Name: Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Keşfedin civciv korioallantoik membran modeli ile insan yumurtalık dokusu transplantasyonunu. Bu yöntem, erken vaskülarizasyon ve folikül sağkalımını inceleyerek greft canlılığını altı günde %83 oranında sürdürür.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, makalenin İngilizce dilini gözden geçirdiği için BA'dan Mira Hryniuk'a teşekkür eder.

İnsan dokusunun kullanımı, Louvain Katolik Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Hastalar yumurtalık dokularının araştırma amaçlı kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.
1. Embriyonlaşma olasılığı yüksek olan 0. gün yumurtalarının sipariş edilmesi
<ol><li>Öncelikle civcivlerin yaşına bağlı olan yüksek oranda embriyonlu yumurta bildiren, laboratuvar sınıfı Lohman'ın seçtiği sertifikalı bir beyaz Leghorn yumurta tedarikçisi bulun.</li>
</ol>2. Yumurtaların kuluçka için hazırlanması
<ol><li>Yumurtalar gelmeden önce, yumurta kuluçka makinesini monte edin ve %40-60 bağıl hava neminde 37 °C'ye dengeleyin. İnkübatöre bir termometre ve higrometre yerleştirerek sıcaklığı ve hava nemini izleyin. İnkübatörün kapağının, inkübatörün iç parametrelerinin açılmasına gerek kalmadan kontrol edilmesine izin vermek için bir cam pencere ile donatıldığından emin olun (Şekil 1).</li>
	<li>Lohman'ın seçtiği beyaz Leghorn civcivlerinden 0. gün yumurtalarını sertifikalı bir laboratuvar sınıfı yumurta tedarikçisinden aldıktan sonra, kabukların yüzeyini nemlendirilmiş kağıtla temizleyin ve hemen kurutun. NOT: Yumurta kabuğu zarı gözenekli olduğundan, kontaminasyon risklerini en aza indirmek için yumurta yüzeylerini temizlemek ve kuluçka makinesi içindeki nemi kontrol etmek için otoklavlanmış su kullanılabilir.</li>
	<li>Yumurtaları bir işaretleyici kullanarak etiketleyin (örneğin, tarih ve yumurta numarası).</li>
	<li>Yumurtaları sivri uçları aşağı bakacak şekilde kuluçkaya yatırın ve CAM'nin gelişmesine izin vermek için döndürün. Yumurtaları günde iki ila üç kez manuel olarak 180° döndürün veya otomatik bir döndürücü kullanın. NOT: Yumurtaların gerçekten döndürüldüğünden emin olmak için, yumurta kabuğu bir kalem veya işaretleyici kullanılarak karşılıklı iki yan tarafta "X" ve "O" ile işaretlenebilir. Kuluçka makinesinin kapağındaki cam pencere, cihazı açmadan yumurtaların dönüşünü kontrol etmenizi sağlar.</li>
</ol>3. ED'nin 3. gününde yumurta kabuğunun açılması
NOT: ED'nin 3. gününde yumurta kabuğuna dikdörtgen bir pencere yapılır.
<ol><li>Steril koşullarda çalışmak için laminer akış başlığını hazırlayın. Aşağıdaki aletleri kaputun altına yerleştirin ve %70 etanol ile dezenfekte edin (önceden sterilize edilmemişse): -Yumurta rafı -Yumurta mumcusu veya fokal soğuk ışık kaynağı -Işaretleyici -Steril düz pim -Steril 19 G iğne -5 mL steril şırınga -Kaydırma testere bıçağı -Steril forseps -Yapışkan bant</li>
	<li>Bir yumurtayı kuluçka makinesinden kaputun altına yerleştirilmiş yumurta rafına aktarın ve yumurta döndürücüyü kapatın.</li>
	<li>Karanlıkta, yumurta mumunu (veya odak soğuk ışık kaynağını) yumurta kabuğuna yerleştirerek yumurtanın hava cebini belirleyin. Hava cebi, yumurtanın kör ucunda lokalizedir. Yumurta kabuğundaki hava cebinin merkezini tam olarak belirlemek için bir işaretleyici kullanın.</li>
	<li>Işıkları aç. Steril bir düz pimi hafifçe döndürerek yumurta kabuğunda işaretlendiği yerde küçük bir delik açın. Yaklaşık 1 mm çapında küçük bir açıklık genellikle yeterlidir. NOT: Pimi yumurtanın sonuna kadar itmemeye dikkat edin. Bu olursa, yumurtayı atın.</li>
