunbergia su ekstraktının farklı PBS seyreltilerini elde ettikten sonra, boş kontrol grubuna 20 mikrolitre PBS çözeltisi ve Trichosanthes Fritillaria Thunbergia su ekstraktının çeşitli seyreltmelerinin 20 mikrolitresini farklı konsantrasyon grubuna ekleyin. 24 saatlik müdahaleden sonra, süpernatantı atın ve hücreleri PBS ile üç kez temizleyin.Her bir oyuğa 250 mikrolitre RIPA tamponu ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca lize edin. Santrifüjleme için lizatı toplayın ve süpernatanı elde edin. Trichosanthes Fritillaria Thunbergia'nın Akciğer Adenokarsinomuna karşı ilaç komponent hastalığı hedef etkileşim ağı gösterilmiştir.Etkileşim ağında, Elde edilen ilk 10 aktif bileşen, Trichosanthes Fritillaria Thunbergia'nın Akciğer Adenokarsinomu tedavisinde etkisinin anahtar aktif bileşenleridir. PPI ağı 122 fonksiyonel protein ve 210 etkileşim ilişkisi içeriyordu. İlk 10 çekirdek protein esas olarak neovaskülarizasyon, hücre proliferasyonu, apoptoz ve hücre zarı taşınmasında rol oynar.KEGG tarafından sıralanan ilk 20 yolaktan, PI3K-AKT sinyal yolu, Rap1 sinyal yolu, Fosfolipaz-D sinyal yolu ve MAPK1 sinyal yolu, PI3K-AKT yolunun ilk sırada yer aldığı akciğer kanseri ile yakından ilişkilidir. Trichosanthes Fritillaria Thunbergia ekstraktları, mililitre başına 400 mikrogramın üzerindeki konsantrasyonlarda hücre proliferasyonunu inhibe edebilir ve mililitre başına 800 mikrograma kadar konsantrasyonlarda A-549 hücreleri üzerindeki inhibisyon etkisi, yarıya yakın inhibitör konsantrasyona yakındı. Trichosanthes Fritillaria Thunbergia ekstraktlarının müdahalesi, her grupta AKT protein ekspresyonunda önemli bir değişikliğe neden olmamıştır.Bununla birlikte, p-AKT Serin-473 ekspresyonu inhibe edildi ve doza bağımlı bir etki gösterdi. Trichosanthes Fritillaria Thunbergia'nın kritik bileşenleri, PI3K AKT yolunun anahtar proteinleri ile moleküler olarak kenetlendi ve sonuçlar, Diosmetin ve Kaempferol'ün AKT1 ile bağlanma enerjilerinin eksi yediden az olduğunu ve güçlü bağlanma aktivitesini gösterdiğini gösterdi. En önemlisi, Geleneksel Çin Tıbbının hedefleri üzerinde aktif bileşenlere ulaşmış olmaktır.Hedefleri Network Farmakolojik'in çekirdeği olan hedeflerin yanı sıra.

network-pharmacology-prediction-experimental-validation-trichosanthes

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hedefli tedavilere karşı duyarlılığı incelemek için biyolojik bir kollajen iskelesine dayalı üç boyutlu (3D) bir akciğer kanseri modeli sunuyoruz. Proliferasyon indeksi, apoptoz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) durumunu belirlemek için farklı okuma teknikleri gösteriyoruz. Toplanan veriler, ilaç duyarlılığının tahmini için in silico bir modele entegre edilmiştir.

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

Bu protokol, Fructus Phyllanthi'nin hiperlipidemiye karşı temel hedeflerini ve mekanizmalarını araştırmak için ağ farmakolojisi tahmini ve metabolomik doğrulamaya dayanan entegre bir stratejiyi tanımlamaktadır.

Ağ Farmakolojisi Hiperlipidemiye Karşı Fructus Phyllanthi Mekanizmasının Tahmini ve Metabolomik Validasyonu

Bu makale, biyoinformatik analiz ve deneysel doğrulama yoluyla primer Sjögren sendromu ve akciğer adenokarsinomunu birbirine bağlayan potansiyel yaygın patojenik mekanizmaları araştırmak için operasyonel prosedürleri ve önlemleri açıklamaktadır.

Akciğer Adenokarsinomu ile İlişkili Primer Sjögren Sendromu: Potansiyel Ortak Patojenik Mekanizmaların Araştırılması ve Deneysel Doğrulama

Bu çalışma, kronik kısıtlama stresine bağlı depresyonun bir sıçan modelinde Qiangzhifang'ın antidepresan etkinliğini değerlendirdi ve ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme analizi ile HIF-1 ve JAK-STAT yolları üzerindeki düzenleyici etkisini aydınlattı.

Kronik Kısıtlama Strese Bağlı Depresyon Sıçan Modelinde Qiangzhifang'ın Antidepresan Mekanizmalarının Ağ Farmakolojisi ve Doğrulanması

Diffüz zararlı inhibitör kontrolü, temporal toplamı ve yara hiperaljezi test obstetrik hasta göstermiştir. Bu testler, ağrı işleme inhibitör ve eksitatör mekanizmaları değerlendirmek ve burada endojen analjezi ve inatçı ağrılar için bireysel risk ortaya yardımcı olmak için Peripartum dönemde gebelik sırasında farklı zaman noktaları değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Post-operatif ağrı Tahmininde Deneysel Bir Paradigma (PPOP)

Deneysel insan pnömokok taşıma taşıma doğal bir modeli ve aşı geliştirme kullanım için potansiyel model sunmaktadır. Bu teknik çok değerli ama karmaşık ve bir insan bir patojen getirerek klinik risklidir. Biz ayrıntılı bir protokol geliştirmiştir.

Deneysel İnsan Pnömokok Taşıma

Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Çin'in Sincan Pastoral Bölgesi'nin en büyük tıp merkezinde insan Brucellar spondilodisitinin teşhis ve cerrahi tedavisinin onlarca yıllık ön cephe deneyimine dayanan bir klinik algoritmayı tanımlıyoruz.

İnsan Brucellar Spondilodistis Tanı ve Cerrahi Tedavisi

Bu çalışma, üç farklı akciğer bağışı modelinin (beyin ölümü sonrası bağış, dolaşım sonrası ölüm bağışı ve hemorajik şok sonrası bağış) kurulduğunu göstermektedir. Bu olaylarla ilişkili enflamatuar süreçleri ve patolojik bozuklukları karşılaştırır.

Akciğer Transplantasyonunda Deneysel Organ Bağışı Modellerinin İncelenmesi

Keşfedin ağ farmakolojisi yöntemiyle akciğer adenokarsinomuna karşı Trichosanthes-Fritillaria thunbergii etki mekanizmasını ve PI3K/AKT yolunun rolünü. Deneysel validasyon destekler.

Ağ Farmakolojisi Akciğer Adenokarsinomuna Karşı Trikosantiz-Fritillaria Thunbergii Etki Mekanizmasının Tahmini ve Deneysel Validasyonu (Video) | JoVE Journal

Ağ Farmakolojisi Akciğer Adenokarsinomuna Karşı Trikosantiz-Fritillaria Thunbergii Etki Mekanizmasının Tahmini ve Deneysel Validasyonu

Daha fazla video keşfet