Name: Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Keşfedin sığır monosit kaynaklı dendritik hücreler kullanarak aşı immünojenitesini değerlendirme yöntemini. Bu protokol, veteriner aşı araştırmalarında aday tarama ve kalite kontrol için fonksiyonel bir in vitro analiz sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hayvanların sağlık durumlarını belirleme ve BTV'yi sağlama konusundaki destekleri için Dr. Eveline Wodak ve Dr. Angelika Loistch (AGES), sığır kanı sağladığı için Dr. Bernhard Reinelt'e ve IAEA'dan Dr. Bharani Settypalli ve Dr. William Dundon'a gerçek zamanlı PCR deneyleri ve dil düzenleme konusunda yararlı tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu çalışma, sığır MoDC'lerinin üretilmesi ve fenotiplenmesi için standartlaştırılmış bir in vitro yöntemi ve bunların ticari bir aşının (örneğin, RV) aşı immünojenitesini ölçmede daha sonraki kullanımlarını göstermektedir. Sığır MoDC'leri, sığır hastalıklarına karşı potansiyel aşı antijenlerini taramak ve in vivo hayvan deneylerine geçmeden önce bağışıklık tepkilerine dayanarak potansiyel klinik etkilerini tahmin etmek için bir araç olarak kullanılabilir. Üretilen MoDC'ler morfolojik, fenotipik ve fonks...