	<li>Steril 19 G'lik bir iğneyi steril 5 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.</li>
	<li>Karanlıkta, yumurta mumunu (veya odak soğuk ışık kaynağını) kullanarak yumurta sarısı kesesini bulun ve yumurtayı 3.4°'lik steril 19 G iğne ile yumurtanın dibine doğru 45° açıyla açılan delikten delin; Yumurta sarısı kesesini bozmamaya çok özen gösterin. CAM'yi kabuktan ayırmak için 1.5-2 mL arasında albümin aspire edin ve ardından deliği bir parça yapışkan bantla kapatın. NOT: Aspirasyon sırasında yolk kesesi bozulursa, şırıngadaki aspire edilen sıvı şeffaf (albümin) yerine sarı renkli olacaktır. Böyle bir durumda, iğneyi ve şırıngayı değiştirin. Nispeten büyük miktarda yumurta sarısı emilirse, embriyonun canlılığını tehlikeye atabilir.</li>
	<li>Işıkları aç. Yumurtayı yatay olarak yerleştirin ve bir işaretleyici ile 1 cm x 1,5 cm ölçülerinde dikdörtgen bir pencere çizin. Pencereyi standart yapışkan bandın normal genişliğinden daha büyük yapmayın.</li>
	<li>Yumurtayı bir elinizde tutun ve önceden çizilmiş pencereyi bir kaydırma testere bıçağı kullanarak yumurta kabuğuna nazikçe kesin. Kabuğun çatlamadığından ve bastırılmış CAM'a kadar kesmediğinden emin olun. Kabuk tozunu ve kalıntıları temizlemek için düzenli olarak üfleyin.</li>
	<li>Steril forsepsleri dikdörtgen testere kabuğu parçasının altına kaydırın ve CAM'ye zarar vermeden temiz bir şekilde çıkarmak için ustaca kavrayın. Ek olarak, embriyoyu ve CAM'sini görebilmek için beyaz dış kabuk zarını atın. NOT: CAM'ın üzerine bir miktar yumurta kabuğu tozu veya kalıntısı düşerse, CAM'yi yırtmamaya çok dikkat ederek steril forseps kullanılarak çıkarılabilir.</li>
	<li>Canlı embriyonlu yumurtaları tanımlayın. Berrak albüminleri ve embriyonun etrafındaki vasküler halka ile fark edilebilirler, burada bazen bu aşamada bile atan bir kalp tespit edilebilir (ED'nin 3. günü). Döllenmemiş veya ölü embriyoları atın.</li>
	<li>Dehidrasyonu önlemek için yeni oluşturulan pencerenin üzerine yapışkan bant yerleştirin. Çıkarma kolaylığı için bir ucunu kendi üzerine katladığınızdan emin olun.</li>
	<li>Yumurtayı, açılan pencere yukarı bakacak ve bant CAM'a değmeyecek şekilde kuluçka makinesine geri koyun. Yumurtanın yuvarlanmasını durdurmak için katlanmış bir kağıt parçası veya yumurta rafının bir kısmını kullanın. Döner tepsinin kapalı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kalan yumurtaları açmak için 3.2-3.12 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>4. Dondurulmuş-çözülmüş insan yumurtalık dokusunun CAM'a aşılanması
NOT: CAM transplantasyonu ideal olarak ED'nin 7-10. günleri arasında başlatılmalıdır.
<ol><li>Dondurularak saklanmış yumurtalık kortikal şeritlerini, başka bir yerde açıklanan protokolü izleyerek laminer akış başlığı altında çözün30.</li>
	<li>Kortikal şeritleri 4 mm x 2 mm x 1 mm'lik üç parçaya kesin. Bir parçayı aşılanmamış kontrol olarak, diğer ikisini 1 gün veya 6 gün boyunca ksenogreftleme için kullanın. NOT: Yeterli doku varsa, iki kopya halinde çalışın.</li>
	<li>Kuluçka makinesinden bir yumurtayı, pencere yukarı bakacak şekilde kaputun altına yerleştirilmiş yumurta rafına aktarın.</li>
	<li>Bandı pencereden soyun ve embriyonun canlı olduğundan emin olun. Bu aşamada, canlı embriyolar geniş bir damar sistemine, berrak bir albüme, görünür bir kalp atışına ve bir miktar embriyo hareketine sahiptir.</li>