Veteriner aşılaması, hayvancılık sektörünü küresel olarak etkileyen hastalıklara karşı koruma sağlayarak gıda güvenliğinin ve hayvan refahının iyileştirilmesine katkıda bulunduğundan, hayvancılık ve sağlığın çok önemli bir yönünü temsil etmektedir1. Olası aşı adaylarının immünojenisitesini değerlendirmek için etkili bir in vitro yöntem, aşı geliştirme ve üretim sürecini hızlandırmaya yardımcı olacaktır. Bu nedenle, immün tahliller alanını in vitro çalışmalara dayanan yenilikçi metodolojilerle genişletmek gereklidir, çünkü bu, bağışıklama ve patojen enfeksiyonu ile ilgili bağışıklık süreçlerinin karmaşıklığını ortaya çıkarmaya yardımcı olacaktır. Şu anda, periyodik örnekleme gerektiren in vivo hayvan bağışıklaması ve meydan okuma çalışmaları (örneğin, kan ve dalak), aday aşıların ve adjuvanların immünojenisitesini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu tahliller pahalı, zaman alıcı ve etik etkileri vardır, çünkü çoğu durumda hayvan ötenazisi denemelerin sonunda gerçekleştirilir.
İn vivo testlere alternatif olarak, in vitro2'de aşı kaynaklı immün yanıtları değerlendirmek için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) kullanılmıştır. PBMC'ler %70-90 lenfositler, %10-20 monositler ve sınırlı sayıda dendritik hücreden (DC'ler, %1-%2)3 oluşan heterojen bir hücre popülasyonudur. PBMC'ler, B hücreleri, monositler ve DC'ler gibi antijen sunan hücreleri (APC'ler) barındırır ve bunlar enfeksiyon veya doku hasarı belirtileri arayan organizmada sürekli devriye gezer. Lokal olarak salgılanan kemokinler, hücre yüzey reseptörlerine bağlanarak APC'lerin bu bölgelere alınmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırır. Monositler söz konusu olduğunda, kemokinler kaderlerini DC'lere veya makrofajlara farklılaşmayayönlendirir 4. DC'ler bir patojenle karşılaşıp yakaladıkları anda, sekonder lenfoid organlara göç ederler, burada işlenmiş patojen peptid antijenlerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I veya sınıf II yüzey proteinlerini kullanarak sırasıyla CD8 + T hücrelerine veya CD4 + T hücrelerine sunabilirler, böylece bir bağışıklık tepkisini tetiklerler 5,6.
DC'lerin çeşitli patojenlere karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi düzenlemede oynadığı kilit rol, özellikle enfeksiyöz ajanlara karşı aşılar ve adjuvanlar tasarlarken, onları hücre içi bağışıklık mekanizmalarını anlamak için ilginç bir araştırma hedefi haline getirmektedir7. PBMC'lerden elde edilebilecek DC'lerin fraksiyonu oldukça küçük olduğundan (% 1 -% 2), bunun yerine in vitro8'de DC'ler üretmek için monositler kullanılmıştır. Bu monosit türevi DC'ler (MoDC'ler) başlangıçta kanser immünoterapisinde olası bir tedavi stratejisi olarak geliştirilmiştir9. Daha yakın zamanlarda, MoDC'ler aşı araştırmaları için kullanılmıştır10,11,12 ve klasik monositler MoDC üretimi için baskın alt tiptir (% 89) 13. MoDC'lerin in vitro üretimi daha önce interlökin-4 (IL-4), tümör nekroz faktörü α (TNF-α) veya IL-1314,15,16 gibi diğer sitokinlerle kombinasyon halinde verilen granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörün (GM-CSF) eklenmesiyle sağlanmıştır.
Bir in vitro MoDC testinin başarısı, antijenle uyarılmış olgun MoDC'lerin, tespit edilen antijen tipine özgü immün yanıtın kapsamını ve tipini modüle etme kapasitesine dayanır17. MoDC'ler tarafından tanınan ve sunulan patojen tipi, CD4 + T yardımcı (Th) hücrelerinin Th1, Th2 veya Th17 efektör hücrelerine farklılaşmasını belirler ve patojene özgü bir sekretuar sitokin profili ile karakterize edilir. Hücre içi patojenlere karşı bir Th1 yanıtı ortaya çıkar ve fagositik bağımlı korumayı modüle eden interferon-gama (IFN-γ) ve tümör nekroz faktörü beta'nın (TNF-β) salgılanmasıyla sonuçlanır. Paraziter organizmalara karşı bir Th2 yanıtı tetiklenir ve fagositik bağımsız humoral korumayı başlatan IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 sekresyonu ile karakterizedir. Th17, IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ve TNF-18,19,20,21 salgılanmasının aracılık ettiği hücre dışı bakteriyel ve fungal enfeksiyonlara karşı nötrofil bağımlı koruma sağlar α. Önceki çalışmalara dayanarak, tüm patojenlerin beklenen sitokin profiline girmediği belirtilmiştir. Örneğin, dermal MoDC'ler, Leishmania paraziter enfeksiyonuna yanıt olarak, CD4 + T hücrelerinden ve CD8 + T hücrelerinden IFN-γ sekresyonunu uyarır, böylece koruyucu bir proinflamatuar Th1 yanıtını indükler22.
Ayrıca, Salmonella lipopolisakkarit (LPS) ile astarlanmış tavuk MoDC'lerinde, hem Th1 hem de Th2 yanıtlarını aktive ederek Salmonella typhimurium'a karşı değişken bir yanıt indükleyebileceği, oysa Salmonella gallinarum'un tek başına bir Th2 yanıtını indüklediği gösterilmiştir, bu da ikincisinin MoDC klirensi23'e karşı daha yüksek direncini açıklayabilir. MoDC'lerin Brucella canis'e (B. canis) karşı aktivasyonu hem köpek hem de insan MoDC'lerinde de bildirilmiştir, yani bu zoonotik bir enfeksiyon mekanizmasını temsil edebilir24. B. canis ile astarlanan insan MoDC'leri, şiddetli enfeksiyona direnç kazandıran güçlü bir Th1 yanıtını indüklerken, köpek MoDC'leri, azaltılmış bir Th1 yanıtı ile baskın bir Th17 yanıtını indükler ve daha sonra kronik enfeksiyonun kurulmasına yol açar25. Sığır MoDC'leri, immünoglobulin G (IgG) ile konjuge edilmiş ayak ve ağız hastalığı virüsü (FMDV) için, tek başına konjuge olmayan FMDV'ye kıyasla gelişmiş bir afinite gösterir, çünkü MoDC'ler önceki10'a yanıt olarak bir viral-antikor kompleksi oluşturur. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MoDC'lerin patojen enfeksiyonu sırasında bağışıklık tepkilerinin karmaşıklığını analiz etmek için nasıl kullanıldığını göstermektedir. Adaptif immün yanıtlar, lenfosit proliferasyonu ile ilişkili spesifik belirteçlerin nicelleştirilmesi ile değerlendirilebilir. Sadece bölünen hücrelerde tespit edilen hücre içi bir protein olan Ki-67, proliferasyon çalışmaları için güvenilir bir belirteç olarak kabul edilir 26 ve benzer şekilde, aktivasyonun geç fazı sırasında T hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilen CD25, lenfosit proliferasyonunakarşılık gelir 27,28.
Bu çalışma, sığır MoDC'lerinin in vitro jenerasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem ve ardından aşıların immünojenisitesini test etmek için kullanılan in vitro immün tahlilde uygulanmasını göstermektedir. Bu tahlilin etkinliğini doğrulamak için ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı (RV) kullanılmıştır. T lenfosit aktivasyonu ve proliferasyonu, Ki-67 ve CD25 gibi iyi bilinen hücre aktivasyon belirteçlerinin analizi ve IFN-γ28,29,30,31 sekresyonu yoluyla akım sitometrisi, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldü. MoDC testi sırasında hiçbir hayvan veya insan deney denemesi yapılmaz.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Tamponu</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td>Hasat edilmiş PBMC Fraksiyonunda kalıntı RBC'lerin parçalanması için Amonyum-Klorür-Potasyum tamponu</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Heparin Tüpleri</td><td>Becton, Dickinson (BD) ve Şirket</td><td>366480</td><td>10 mL, katkı maddesi sodyum heparin 158 USP birimleri, cam tüp, 16 x 100 mm boyutunda</td></tr><tr><td>Sığır Dendritik Hücre Büyüme Kiti</td><td>Bio-Rad, İngiltere</td><td>PBP015KZZ</td><td>Rekombinant sığır IL-4 ve GM-CSF</td></tr><tr><td>Sığır IFN-&gama'dan oluşan sitokin kokteyli; ELISA Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA5638KZZ</td><td>Kiti IFN-&gama ölçümü için kullanın; kültür süpernatant</td></tr><tr><td>CD14 Antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2678F</td><td>Fare anti-sığır CD14 monoklonal antikor, klon CC-G33, izotip IgG1</td></tr><tr><td>CD25 Antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2430PE</td><td>Fare anti sığır CD25 monoklonal antikor, klon IL-A11, izotip IgG1</td></tr><tr><td>CD4 Antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1653A647</td><td>Fare anti sığır CD4 monoklonal antikoru, klon CC8, izotip IgG2a</td></tr><tr><td>CD40 Antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2431F</td><td>Fare anti-sığır CD40 monoklonal antikoru, klon IL-A156, izotip IgG1</td></tr><tr><td>CD8 Antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA837F</td><td>Fare anti sığır CD8 monoklonal antikor, klon CC63, izotip IgG2a</td></tr><tr><td>CD86 Antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2437PE</td><td>Fare anti-sığır CD86 monoklonal antikoru, klon IL-A190, izotip IgG1</td></tr><tr><td>CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Bio-Rad-Termal</td><td></td> <td>döngüleyici PCR makinesi</td></tr><tr><td>Corning Santrifüj Tüpü</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352096 & 352070</td><td>15 mL ve 50 mL, yüksek berraklıkta poypropilen konik tabanlı, dereceli, steril, contalı vidalı kapak, şahin tüpü</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Plus</td><td>BD Bio Sciences</td><td>555028</td><td>BD golgiPlug ile fiksasyon/geçirgenlik kiti, akış sitometresi hücre boyama için kullanın</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1009832500</td><td>Analiz için mutlak EMSURE&nbsp; ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td>Nitelikli, ısıyla inaktive edilmiş</td></tr><tr><td>Ficoll Plak PLUS</td><td>GE Health care Yaşam Bilimleri, ABD</td><td>341691</td><td>Lenfosit izolasyon ortamı</td></tr><tr><td>FlowClean Temizlik Maddesi</td><td>Beckman Coulter, Yaşam Bilimleri</td><td>A64669</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) ve Company, LLC, ABD-</td><td></td><td>Akış sitometresi Histogram yazılımı</td></tr><tr><td>FlowTubes/ FACS&nbsp; (Floresanla aktive edilen tek hücreli sıralama) Tüp</td><td>Şahin Corning&nbsp;</td><td>352235</td><td>5 mL, steril, hücre süzgeci geçmeli kapaklı yuvarlak tabanlı polistiren test tüpü, akış sitometrisi analizinde kullanım</td></tr><tr><td>Floreseinizotiosinat-Dekstran</td><td>Sigma Aldrich, Almanya</td><td>60842-46-8</td><td>FITC-dextran MW</td></tr><tr><td>Gallios Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter-Flow</td><td></td> <td>sitometre makinesi</td></tr><tr><td>Sert Kabuklu 96 Kuyulu PCR Plakaları</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>96 kuyulu, düşük