	<li>Epitel yüzeyine 1cm2'lik steril eter ekstrakte edilmiş lens kağıdı şeridi koyarak ve hemen çıkararak CAM'ın küçük bir alanını nazikçe travmatize ederek greftleme bölgesini hazırlayın. NOT: Membran, çift epitel tabakasının üst peridermal kısmının çıkarılmasıyla travmatize edilmedikçe ve bazal tabakayı sağlam bırakmadıkça, CAM aşılmaz bir bariyerdir. Bu teknik aynı zamanda yara iyileşmesini aktive ederek revaskülarizasyon sürecini de geliştirir. Steril eterle ekstrakte edilmiş lens kağıdı CAM üzerinde çok uzun süre kalırsa, membran lens kağıdına yapışabilir ve yırtılabilir. Bu olursa, yumurtayı atın.</li>
	<li>Dondurulmuş-çözülmüş bir yumurtalık kortikal şeridini (4 mm x 2 mm x 1 mm) mikrocerrahi forseps ile kavrayın ve medüller tarafı CAM'a karşı olacak şekilde travmatize edilmiş CAM'ın üzerine yerleştirin. Yumurta başına bir doku parçası aşılayın.</li>
	<li>Pencereyi yapışkan bantla örtün ve yumurtayı dikkatlice kuluçka makinesine geri koyun. Yumurta kabuğu açıklığının dik durduğundan ve yumurtanın sağlam olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kalan tüm dokuların greftlenmesi için 4.1-4.7 adımlarını tekrarlayın. NOT: Embriyo canlılığını değerlendirmek ve damar sistemindeki değişiklikleri izlemek için implantlar her aşılama gününde kontrol edilmelidir.</li>
</ol>5. Greftlerin toplanması
NOT: Ksenogreftler en geç ED'nin 17. gününe kadar toplanmalıdır, çünkü embriyonun bağışıklık sistemi 18. günden itibaren olgunlaşır ve yetkin hale gelir.
<ol><li>Yumurtayı bir rafa yerleştirin ve daha iyi greft görselleştirmesi ve daha kolay manipülasyon sağlamak için yumurta kabuğundaki pencereyi genişletin.</li>
	<li>Grefti makroskopik olarak değerlendirin ve CAM'ın grefte karşı vasküler reaksiyonuna özellikle dikkat edin. Kayıt için dijital fotoğraflar veya videolar çekin.</li>
	<li>Dokuyu veya çevresindeki CAM'ı forseps ile kavrayın ve grefti CAM'den dikkatlice çıkarmak için makas veya neşter kullanın. NOT: Greftler, aşılamanın yaklaşık 3. gününde ikinci bir CAM tabakası ile kaplanır ve sonunda kapsüllenir. Ayrıca 6. günde yumurtanın içine girmiş olabilirler, bu da bazı durumlarda onları geri almayı zorlaştırır.</li>
	<li>Eksize edilen dokuları, verilen deney için uygun olan herhangi bir yöntemle analiz edin. Bu çalışmada, doku parçaları paraformaldehit içine sabitlendi, parafine gömüldü ve aşağıda özetlenen adımlar izlenerek hematoksilen ve eozin ile boyandı:<ol><li>Parçaları 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve Tablo 1'de belirtilen adımlarla otomatik bir gömme cihazı kullanarak parafine gömün.</li>
		<li>Parafine gömülü blokları bir mikrotom ile 5 μm kalınlığında bölümler halinde kesmeden önce gece boyunca 4°C'de bırakın.</li>
		<li>Doku bölümlerini sıcak bir plaka (30 °C) üzerine yerleştirilmiş bir cam slayt üzerine yayın ve 2 saat, ardından 37 °C'de bir fırında 24 saat kurumaya bırakın.</li>
		<li>Daha sonra, başka bir yerde açıklanan bir protokolü izleyerek slaytları hematoksilen ve eozin ile boyayın31. Ardından, örnekleri bir slayt tarayıcı kullanarak sayısallaştırın ve bir görüntü analiz yazılımı kullanarak analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada açıklanan protokolün en zorlu kısmı, bir pencere oluşturmadan önce CAM'yi yumurta kabuğundan ayırmak için albümini aspire etmek için gereken küçük deliği yapmaktır. Çok fazla basınç uygulamak aşırı penetrasyona neden olabilir veya hatta yumurtayı çatlatabilir ve tahrip edebilir, bu da CAM ve damar sisteminde geri dönülmez hasara neden olabilir. CAM'ı ayırmaya yönelik ilk girişimler sırasında hataları minimumda tutmak için, döllenmemiş, bakkaldan satın alınan yumurtaların yumurta kabuğunda düz bir pim kullanarak kü...