profilli, ince duvarlı, etekli, beyaz/berrak</td></tr><tr><td>İnsan CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Bioteck, Almanya</td><td>130-050-201</td><td>PBMC'lerden sığır monositlerinin seçimi için kullanılan monoklonal anti-insan CD14 antikor izotipi IgG2a'ya konjuge 2 mL mikroboncuklar</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman Coulter,</td> <td>Almanya-Flow</td> <td>sitometre çok renkli veri analiz yazılımı</td></tr><tr><td>MACS Sütunu</td><td>Miltenyi Bioteck, Almanya</td><td>130-042-401</td><td>Hücre yüzeyi antijenlerine dayalı olarak çeşitli CD14 hücre popülasyonunun ayrılması için manyetik aktive hücre sınıflandırması veya immün macentik hücre ayırma sütunu</td></tr><tr><td>MHC Sınıf II DQ DR Polimorfik Antikor</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2228F</td><td>Fare anti-koyun MHC Sınıf II DQ DR Polimorfik: FITC, klon 49.1, izotip IgG2a, sığır ile çapraz reaktif</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4325</td><td>1.5 mL, konik tabanlı, dereceli, steril tüp</td></tr><tr><td>Microsoft Power Point</td><td></td> <td>Microsoft-Deneysel</td> <td>tasarımın grafiksel çizimleri</td></tr><tr><td>Fare IgG1 Negatif Kontrol: CD14, CD40 Antikoru için FITC</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928F</td><td>İzotip kontrolü CD14 ve CD40 monoklonal antikor&nbsp;</td></tr><tr><td>Fare IgG1 Negatif Kontrol: CD86 Antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>İzotip kontrolü CD86 monoklonal antikoru için PE&nbsp;</td></tr><tr><td>Fare IgG1 Negatif Kontrolü: CD25 Antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>İzotip kontrolü CD25 monoklonal antikoru için RPE&nbsp;</td></tr><tr><td>Fare IgG2a Negatif Kontrolü: MHC Sınıf II Antikor</td><td>Bio-Rad için</td> FITC <td>MCA929F</td><td>MHC sınıf II monoklonal antikor için izotip kontrolü&nbsp;</td></tr><tr><td>Nobivac Kuduz</td><td>MSD Hayvan Sağlığı, UK-1</td><td></td> <td>& > 2 IU/mL Kuduz virüsü suşu içeren L / mL hücre kültürü inaktive aşı</td></tr><tr><td>Optik contalar</td><td>Bi0-Rad</td><td>TCS0803</td><td>0.2 mL düz PCR tüpü 8 kapaklı şeritler, optik, ultra şeffaf, qPCR makinesi için uyumlu</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin (PBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>pH 7.4, 1x konsantrasyon</td></tr><tr><td>Prizma - GraphPad 5 Yazılımı&nbsp;</td><td>Dotmatics-İstatistiksel</td><td></td> <td>yazılım</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Anti-insan Ki-67 antikoru</td><td>Biolegend, ABD</td><td>350501</td><td>Monoklonal antikor, inekle çapraz reaktif, klon ki-67</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Fare IgG1 k İzotip Ctrl Antikor</td><td>Biolegend</td><td>400101</td><td>Ki-67 monoklonal antikor için izotip kontrolü</td></tr><tr><td>READIDROP Probidium İyodür</td><td>BD Bio Sciences</td><td>1351101</td><td>Akış sitometrisi, amin reaktif boya</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-2 Protein R</td><td>& için kullanılan canlı / ölü hücre belirteci D Sistemi, ABD</td><td>202-IL-010 / CF</td><td>İnterlökin-2, 20 ng / ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Toplam RNA'nın ekstraksiyonu için kit kullanımı; RLT tamponu = lizis tamponu; RW1 tamponu = sıkı guanidin içeren yıkama tamponu; RDD tamponu = DNaz tamponu; RPE tamponu = hafif yıkama tamponu; RNaseOUT = RNase inhibitörü.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>L-glutamin ve sodyum bikarbonat içeren hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>SMART-servier medical art&nbsp;</td>Creative <td>Commons Attribution 3.0 unported lisansı altında</td> <td>Les Laboratories Servier-Lisanslı</td><td></td></tr> <tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5270</td><td>2x qPCR karışım conatins dNTP'ler, Ss07d füzyon polimeraz, MgCl2, SYBR Green I supermix = süpermiks, ROX normalizasyon boyaları.</td></tr><tr><td>SuperScript III Birinci İplikli Sentez Sistemi</td><td>Invitrogen,</td><td>cDNA sentezi için</td>Thermo Fisher <td>18080051</td> Kiti</tr><tr><td>Doku Kültürü Test plakası 24</td><td>TPP, İsviçre</td><td>92024</td><td>24 oyuklu plaka, radyasyonla sterilize edilmiş, büyümesi arttırılmış, hacim 3.18 mL</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>%0.4, 100 mL, hücre canlılığını</td></tr> <tr><td>değerlendirmek için boyaUltraPure DNase / RNase İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>İnvitrojeni, Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>0.1 & m membran filtrelenmiş damıtılmış su</td></tr><tr><td>VACUETTE Heparin Kan Alma Tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206067</td><td>VACUETTE Heparin Kan Alma Tüpleri yeşil bir üst kısma sahiptir ve iç duvarlarında püskürtülerek kurutulmuş lityum, sodyum veya amonyum heparin içerir ve klinik kimya, immünoloji ve serolojide kullanılır. Antikoagülan heparin, pıhtılaşma kaskadını bloke eden ve böylece bir tam kan/plazma örneği üreten antitrombini aktive eder.</td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W3500-1L</td><td>Steril filtreli, hücre kültürüne uygun bioReagent</td></tr></tbody></table>

sığır monosit kaynaklı dendritik hücreler kullanılarak aşı İmmünojenitesinin belirlenmesi

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritik hücreler (DC'ler), bağışıklık sistemi içindeki en güçlü antijen sunan hücrelerdir (APC'ler). Patojen arayan organizmayı devriye gezerler ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini birbirine bağlayarak bağışıklık sistemi içinde benzersiz bir rol oynarlar. Bu hücreler fagositleşebilir ve daha sonra yakalanan antijenleri efektör bağışıklık hücrelerine sunarak çeşitli immün yanıtları tetikleyebilir. Bu yazıda, sığır periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole edilen sığır monosit türevi dendritik hücrelerin (MoDC'ler) in vitro jenerasyonu ve aşı immünojenitesinin değerlendirilmesinde uygulanması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir.
CD14 + monositlerini PBMC'lerden izole etmek için manyetik bazlı hücre sıralama kullanıldı ve CD14 + monositlerin naif MoDC'lere farklılaşmasını indüklemek için interlökin (IL)-4 ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile tam kültür ortamının takviyesi kullanıldı. Olgunlaşmamış MoDC'lerin oluşumu, majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II), CD86 ve CD40 hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonu tespit edilerek doğrulandı. Ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı, daha sonra naif lenfositlerle birlikte kültürlenen olgunlaşmamış MoDC'lerin nabzını tutmak için kullanıldı.
Antijen atımlı MoDC'lerin ve lenfosit ko-kültürünün akım sitometri analizi, Ki-67, CD25, CD4 ve CD8 belirteçlerinin ekspresyonu yoluyla T lenfosit proliferasyonunun uyarıldığını ortaya koydu. IFN-γ ve Ki-67'nin mRNA ekspresyonunun kantitatif PCR kullanılarak analizi, MoDC'lerin bu in vitro ko-kültür sisteminde lenfositlerin antijene özgü astarlanmasını indükleyebileceğini göstermiştir. Ayrıca, ELISA kullanılarak değerlendirilen IFN-γ sekresyonu, kuduz aşısı darbeli MoDC-lenfosit ko-kültüründe, antijen darbeli olmayan MoDC-lenfosit ko-kültürüne göre anlamlı derecede daha yüksek bir titre (**p < 0.01) göstermiştir. Bu sonuçlar, aşı immünojenitesini ölçmek için bu in vitro MoDC testinin geçerliliğini göstermektedir, yani bu tahlil, in vivo denemelere devam etmeden önce sığırlar için potansiyel aşı adaylarını tanımlamak ve ticari aşıların aşı immünojenisite değerlendirmelerinde kullanılabilir.