Onkolojik ve benign endikasyonların yanı sıra sosyal nedenlerle doğurganlığın korunmasına olan talep son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, kötü huylu ve kötü huylu olmayan hastalıkları tedavi etmek için kullanılan çeşitli tedaviler gonadlar için oldukça toksiktir ve iyatrojenik erken yumurtalık yetmezliğine neden olabilir ve sonuçta kısırlığa yol açabilir1. Doğurganlığın korunması için yerleşik teknikler arasında embriyo kriyoprezervasyonu, olgunlaşmamış veya olgun oosit vitrifikasyonu ve yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonuyer alır 2,3,4. Yumurtalık dokusunun dondurulması, prepubertal kızlarda veya acil kanser tedavisine ihtiyaç duyan kadınlarda doğurganlığı korumak için mevcut tek seçenektir. Yumurtalık dokusu naklini takiben endokrin fonksiyonun restorasyonu, deneklerin %95'inden fazlasında görülür ve canlı doğum oranları %18 ile %42 arasında değişir5,6,7,8,9.
Dondurulmuş-çözülmüş yumurtalık dokusunun transplantasyonunun başarılı olduğu kanıtlanmış olsa da, iyileştirme için hala yer vardır. Gerçekten de, yumurtalık kortikal fragmanları vasküler anastomoz olmadan nakledildiğinden, greft revaskülarizasyonunun gerçekleştiği bir hipoksi dönemi yaşarlar 10,11,12. İnsan yumurtalık dokusu transplantasyonunu araştıran çalışmaların büyük çoğunluğu, yumurtalık dokusunun immün yetmezliği olan farelere nakledildiği bir ksenogreftleme modeli kullanmıştır. Ksenogreftlerin tam revaskülarizasyonu yaklaşık 10 gün sürer ve hem konakçı hem de greft damarları fonksiyonel damarların oluşumuna katkıda bulunur 12,13,14. Folikül rezervinin yaklaşık %50-90'ı, greft revaskülarizasyonunun tamamlanmasından önceki bu hipoksik pencerede kaybolur 10,15,16. Bu büyük folikül kaybının, greftlemeden sonra kalan mutlak folikül sayılarındaki bir azalma ile gösterildiği gibi, hem doğrudan folikül ölümü hem de folikül oranlarındaki artan büyüme oranlarına doğru değişikliklerle gösterildiği gibi ilkel folikül büyümesinin aktivasyonu yoluyla meydana geldiği kuvvetle öne sürülmüştür17,18.
İlginç bir şekilde, peritonun tipik aşılama bölgesini taklit eden bir yapıya sahip olan civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılanan çeşitli hayvan yumurtalık dokularını kullanan önceki araştırma çalışmaları, spontan folikül aktivasyonunun inhibisyonunu ve primordial folikül rezervinin 10 güne kadar bozulmadan kaldığını bildirmiştir 19,20,21,22. Ekibimiz daha önce, dondurulmuş-çözülmüş insan yumurtalık dokusunun TAT'a aşılanmasının, ilk iskemik evrelerinde insan yumurtalık dokusu transplantasyonunu araştırmak için güvenilir bir yaklaşım oluşturduğunugöstermiştir 23 ve son zamanlarda bu aşılama yönteminin folikül aktivasyonuna karşı koyabildiğinigöstermiştir 24.
CAM modeli, yalnızca yumurtaların farelerden çok daha ucuz olması nedeniyle değil, aynı zamanda TAT'ın yüksek oranda vaskülarize doğası nedeniyle de folikül aktivasyonu ile yumurtalık grefti revaskülarizasyonu arasındaki ilişkinin incelenmesine izin vermesi nedeniyle özellikle çekicidir. Kuş sistemi, aslında, anjiyogenez25'i incelemenin en yaygın ve çok yönlü yollarından biridir. Civciv embriyo gelişimi (ED) yumurtadan çıkana kadar 21 gün sürer ve CAM ilk 4-5 gün içinde allantois ve koryon26'nın füzyonu yoluyla oluşur. Özellikle, civciv embriyosu, ED'nin 17. gününe kadar doğal olarak immün yetmezliği olan bir konakçıdır, bu nedenle ksenogreftleme deneyleri, herhangi bir greft reddi riski olmadan gerçekleştirilebilir27,28. Ayrıca, TAT modeli yaklaşımı, Avrupa hukuku29 açısından herhangi bir etik veya yasal kaygı uyandırmamakta, bu da onu diğer hayvan modellerine çekici bir alternatif haline getirmektedir. Üreme koşulları ile ilgili olarak, civciv embriyolarının sadece% 40 -% 60 bağıl hava nemi ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatöre ihtiyacı vardır. Bu sınırlı deney gereksinimleri, immün yetmezliği olan farelerin kullanımına kıyasla araştırma maliyetlerini önemli ölçüde azaltır.
Burada sunulan protokol, insan yumurtalık dokusu için bir CAM ksenogreftleme modelinin geliştirilmesini tanımlamayı ve tekniğin etkinliği, greft revaskülarizasyonunun zaman çerçevesi ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığı hakkında spesifik bilgiler sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, greftleme sonrası erken folikül kaybının arkasındaki mekanizmaları araştırmak ve çeşitli ajanların (büyüme faktörleri, hormonlar, vb.) bu fenomen üzerindeki etkisini incelemek için büyük ilgi görebilir.

<table><tbody><tr><td>Agani hipodermik iğne, 19 G</td><td>Terumo Europe</td><td>AN*1950R1</td><td>Albümini aspire etmek için 19 G iğne</td></tr><tr><td>Terumo şırınga, 5 mL konsantrik Luer kilidi</td><td>Terumo Europe</td><td>SS*05LE1</td><td>5 mL steril şırınga</td></tr><tr><td>Caseviewer v2.2</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Dietil eter</td><td>Merck Chemicals</td><td>603-022-00-4</td><td>CAM'ı travmatize etmek için steril eter</td></tr><tr><td>Eosin Y sulu çözeltisi% 0.5</td> <td>Merck</td><td>1098441000</td><td>Boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Formaldehit% 4 sulu çözelti tamponlu (Formalin% 10)</td> <td>VWR</td><td>97139010</td><td>Doku fiksasyonu için kullanılan formaldehit</td></tr><tr><td>Buzdolabı</td><td>Liebherr</td><td>7081260</td><td>Buzdolabı 4 &°C; Parafin gömme için kullanılan C</td></tr><tr><td>Isıtma plakası</td><td>Schott</td><td>SLK2</td><td>Slaytları kurutmak için kullanılan sıcak plaka</td></tr><tr><td>Kuluçka</td><td>makinesi Thermo Forma Scientific 3111</td><td>10365156</td><td>Slayt inkübasyonu için kullanılan fırın</td></tr><tr><td>Leica CLS 150 XE mikroskop soğuk ışık kaynağı</td><td>Leica</td><td>CLS 150 XE</td><td>Yumurtaları mumlamak için odak soğuk ışık kaynağı</td></tr><tr><td>Lens temizleme dokusu, sınıf 541</td><td>VWR</td><td>111-5003</td><td>CAM'ı travmatize etmek için steril etere batırılacak doku</td></tr><tr><td>Mayer'in hematoksilini</td><td>MERCK</td><td>1092491000</td><td>Boyama solüsyonu</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td>Metanol</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>ThermoScientific-MICROM</td><td>HM325-2</td><td>Mikrotom</td></tr><tr><td>Pannoramik P250 Flash III</td><td>3DHISTECH</td><td>/</td><td>20x büyütmede slayt tarayıcı</td></tr><tr><td>Paraformaldehit&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1,04,00,51,000</td><td>Parafin gömme solüsyonu</td></tr><tr><td>Paraplast Plus R</td><td>Sigma</td><td>P3683-1KG</td><td>Parafin</td></tr><tr><td>Petri kabı, 60x15 mm, steril</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Steril petri kabı</td></tr><tr><td>Pim tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26016-12</td><td>Pim tutucu</td></tr><tr><td>Polyhatch</td><td>Brinsea</td><td>CP01F</td><td>Otomatik döndürücülü</td></tr> <tr><td>yumurta kuluçka makinesiKaydırma testere bıçağı, 132 mm</td><td>Sencys</td><td>/</td><td>Yumurta kabuğunda bir pencere oluşturmak için testere bıçağı</td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik geçmeli pimler</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-02</td><td>Yumurta kabuğunda delik açmak için düz pim</td></tr><tr><td>Steril-Helios&nbsp;</td><td>Angelantoni Industrie</td><td>ST-00275400000</td><td>Laminer akış başlığı</td></tr><tr><td>Superfrost Plus bords çubuk ve eacute; s 90&derece;</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>Cam kaydıraklar&nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6Al</td><td>Sakura</td><td>60320417-0711 VID6E3-1</td><td>Otomatik gömme cihazı</td></tr><tr><td>Titanyum forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11602-16</td><td>Yumurta kabuğunun çıkarılması ve yumurtalık dokusu manipülasyonu için forseps</td></tr><tr><td>Toluen, pa</td><td>VWR</td><td>28701364</td><td>Parafin gömme çözeltisi</td></tr></tbody></table>

yumurtalık dokusu transplantasyonunu İncelemek İçin bir araç olarak civciv korioallantoik membran (cam) modeli

The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

Yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu, doğurganlığı korumak için etkili bir stratejidir, ancak önemli bir dezavantajı vardır, yani anormal folikül aktivasyonu ve ölüm nedeniyle reimplantasyondan kısa bir süre sonra meydana gelen büyük folikül kaybı. Kemirgenler, folikül aktivasyonunu araştırmak için kıyaslama modelleridir, ancak maliyet, zaman ve etik hususlar giderek daha engelleyici hale gelmekte ve böylece alternatiflerin geliştirilmesini sağlamaktadır. Civciv koryoallantoik membran (CAM) modeli özellikle çekicidir, ucuzdur ve döllenmeden sonraki 17. güne kadar doğal immün yetmezliği korur, bu da insan yumurtalık dokusunun kısa süreli ksenogreftlenmesini incelemek için idealdir. TAT ayrıca oldukça vaskülarizedir ve anjiyogenezi araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu, in vitro modellere göre dikkate değer bir avantaj sağlar ve greftleme sonrası erken folikül kaybı sürecini etkileyen mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Burada özetlenen protokol, tekniğin etkinliği, greft revaskülarizasyon zaman çerçevesi ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığı hakkında spesifik bilgiler ile insan yumurtalık dokusu için bir CAM ksenogreftleme modelinin geliştirilmesini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Civciv embriyosu hayatta kalma oranları </...

Burada, insan yumurtalık dokusu için bir civciv koryoallantoik membran (CAM) ksenogreftleme modeli geliştirmek için bir protokol açıklıyoruz ve tekniğin etkinliğini, greft revaskülarizasyon zaman çerçevesini ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığını gösteriyoruz.

Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

Over dokusu nakli sonrası erken değişikliklerin gözlenmesinde TAT kullanımı, erken vaskülarizasyon ve folikül kaybı sürecini etkileyen mekanizmaların araştırılmasına olanak tanıdığı için in vitro modellere göre önemli bir avantaja sahiptir. Bu teknik ucuzdur ve ilk 17 gün boyunca doğal embriyo immün yetmezliği nedeniyle herhangi bir greft reddi riski olmadan gerçekleştirilebilir. Üstelik bu yaklaşım, Avrupa hukuku açısından herhangi bir etik veya hukuki kaygı doğurmamaktadır.Yumurta manipülasyonu için gerekli olan el becerilerini geliştirmek için en iyi stratejiye, gerçek deneyden önce embriyonlu olmayan yumurtalarla eğitim verilerek ulaşılabilir. Başlamak için, Louvain'den seçilen beyaz leghorn civcivlerinden alınan sıfır yumurtaları bir işaretleyici kullanarak etiketleyin. Yumurtaları, sivri uçları aşağı bakacak şekilde 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.Yumurtaları günde iki ila üç kez manuel olarak 180 derece döndürün. Karanlıkta, yumurta kabuğuna bir yumurta mumu yerleştirin ve bir işaretleyici kullanarak yumurta kabuğundaki hava cebinin merkezini belirleyin. Işıkları açın ve yaklaşık bir milimetrelik bir açıklık yapmak için işaretli konumda steril bir düz pimi döndürün.Yumurta mumunu kullanarak karanlıkta yumurta sarısı torbasını bulun. Yumurtayı, yumurta sarısı torbasını bozmadan, yumurtanın dibine doğru 45 derece açılı 19 gauge steril bir iğne ile delin. CAM'yi kabuktan ayırmak için 1.5 ila iki mililitre albümini aspire edin.Ardından deliği yapışkan bantla kapatın. Işıkları açın ve yatay olarak yerleştirilmiş yumurtanın üzerine 1,5 santimetre ölçülerinde dikdörtgen bir pencere çizin. Yumurtayı bir elinizde tutun ve kabuğu kırmadan bir kaydırma testere bıçağı kullanarak yumurta kabuğuna bir pencere açın.Kabuk tozunu ve kalıntıları temizlemek için düzenli olarak üfleyin. Steril forsepsleri dikdörtgen kabuk parçasının altına kaydırın ve CAM'ye zarar vermeden temiz bir şekilde çıkarın. Daha sonra embriyoyu ve CAM'ı görmek için beyaz dış kabuk zarını atın.Canlı embriyonlu yumurtalarda, civciv embriyo gelişiminin üçüncü gününde berrak albümin, embriyonun etrafında vasküler bir halka ve bazen atan bir kalp görülür. Laminer akış başlığının altına, yumurtayı pencere yukarı bakacak şekilde yumurta rafına yerleştirin ve bandı soyun. CAM'ın küçük bir alanını travmatize etmek için bir santimetre karelik steril eterle ekstrakte edilmiş lens kağıdı şeridini epitel yüzeyine nazikçe yerleştirin ve hemen çıkarın.Daha sonra donmuş çözülmüş bir yumurtalık kortikal şeridini mikrocerrahi forseps ile kavrayın ve medüller tarafı CAM'a karşı olacak şekilde travmatize edilmiş CAM üzerine yerleştirin. Grefti makroskopik olarak değerlendirin ve dijital fotoğraf veya video çekmeden önce CAM'ın grefte karşı vasküler reaksiyonuna özellikle dikkat edin. Yapıldıktan sonra, dokuyu veya çevresindeki CAM'ı forseps ile kavrayarak ve grefti makas kullanarak CAM'den dikkatlice çıkararak grefti hasat edin.Greftler, greftlemenin ilk gününden sonra vakaların %100'ünde canlıydı. Zaten CAM'a kısmen yapışıktılar ve vaskülarizasyonları için gerekli olan kan damarlarının tekerlek kollu modelini gösterdiler. Altı günlük greftlemeden sonra implantlar CAM'a yapıştırıldı.Ekimden sonraki üçüncü gün civarında, greftler ikinci bir TAT tabakası ile kaplandı ve kapsüllendi. Greft, nakillerin %80'inin yumurtaya nüfuz etmesiyle iyi bir vaskülarizasyon gösterdi. İki greft CAM'a bağlanmadı ve nekrotik bir görünüm aldı, bu da altı gün sonra greftli doku sağkalım oranının %83 olmasına neden oldu.Transplantasyonun histolojik değerlendirmesinde, tüm zaman noktalarında sağlıklı foliküller gözlendi. Transplantasyondan sonra folikül yoğunluklarında önemsiz bir azalma gözlendi. Folikül sağkalım oranları, greftleme döneminde birinci günde% 95 ve altıncı günde% 83'te tutuldu.En zorlu kısım, bir pencere uygulaması oluşturmadan önce albümini aspire etmek, CAM'yi yumurta kabuğundan ayırmak için gereken küçük deliği yapmaktır. Çok fazla basınç aşırı uyarılmaya neden olabilir veya hatta yumurtayı çatlatabilir ve tahrip edebilir, bu da CAM veya damar sisteminde geri dönülmez hasara neden olabilir. Bu model, pro-anjiyojenik faktörlerin, koruyucu antioksidan ajanların, sitokinlerin, hormonların ve folikül aktivasyonunu ve erken büyümeyi kontrol eden diğer faktörlerin etkisi dahil olmak üzere, greftleme sonrası erken yumurtalık dokusunun çeşitli yönlerini test etmek için idealdir.Bu model, yumurtalık dokusu transplantasyonundan sonra yumurtalık rezervinin azalmasına neden olan iki ana olay olan erken vaskülarizasyon ve folikül aktivasyonunun modülasyonu arasındaki bağlantıyı göstermiştir.

the-chick-chorioallantoic-membrane-cam-model-as-tool-to-study-ovarian

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Civciv chorioallantoic membran (CAM), anjiyogenez ve tümörogenez çalışmak için eşsiz bir doğal bağışık yetmezliği olan, destekleyici bir kültür ortamı. Bu video makale piliç farklı adımları gösteriyor.

Civciv Ex ovo Kültür ve Ex ovo CAM Testi: Gerçekten Nasıl Çalışır?

Bu videoda, döllenmiş bir tavuk yumurtasının yumurta kabuğunu, dallanan kan damarlarından oluşan bir ağ taşıyan koryoallantoik zarını veya CAM'sini ortaya çıkarmak için açma tekniğini açıklıyoruz. Açıkta kalan CAM, in ovo tümör modellemesi için kullanılabilir.

Yumurta Pencereleme: Korioallantoik Membran Vaskülatürünü Ortaya Çıkarmak için Döllenmiş Tavuk Yumurtası Kabuğunu Açma Yöntemi

Bu videoda, bir in ovo model oluşturmak için kanser hücrelerinin bir tavuk koryoallantoik zarına implantasyonunu açıklıyoruz. Model, jinekolojik kanserin ilerlemesini incelemek için yumurtalık kanseri hücrelerini başarıyla aşılar.

Tavuk Korioallantoik Membran Tabanlı Kanser Modellemesi: Kanser Hücresi Tümörigenezi ve Metastazı Çalışmak İçin Bir In Ovo Model

Bu videoda, perinöral invazyonu incelemek için civciv koryoallantoik membran veya CAM üzerinde dorsal kök gangliyonları ve kanser hücrelerini birlikte kültürleme yöntemini açıklıyoruz.

Civciv Korioallantoik Membran veya CAM Tümör Modeli: Tümör Hücrelerinin Perinöral İnvazyonunu Simüle Etmek İçin Bir In Ovo Yöntemi

Bu video, tümör taşıyan koryoallantoik membranın tavuk embriyosundan izolasyonunu göstermektedir. Hasat edilen CAM, daha sonraki sonraki uygulamalar için kullanılabilir.

Civciv Korioallantoik Membran Hasadı: Tavuk Yumurtasından Tümör Grefti Taşıyan Korioallantoik Membranı İzole Etmek İçin Bir Yöntem

<em&gt; Ovo</emSarkoma için bir Xenograftmodel olarak&gt; CAM-testi

Civciv koryoallantoik membran (CAM) immün yetmezliklidir ve oldukça vaskülarizedir, bu da onu doğal bir in vivo tümör büyümesi ve anjiyogenez modeli yapar. Bu protokolde, CAM testi kullanılarak üç boyutlu, vaskülarize hepatosellüler karsinom (HCC) tümörlerinin büyütülmesi için güvenilir bir yöntem tanımlanmıştır.

<em&gt; Ovo</emHepatosellüler karsinom Verimli Xenograftlarında Modeli olarak&gt; Piliç Chorioallantoic Membran (CAM) Deneyi

Perinevral invazyonu baş ve boyun skuanöz hücre karsinomları ve diğer tümörlerde agresif bir fenotiptir. Piliç chorioallantoik membran modeli anjiyogenez, kanser istilası ve metastif eğitimi için kullanılmıştır. Burada bu modelin perineval invazyonu in vivo olarak değerlendirmek için nasıl kullanılabilirler olduğunu gösteriyoruz.

Kafa ve boyun kanseri Perinevral Invazyonu değerlendirmek için Chick Chorioallantoik membran In vivo model

Tavuk koryoallantoik membran modelini jinekolojik ve ürolojik kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı tümörlerin engraftment için alternatif, nakledilebilir, in vivo modeli olarak sıyoruz.

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Bu protokol, kontrastlı ultrason görüntüleme ve mikrokabarcık aracılı ilaç dağıtımını incelemek için 5 ila 8 günlük tavuk embriyolarının ve bunların koryoallantoik membranının (CAM) in vivo bir model olarak nasıl elde edileceği ve kullanılacağına dair üç yöntemi açıklamaktadır.

Kontrastlı Ultrason Görüntüleme ve Mikrokabarcık Aracılı İlaç Dağıtım Çalışmaları için Tavuk Ex Ovo Embriyolarının ve Korioallantoik Membran Damarlarının In Vivo Model Olarak Hazırlanması

Kuş embriyosunun koryoallantoik membranı (CAM), çeşitli araştırma alanları için çok yararlı ve uygulanabilir bir araçtır. Japon bıldırcın CAM'in özel bir ex ovo modeli, fotodinamik tedavi araştırması için uygundur.

Bıldırcın Korioallantoik Membran - Fotodinamik Tanı ve Tedavi için Bir Araç

Keşfedin civciv korioallantoik membran modeli ile insan yumurtalık dokusu transplantasyonunu. Bu yöntem, erken vaskülarizasyon ve folikül sağkalımını inceleyerek greft canlılığını altı günde %83 oranında sürdürür.

Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli

Daha fazla video keşfet