Bu metodoloji, in vivo çalışmalar yapılmadan önce aday aşı antijenlerinin değerlendirilmesi için sığır MoDC'lerinin in vitro jenerasyonunu açıklamaktadır. Şekil 1, sığır MoDC üretiminin deneysel şemasını ve MoDC'lerin in vitro tahlil için uygulanmasını göstermektedir. Manyetik bazlı hücre sıralama tekniğini kullanarak, daha önce 50 mL sığır kanından izole edilen hasat edilen PBMC'lerden yaklaşık 26 milyon CD14 + miyosit toplamak mümkündü. CD14+ monosit i...

Metodoloji, sığır monosit kaynaklı dendritik hücrelerin (MoDC'ler) oluşumunu ve sığırlarda potansiyel veteriner aşılarının geliştirilmesi sırasında antijenik adayların in vitro değerlendirilmesi için uygulamalarını açıklamaktadır.

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Bu protokol, in vivo çalışmalardan önce aşı immünojenitesini ölçmek için sığır monosit türevi dendritik hücrelerin kullanıldığı fonksiyonel bir in vitro tahlili temsil eder. Bu nedenle, hayvancılık aşısında mevcut bir boşluğu doldurmak. Dendritik hücrelerin üretilmesi ve uygulanmasıdır.En güçlü antijen sunan hücreler olan dendritik hücreler, aşı etkinliği de dahil olmak üzere hücre içi bağışıklık mekanizmalarını anlamak için kilit bir araştırma hedefi haline gelmiştir. Bu tahlil, aşı adaylarının taranmasında bir araç olarak, aşı üretimi için bir kalite kontrol durumu olarak ve antijen ve adjuvan seçimi için uygulanabilir. Prosedürü gösteren, hayvansal üretim ve sağlık laboratuvarında bilim adamı Richard Kangethe olacak.Baldırın juguler ven delinmesinden elde edilen kanı heparinize vakumerlerle ters çevirerek ve karıştırarak başlayın. Daha sonra 20 mililitre heparinize kanı steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ile seyreltin. Pipet, 15 mililitre lenfosit izolasyon ortamını steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve tüpü 45 derecelik bir konuma getirin.25 mililitrelik bir pipet kullanarak lenfosit izolasyonunun üzerine 30 mililitre kan PBS ortamını dikkatlice katlayın ve santrifüj etmeden önce tüpü yavaşça dikey konuma getirin. Daha sonra bir Pasteur pipeti kullanarak ince beyaz periferik kan mononükleer hücre tabakasını veya PBMC tabakasını toplayın ve yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Hasat edilen PBMC'leri yıkama başına 40 mililitre PBS kullanarak iki kez yıkayın ve iyice karıştırın.Santrifüjlemeden sonra, pelet 15 mililitre amonyum klorür potasyum tamponu veya ACK tamponunda tekrar askıya alın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakikalık inkübasyondan sonra, 40 mililitreye kadar PBS ekleyin ve tüpü maksimum hızlanma ve yavaşlama ile santrifüj edin. Peleti 10 mililitre tam kültür ortamında tekrar askıya alın.Daha sonra 10 milyon hücre başına beş mikrolitre CD14 MicroBead tamponu ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Akış sitometri analizi için, PBMC'lere 10 mikrolitre CD14 floresein izotiyosiyanat veya FITC boyama antikoru ekleyin ve akış sitometrisine devam etmeden önce dört ila sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. Lekesiz PBMC'lere, bir mililitre faks arabelleği ekleyin ve 500 g ve dört santigrat derecede yedi dakika boyunca santrifüj edin.Daha sonra peleti 100 milyon hücre başına 500 mikrolitre faks tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, immünomanyetik hücre ayırma kolonunu separatöre yerleştirin ve akışı toplamak için kolon çıkışının altına 50 mililitrelik bir toplama tüpü yerleştirin. Kolonu bir mililitre gazdan arındırılmış faks tamponu ile yıkadıktan sonra, kullanılmış 15 mililitrelik tüpü yenisiyle değiştirin.Bir seferde 500 mikrolitre tamponda yüz milyon hücreyi pipetleyin, hücre süspansiyonunun kolondan geçmesine izin verin. Ardından, her seferinde üç mililitre gazdan arındırılmış faks arabelleği ile sütunu üç kez durulayın. Akış boyunca toplandıktan sonra, ilk salınımlı naif lenfosit fraksiyonunu CD14 negatif hücre fraksiyonu olarak etiketleyin.Kolonu separatörden çıkarın ve atık su toplama için kolonun altına yeni bir steril 15 mililitrelik tüp yerleştirin. Sütuna beş mililitre faks arabelleği ekleyin ve pistonu kullanarak hemen itin. İkinci akış veya naif monosit fraksiyonunu CD14 pozitif hücre fraksiyonu olarak toplayın ve etiketleyin.Mililitre başına 1 milyon hücreye ulaşmak için hasat edilen CD14 pozitif monositlere tam kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, steril 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna, her bir kuyucuğu kit içinde sağlanan 40 mikrolitre sitokin kokteyli ile takviye etmeden önce bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. İkinci günde, her bir kuyucuğun içeriğinin yarısını bir pipet kullanarak ayrı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.1.5 mililitrelik tüpleri yedi dakika boyunca 500g'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı atın ve peleti 500 mikrolitre taze tam kültür ortamında yeniden askıya alın. Bu yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini karşılık gelen kuyucuklara geri aktarın, böylece kuyudaki son hacim bir mililitre olur. Her bir kuyucuğu 20 mikrolitre sitokin kokteyli ile zenginleştirin.Antijen darbeli MoDC'ler üretmek için, 24 kuyucuklu plakadaki bir mililitre naif MoDC kültürüne mililitre kuduz virüsü aşısı veya RV süspansiyonu başına bir mikrolitre ekleyin ve plakayı% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. Yedinci günde, antijen darbeli MoDC'leri içeren 24 kuyucuklu plakayı, kuyu başına bir mililitre buz gibi soğuk PBS eklemeden ve iyice karıştırmadan önce 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Kuyucukları iki mililitre buz gibi PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuktaki artık hücreleri toplayın ve yıkanmış içeriği kendi tüplerine aktarın. Hücre süspansiyonunu yedi dakika boyunca 500g'de santrifüj edin.Süpernatanı attıktan sonra, mililitre başına 100.000 hücrenin nihai konsantrasyonunu ayarlamak için antijen darbeli MoDCs hücre peletini tam bir kültür ortamında yeniden askıya alın. MoDC-lenfosit ko-kültürü için, antijen nabzının yedinci gününde steril 24 delikli bir plakanın kuyularını, bir mililitre naif lenfosit hücre süspansiyonu ve bir mililitre antijen darbeli veya antijen darbeli olmayan MoDC süspansiyonu ile tohumlayın. İki günlük inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğu mililitre rekombinant interlökin-2 başına 20 nanogram ile destekleyin ve inkübasyona 120 saat daha devam edin.14. günde, ortak kültürün bir mililitresini steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü santrifüj edin. Daha sonra hücre peletini bir mililitre antijen darbeli veya darbesiz MoDC'lerle yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve hücre süspansiyonlarını karşılık gelen kuyucuklarına aktarın.PBMC'lerin ve naif lenfositlerin ve monositlerin hücre yüzeyinde boyanmasından sonra, hücre süspansiyonunun bir mililitresini bir pipet ve santrifüj kullanarak 500 g'da 10 dakika boyunca steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra peleti bir mililitre PBS'de tekrar askıya alın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ayrıca artık hücreleri ve ilgili tüpleri bir mililitre PBS kullanarak toplayın.Daha sonra hücreleri içeren 15 mililitrelik tüpe 10 mililitre PBS ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüpü 850g'de yedi dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantı çıkarın ve süpernatanı boşalttıktan sonra kalan artık süspansiyonla hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu V tabanlı 96 delikli bir plakaya aktarın ve dökülmeyi önlemek için kuyucukları kapatın.Boyama tamamlandıktan sonra, akış sitometresi analizini gerçekleştirin. Gerçek zamanlı önizlemeden, voltaj, kazanç ve hücre boyutu dahil olmak üzere floresan eşiğini ayarlayarak sonunda herhangi bir hücresel enkazı hariç tutarken istenen hücre popülasyonunun etrafına kapılar çizin. CD14 hücre boyama ve akım sitometrisi, naif monosit fraksiyonunun %98 CD14 pozitif monosit hücreden oluştuğunu ve fonksiyonel olarak antijen alımı yapabildiğini göstermiştir.MHC Sınıf 2 ve yardımcı uyarıcı CD86 ve CD40 hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek fenotipik olarak karakterize edilen naif MoDC'ler, dendritik hücreleri veya DC benzeri fenotipi doğruladı. Dokuzuncu günde MoDC lenfosit ko-kültürü sırasında, RV darbesinde MoDC'lere dendrit yayılımını gösteren morfolojik bir değişiklik gözlendi. Darbeli olmayan MoDC lenfosit kültürü ile karşılaştırıldığında, pulse MoDC lenfosit ko-kültüründe 16. günde CD4 pozitif ve CD8 pozitif T-hücreleri üzerindeki Ki67 ve CD25 aktivasyon belirteçlerinin upregülasyonu ile lenfosit proliferasyonunda anlamlı bir artış gösterilmiştir.Olgun RV darbeli MoDC ko-kültürlerinden CD8 pozitif T hücreleri, spesifik olmayan gruba kıyasla Ki67'nin sekiz kat yukarı regülasyonunu sergiledi. Aynı kokültürdeki CD4 pozitif hücreler, kontrollere kıyasla Ki67'de yedi kat artış gösterdi, bu da RV astarlanmış MoDC'lerin RV antijenini naif lenfositlere sunma ve bunları in vitro bir durumda aktive etme yeteneğini gösterdi. Ko-kültürlerin qPCR ölçümü, GAPDH'yi kalibratör olarak kullanan tüm ko-kültürlerde interferon gama ekspresyonunda% 30'dan fazla artış ve Ki67 ekspresyonunda% 5'ten fazla artış göstermiştir.RV darbeli MoDC lenfosit ko-kültüründe, spesifik olmayan tedavi grubuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksek salgılanan interferon gama konsantrasyonu gözlendi. Katmanlama adımını çok yavaş ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirin, kanın lenfosit izolasyon ortamının üzerine serilmesini sağlayın. Diğer katmanlardan çok fazla malzeme toplamadan tüm PBMC'leri toplamak için ekstra dikkatli olun.Flow sitometri, ELISA ve kantitatif PCR gibi diğer yöntemler, diğerlerinin yanı sıra, immün belirteçlerin aktivasyonunu değerlendirmek için bu işlemden sonra uygulanabilir.

determination-vaccine-immunogenicity-using-bovine-monocyte-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, piyasada bulunan aşıların immünojenisitesini ölçmek için monositten türetilmiş dendritik hücreli, MoDC tabanlı bir test gösterilmektedir. MoDC tahlilleri, antijenlere, patojenlere veya tedavilere karşı dendritik hücre tepkilerini araştırır ve bağışıklık tepkileri, aşı geliştirme ve immünoterapi araştırmaları hakkında bilgi sağlayabilir.

Lenfosit Proliferasyonunu İndüklemek için Aşı Darbeli Dendritik Hücre Bazlı İn Vitro Test

Tümör immünoterapide kullanım için otolog dendritik hücreler, çok sayıda (DC'ler) oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan yöntem tarif edilmektedir. Gibi bir yöntem monositlerden DC'ler ayırt etmek için, IL-4 ve GM-CSF kullanır. Bu hastaya geri enjekte edilmeden önce olgunlaşmamış DC'lerin olgun ve daha sonra antijen ile yüklenir için uyarılır.

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

Uzun süreli kültürlenmiş interferon-γ enzime bağlı immünospot deneyi merkezi bellek tepkilerinin bir ölçüsü olarak kullanılır ve koruyucu, anti-mikobakteriyel aşı cevabı ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Bu testte, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, mikobakteriyel antijenlerin ve interlökin-2, 14 gün için, etkinleştirme farklılaşma ve merkezi bellek T hücrelerinin genişlemesi ile stimüle edilir.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Burada, insan anti-pıhtılaşmış kanının yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra periferik kan mononükleer hücrelerinden manyetik boncuk ayrılması ile monositlerin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. 5 günlük inkübasyonun ardından, insan monositleri olgunlaşmamış dendritik hücrelere ayrılır ve klinik olmayan bir ortamda deneysel prosedürler için hazır hale gelir.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Bakteriyel bir yüzey hızlı antijen görüntülemek için yeni bir teknik olan yüzey biotinylation proteinler füzyon monomeric avidin ile ilgi maruz takip içerir sunulur. BCG seçili antijenleri ile başarıyla yükleme yüzey dekorasyon geleneksel genetik yaklaşımlar yerine düşündüren onun immünojenisite geliştirir.

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

Lenfoid dendritik hücre aktivasyonu sınamak için lenfatik doku sonraki çıkarma deneysel yordamları bir immunostimulating nanomaterial tedaviden sonra açıklanmıştır.

Immunostimulatory Ajan değerlendirme: Lenfoid doku çıkarma ve Enjeksiyon rota bağımlı dendritik hücre aktivasyonu

Model antijen ovalbumin'in in vivo dendritik hücre hedeflemesi için endositoz reseptörüne özgü antikora kimyasal konjugasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, antikorun saflaştırılmasını, antijenin kimyasal konjugasyonunu, ayrıca konjugenin saflaştırılmasını ve verimli konjugasyonun doğrulanmasını içerir.

Vitro ve In Vivo'da Fare Dendritik Hücrelerini Hedeflemek için Tam Uzunlukta Proteinli Saflaştırılmış DEC-205 Yönlendirilmiş Antikorun Kimyasal Konjugasyonu

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

İnsan CD14+ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Keşfedin sığır monosit kaynaklı dendritik hücreler kullanarak aşı immünojenitesini değerlendirme yöntemini. Bu protokol, veteriner aşı araştırmalarında aday tarama ve kalite kontrol için fonksiyonel bir in vitro analiz sunar.

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet