Name: Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanılarak Viral Enfeksiyon Üzerine İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerindeki Değişikliklerin İzlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Öğrenin, empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizi ile viral enfeksiyon sırasında insan umbilikal ven endotel hücrelerindeki morfolojik değişiklikleri sürekli izleme yöntemini. Bu protokol damar bütünlüğü araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Malezya Yüksek Öğrenim Bakanlığı'ndan Yüksek Kurum Mükemmeliyet Merkezi (HICoE) programı (MO002-2019) kapsamında destek ve Uzun Vadeli Araştırma Hibe Programı (LRGS MRUN Faz 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) kapsamında fon almıştır.

1. Hücre hazırlığı
<ol><li>HUVEC'lerin Hazırlanması<ol><li>%10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 12 mL endotel hücre ortamı (ECM) içeren 75cm2 (20 μg/mL kollajen tip 1 ile kaplanmış) hücre kültürü şişesinde 7,5 x 105 HUVEC hücresi/mL büyütün, HUVEC'lerin kültürü için gerekli büyüme faktörleri, hormonlar ve proteinleri içeren %0,01 endotel hücre büyüme takviyesi (EKGS), ve% 0.01 penisilin-streptomisin (P / S). Hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de% 5 CO2 ile inkübe edin (Şekil 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. RTCA deneyinin kurulumu
<ol><li>RTCA'da çalışan direnç doğrulama<ol><li>Uygulamayı başlatmak için masaüstündeki RTCA yazılım simgesine çift tıklayın. Bir oturum açma penceresi görünecektir, oturum açmak için kullanıcı adını ve şifreyi yazın.</li>
		<li>Hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna A96 kuyucuğu içe bakacak şekilde 1 oyuklu bir RTCA direnç plakası yerleştirin.</li>
		<li>RTCA yazılımının Exp Notes (Deneyim Notları ) sekmesinde deney adını, cihaz SN'sini ve cihaz tipini (QC plakası) yazın.</li>
		<li>RTCA yazılımının Hücre sekmesi altındaki Düzen sekmesinde, tüm kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan (gri) emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın.</li>
		<li>RTCA yazılımının Schedule (Zamanlama ) sekmesinde Step_1 tıklatın. Süpürme: 10 ve Aralık: 30 s'yi girin. Apply (Uygula) seçeneğini tıklayın. Doğrulama çalıştırmasını başlatmak için yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın. NOT: "Plaka Tarandı. Bağlantılar Tamam" sayfanın alt kısmında.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri analizi için direnç doğrulama çalıştırması<ol><li>Hücre Dizini sekmesinde, çalıştırmanın tamamlanmasının ardından verileri kontrol edin. Tüm CI değerleri 0,063'ten küçük olmalıdır.</li>
		<li>Hücre Dizini sekmesinin alt kısmında, ham tarama verilerini kontrol edin. Ham tarama verileri, 40,0 ± 2,0 (A ve H satırları), 67,5 ± 2,5 (B ve G satırları), 93,6 ± 2,9 (C ve F satırları) ve 117,6 ± 3,2 (D ve E satırları) yinelenen değer desenleri göstermelidir.</li>
		<li>Doğrulama çalıştırmasını durdurmak için Plaka > Serbest Bırakma Plakası'na tıklayın. 96 kuyulu RTCA direnç plakası artık RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.</li>
	</ol></li>
	<li>RTCA'da arka plan okuması elde etme<ol><li>Kollajen tip 1 kaplı özel altın-mikroelektrot plakasını (20 μg/mL kollajen tip 1 ile kaplanmış) 60 μL/kuyu Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS; sodyum bikarbonat ile, kalsiyum klorür ve magnezyum sülfat olmadan) 2x ile yıkayın.</li>
		<li>Kalan HBSS'yi atın ve 50 μL/kuyucuk ECM ekleyin. ECM içeren özel altın-mikroelektrot plakasını, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin.</li>
		<li>RTCA yazılımının Exp Notes sekmesinde deney adını, cihaz SN'sini ve cihaz türünü (96 kuyucuklu format) yazın.</li>
		<li>RTCA yazılımının Hücre sekmesi altındaki Düzen sekmesinde, kullanılacak kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan (gri) emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın.</li>
		<li>RTCA yazılımının Zamanlama sekmesinde, Step_1'ye tıklayın ve bir arka plan okuması elde etmek için yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın. NOT: "Plaka Tarandı. Bağlantılar Tamam" sayfanın alt kısmında.</li>
		<li>Arka plan okuması elde edildikten sonra, özel altın-mikroelektrot plakası artık hücre tohumlama için hazırdır ve RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Özel altın-mikroelektrot plakasında HUVEC hazırlığı<ol><li>HUVEC'leri özel altın-mikroelektrot plakasına 50 μL/kuyucuk şartlandırılmış ortam, 1 x 104 hücre/kuyucuk (şartlandırılmış ortam: %10 FBS, %0.01 EKGS ve %0.01 P/S ile desteklenmiş ECM) ile tohumlayın. %5 CO 2 ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe gece inkübasyonu için A1 kuyusu içe bakacak şekilde plakayı tekrar RTCA istasyonunayerleştirin. NOT: Bir hemositometre kullanılarak iki seyreltme faktörü ile hücre süspansiyonu üzerinde bir hücre sayımı yapıldı.</li>
		<li>Zamanlama sekmesinde, sol üst köşedeki Adım Ekle'ye tıklayın. Step_2'e tıklayın ve Süpürmeler: 601 ve Aralık: 2 dk'yı değiştirin. Step_2'e tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.</li>
		<li>20 saatlik inkübasyondan sonra ve Kuyu Grafiği sekmesindeki CI değerleri bir plato gösterdiğinde, plaka enfeksiyona hazırdır. RTCA yazılımının Zamanlama sekmesinde Abort Step'i tıklatın.</li>
		<li>Özel altın-mikroelektrot plakası artık sonraki adımlar için RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.</li>
	</ol></li>
</ol>3. HUVEC'lerde viral enfeksiyon
<ol><li>Virüs seyreltme<ol><li>ZIKV stok kültürü -80 °C'de tutulur. Bu çalışma için, kriyojenik şişelerde tutulan virüs stoğunu çıkarın ve 0,1 ve 1'lik çok sayıda enfeksiyon (MOI) elde etmek için ZIKV stoğunu 1,5 mL santrifüj tüplerinde serumsuz ECM ile seyreltin. NOT: ZIKV stoğu daha önce Vero hücrelerinde çoğaltma gerçekleştirilerek ve ZIKV süpernatantı34'ün hasat edilmesiyle hazırlanmıştı.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre tek tabakasının enfeksiyonu<ol><li>Her bir oyuktan şartlandırılmış ortamı (%10 FBS, %0.01 EKGS ve %0.01 P/S ile desteklenmiş ECM) çıkarın ve atın. Her birini 60 μL HBSS 2x ile iyice durulayın. HBSS'yi kuyu kenarının yardımıyla yerleştirin; Hücre tek tabakasını çekmeyin.</li>
		<li>En yüksekten en düşüğe doğru çalışarak, serumsuz ECM'de seyreltilmiş her virüs örneğinden 40 μL'yi kuyucuğa ekleyin. Her seyreltme için kuyucuğu üç katına çıkarın ve altı kuyuyu enfeksiyon olmadan koruyun (negatif kontrol ve pozitif kontrol trombin). Hücre tek tabakasını çekmeyin; Bunun yerine, seyreltilmiş virüsü kuyu kenarının yardımıyla ekleyin. Her yerleştirme için yeni bir pipet ucu kullanın. NOT: Trombin, HUVEC'lerin endotel geçirgenliğini hızla artırabildiği için pozitif kontrol olarak seçilmiştir.</li>
		<li>Virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Hücre tek tabakası boyunca virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı her 15 dakikada bir 5 kez çevirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaplama hücre kültürü ortamının eklenmesi<ol><li>1 saatlik inkübasyondan sonra, virüs süspansiyonunu en düşük konsantrasyondan en yükseğe çıkarın ve atın.</li>
		<li>Enfekte olmuş hücreleri 60 μL HBSS 2x ile yıkayın. Kuyuyu% 2 FBS ile desteklenmiş ECM ile kaplayın. Pozitif kontrol kuyucukları için, trombini %2 FBS ile takviye edilmiş ECM ile 20 U/mL'ye seyreltin ve oyukları trombin içeren ECM ortamı ile kaplayın. Hücre tek tabakasını çekmeyin; Bunun yerine, kuyu kenarının yardımıyla bindirme ortamı ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Enfekte olmuş özel altın-mikroelektrot plakasının RTCA istasyonuna geri yerleştirilmesi<ol><li>Zamanlama sekmesinde, sol üst köşedeki Adım Ekle'ye tıklayın. Step_3'e tıklayın ve Süpürmeler: 3.601 ve Aralık: 2 dk. Uygula'yı tıklayın.</li>
		<li>Görüntülenen açılır pencerede Tamam'a tıklayın. Enfekte olmuş özel altın-mikroelektrot plakasını, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin.</li>
		<li>Step_3'ye tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri analizi ve verilerin dışa aktarılması
<ol><li>Her kuyucuğun deneysel bilgilerinin eklenmesi<ol><li>Düzen sekmesinde, Hücre sekmesini tıklatın (Şekil 2A). Hedef hücre bilgilerini girmek ve her kuyu için kuyu tipini belirlemek için kuyuyu vurgulayın ve yazılımın altındaki hedef hücre adını, numarasını ve rengini yazın. Apply (Uygula) öğesine tıklayın (Şekil 2B).</li>
		<li>Hücre sekmesinde her bir kuyu için kuyu tipini seçmek ve belirlemek için, kuyu tipini vurgulayın, kuyu tipini (örnek, pozitif kontrol veya negatif kontrol) seçin ve Ayarla'yı tıklatın.</li>
		<li>Düzen sekmesinde, Tedavi sekmesine tıklayın (Şekil 2C). Tedavi bilgilerini girmek için, kuyuyu ve tedavi adını, tedavi konsantrasyonunu, üniteyi ve rengi vurgulayın. Apply (Uygula) (Uygula) düğmesini tıklatın (Şekil 2D).</li>
		<li>Tedavi sekmesinde her kuyu için kuyu tipini seçmek ve belirlemek için kuyuyu vurgulayın, kuyu tipini seçin (örnek, pozitif kontrol veya negatif kontrol) ve Ayarla'ya tıklayın. NOT: Her seçim için aynı anda birden fazla kuyu vurgulanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>CI değerinin normalleştirilmesi<ol><li>Veri analizi sekmesinin sağına sağ tıklayın ve Y Ekseni açılır kutusundan Normalleştirilmiş Hücre Dizini'ni seçin (Şekil 3A). Alttaki X Ekseni bölümünde, özel altın-mikroelektrot plakasının enfeksiyon nedeniyle çıkarıldığı son ölçülen zaman noktası olarak normalleştirilmiş zamanı seçin (Şekil 3B). NOT: Yazılım tarafından gerçekleştirilen normalleştirme işlemi, seçilen normalizasyon noktası virüs ve/veya tedavinin eklenmesinden önce olduğu sürece, kuyu tohumlama ve bağlanmadaki farklılıklardan kaynaklanan değişkenliğin çoğunu ortadan kaldırır. Bu nedenle, optimal normalizasyon zaman noktası, virüs ve/veya tedavi ilavesinden önceki son zaman noktası olmalıdır. Normalleştirilecek zaman noktası, Step_2 altındaki Zamanlama sekmesinden kontrol edilebilir. Belirtilen toplam süre, normalleştirilecek zaman noktasıdır (Şekil 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>RTCA yazılımı kullanılarak elde edilen verilerin grafiği<ol><li>Veri analizi sekmesinde, kuyucukları vurgulayarak ve Ekle'<< tıklayarak grafiğe eklenecek kuyuları seçin. Zaman grafiğine göre normalleştirilmiş hücre dizini artık kopyalanmaya ve dışa aktarılmaya hazırdır. Ortalama onay kutusunu işaretlediğinizden emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>RTCA yazılımını kullanarak verileri dışa aktarma<ol><li>RTCA yazılımının sol üst köşesinde, Plaka > Deney Bilgilerini Dışa Aktar...'a tıklayın. Dışa aktarılacak verileri seçmek için kutuyu işaretleyin. Tamam'a tıklayın. NOT: Ham veriler (ham CI değerleri), Hücre dizini > Tümü işaretlendiğinde dışa aktarılabilir.</li>
		<li>Dışa aktarma dosyasının kaydedileceği klasörü seçin. KAYDET'e tıklayın. Deneysel bilgilerin dışa aktarıldığını gösteren bir açılır pencere görünecektir. Dışa aktarma işlemi tamamlandıktan sonra, dışa aktarılan deneme bilgilerinin görüntülenmeye hazır olduğunu belirten başka bir pencere açılır.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

İzin verilen hücrelerde sitosidal viral enfeksiyon genellikle hücre morfolojisi ve biyosentezindeki önemli değişikliklerle ilişkilidir36. Hücre küçülmesi, hücre büyümesi ve/veya sinsitya oluşumu gibi virüsün neden olduğu hücresel morfolojik değişiklikler, bazı viral enfeksiyonlara özgü sitopatik etkiler (CPE'ler) olarak da bilinir37. EC'lerde CPE, hücrelerin yıkımı ve her bir EC arasındaki sıkı bağlantıların bozulması olarak tanımlandı, bu nedenle endotel bariyerinin<sup cl...

Endotel hücreleri (EC'ler) tüm kan ve lenfatik damarların iç yüzeyini kaplar. Kan veya lenf ile çevre dokulararasında yarı geçirgen bir bariyer oluşturan aderenler, sıkı boşluk bağlantıları ile bağlanırlar 1,2. Sağlam endotel hücre-hücre bağlantıları, karşılık gelen doku ve organların fizyolojik aktiviteleri için çok önemli olan makromoleküllerin, çözünen maddelerin ve sıvıların taşınmasını düzenlemek için kritik öneme sahiptir3. Endotel bariyeri dinamiktir ve spesifik uyaranlarlamodüle edilir 4. Endotel bariyeri fonksiyonunun bozulması veya kaybı, viral enfeksiyon 8,9,10,11 dahil olmak üzere birçok hastalığın5,6,7 patogenezinde akut ve kronik inflamasyonda hastalık patofizyolojisinin ayırt edici bir özelliğidir. Flavivirüsler için, yapısal olmayan protein NS1'in, örneğin katepsin L, sialidaz ve endoglikozidazheparinaz 9'un artan ekspresyonu ve aktivasyonunun bir sonucu olarak endotelyal glikokaliks benzeri tabakanın bozulması yoluyla endotel geçirgenliğini değiştirebileceği bulunmuştur. Hastalık durumunda, endotel tek tabakasının bütünlüğü etkilenir ve hücre-hücre bağlantıları bozulur, bu da endotel hasarına ve işlev bozukluğuna12 ve sonunda çoklu organ sistemlerinde yaygın patolojik belirtilereyol açabilir 13,14. EC'lerin viral enfeksiyonu, hücre sinyal yolaklarında ve hücresel gen ekspresyon profilinde sıvı bariyer fonksiyonlarını etkileyebilen, EC'lerin bozulmasına neden olabilen ve vasküler sızıntıya neden olabilen değişikliklere neden olur10,15. EC'lerin Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonunun, vasküler geçirgenlikte değişikliklere neden olan ve endotel bariyeri disfonksiyonuna yol açan ve vasküler sızıntıya neden olan eklem bütünlüğünü bozduğu bulunmuştur10,15. Çalışmalar, ZIKV'nin ciddi doğum kusurlarıyla bağlantılı olduğunu göstermiştir; Bununla birlikte, bunun gerçekleştiği kesin mekanizma hakkında pek bir şey bilinmemektedir 16,17. Bu nedenle, bir enfeksiyon sırasında endotel bariyeri değişikliklerini anlamak, hastalık mekanizmasını anlamak için kritik öneme sahiptir.
EC'ler şu anda çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler için önemli bir deneysel in vitro vasküler model sistem olarak kullanılmaktadır 18,19,20,21. İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler), vasküler endotel ve vasküler biyolojiyi in vitroolarak incelemek için birincil, ölümsüzleştirilmemiş bir hücre sistemi olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır 22,23,24,25. HUVEC'ler ilk olarak 1970'lerin başında insan göbek kordonunun göbek damarından in vitro kültür için izole edildi26. HUVEC'ler, laboratuvarda kolayca çoğalması için yapılan parke taşı benzeri bir morfolojiye sahiptir. Birleşme durumunda uzun süre tutulduktan sonra kayma gerilmesi nedeniyle hücre şeklinin uzaması gözlenir. HUVEC'ler, Weibel ve Palade cisimciklerinin (WPB), pinositik veziküllerin, çekirdeğin yakınında bulunan az miktarda fibrillerin, nadiren dallanma gösteren tübüler şekilli mitokondrilerin, ince tanecikli yoğunlaştırılmış kromatin desenine sahip bir elipsoid çekirdeğin ve her çekirdekte bulunan bir ila üç nükleolün varlığı ile karakterize edilebilir27. HUVEC'ler çok sayıda morfolojik özellik göstermesine rağmen, HUVEC'lerin tanımlanması tek başına optik muayene ile sağlanamaz. Vasküler endotelyal (VE)-kaderinin immünofloresan boyaması gibi tahliller, HUVEC'lerde vasküler bütünlüğün izlenmesi için yaygın olarak kullanılır 28,29,30,31.
Bu çalışma, HUVEC'lerin enfeksiyonunun gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) protokolünü açıklamaktadır. RTCA sistemi, hücre bağlantısı için iletken bir yüzey sağlayan mikroelektrotlar içeren özel altın kaplı plakalar kullanır. Hücreler mikroelektrot yüzeyine yapıştığında, mikroelektrotlardan elektron akışını engelleyen bir bariyer oluşur. Mikroelektrotlar tarafından üretilen empedansın ölçümü, hücre ekleri, proliferasyon ve göç dahil olmak üzere bazı hücresel süreçler hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir32. Rapor edilen test, gerçek zamanlı bir hücre analizörü ile birleştiğinde, canlı hücre proliferasyonunun, morfoloji değişikliklerinin (hücre küçülmesi gibi) ve hücre bağlanma kalitesinin noninvaziv ve etiketsiz bir şekilde sürekli ölçümünü sağlayan empedans tabanlı bir hücresel testtir. Bu çalışmada, ZIKV enfeksiyonu sırasında HUVEC'lerin endotel bütünlüğünü ve morfolojik değişikliklerini izlemek için gerçek zamanlı hücre analizörü kullanılmıştır. Kısaca cihaz, bir kültür ortamı (elektriksel olarak iletken çözelti) varlığında özel altın-mikroelektrot kaplı mikrotitre plakalarında iletilen elektron akışını ölçer. Hücre yapışması veya hücre sayısı ve morfolojisindeki değişiklikler elektron akışını bozar ve cihaz tarafından yakalanabilen empedans varyasyonlarına neden olur (Ek Şekil 1). ZIKV enfeksiyonundan önce ve sonra HUVEC büyümesi, proliferasyonu ve uyumu arasındaki fark, bir elektrik empedans sinyali ile gerçek zamanlı olarak kaydedilir ve daha sonra hücre indeksi (CI) değerine çevrilir. Enfeksiyon öncesinden alınan CI değeri, CI değeri normalleştirmesi için temel olarak kullanılır. CI değerlerindeki değişiklikler, enfeksiyon üzerine hücresel morfolojik değişiklikleri veya hücre aderans kaybını yansıtır33. Çalışma sonuçları, RTCA protokolünün, VE-kaderinin immünofloresan boyaması gibi bir son nokta testine kıyasla viral enfeksiyon sırasında geçici etkilerin veya hücre morfolojik değişikliklerinin saptanmasına izin verdiğini göstermektedir. RTCA yöntemi, diğer virüsler tarafından enfekte edildikten sonra HUVEC vasküler bütünlük değişikliklerini analiz etmek için yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Yuva</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>37 derece; % 5 CO2 içeren C inkübatörü</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 doku kültürü şişesi&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik çözeltisi penisilin-streptomisin (P / S)</td> <td>Sciencell</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik güvenlik kabini, Sınıf II</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Tip 1</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme takviyesi (EKGS)</td><td>Sciencell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Endotel hücre ortamı (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>E-plaka 96</td><td>Agilent Teknolojileri, Inc.</td><td></td><td></td>05232368001</tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Sciencell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Laboroptik LTD</td><td>Neubauer İnsan</td> Umbilikal Ven Endotel Hücrelerini (HUVEC'ler) geliştirdiSciencell <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8000</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Latitude 3520 Dizüstü Bilgisayar</td><td>Dell&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı mikropipet (10 - 100 & mikro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı mikropipet (30 - 300 & mikro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif tutucu</td><td>Tarsons</td><td>T38-524090</td><td></td></tr><tr><td>RTCA direnç plakası 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232350001</tr><tr><td>RTCA Software Pro (Sürüm 2.6.1)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>5454433001</tr><tr><td>Tek kanallı pipetler (10 - 100 & mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Tek kanallı pipetler (100 - 1000 & mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Tek kanallı pipetler (20 - 200 & mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Gerçek zamanlı hücre analizörü SP (Model: W380)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>00380601030</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232</td></tr></tbody></table>

empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizi kullanılarak viral enfeksiyon Üzerine İnsan umbilikal ven endotel hücrelerindeki değişikliklerin İzlenmesi

Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis

Endotel hücreleri, tüm kan ve lenfatik damarların iç yüzeyini kaplayarak, kan veya lenf ile çevresindeki dokular arasında sıvı ve çözünen madde değişimini düzenleyen yarı geçirgen bir bariyer oluşturur. Bir virüsün endotel bariyerini geçme yeteneği, virüsün insan vücudunda yayılmasını kolaylaştıran önemli bir mekanizmadır. Birçok virüsün endotel geçirgenliğini değiştirdiği ve/veya enfeksiyon sırasında endotel hücre bariyerinin bozulmasına neden olduğu ve bunun da vasküler sızıntıya neden olabileceği bildirilmektedir. Bu çalışma, insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonu sırasında endotel bütünlüğünü ve geçirgenlik değişikliklerini izlemek için ticari bir gerçek zamanlı hücre analizörü kullanan gerçek zamanlı bir hücre analizi (RTCA) protokolünü açıklamaktadır. ZIKV enfeksiyonu öncesi ve sonrası kaydedilen empedans sinyalleri hücre indeksi (CI) değerlerine çevrildi ve analiz edildi. RTCA protokolü, viral bir enfeksiyon sırasında hücre morfolojik değişiklikleri şeklinde geçici etkilerin saptanmasına izin verir. Bu test, diğer deney düzeneklerinde HUVEC'lerin vasküler bütünlüğündeki değişiklikleri incelemek için de yararlı olabilir.

ZIKV enfeksiyonundan önce, özel bir altın-mikroelektrot kaplı mikrotitre plakası üzerinde kültürlenen HUVEC tek tabakası için kaydedilen CI, 8'in üzerindeydi ve bu da güçlü yapışma özelliklerini düşündürüyordu. CI indeksi 8'den az olan plakalar veya oyuklar atılmalıdır. HUVEC'ler daha sonra 0.1 ve 1'lik bir MOI'de ZIKV ile enfekte edildi ve hücre empedansı 7 gün boyunca kaydedildi. ZIKV P6-740 ile enfekte olmuş HUVEC'lerin CI değeri, 0.1'lik bir MOI'de (açık mavi çizgi), negatif enfeksiyon kontrolüne (kahverengi çizgi; <...

Bu çalışma, gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) sistemi kullanarak viral enfeksiyon sırasında insan umbilikal ven endotel hücrelerindeki (HUVEC'ler) değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklamaktadır.

Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanılarak Viral Enfeksiyon Üzerine İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerindeki Değişikliklerin İzlenmesi

Endothelial cells line the inner surface of all blood and lymphatic vessels, creating a semi-permeable barrier regulating fluid and solute exchange ...

Bu protokol, viral bir enfeksiyon sırasında, yapışık hücrelerin ayrılması ve yüzmesi gibi bazı morfolojik değişiklikler şeklinde geçici etkinin sürekli olarak tespit edilmesine izin verdi. Bu protokol, hücresel morfolojik değişikliklerin sürekli izlenmesi ve son nokta tahlili ile gözden kaçırılabilecek vasküler sızıntı gibi geçici etkilerin yakalanması için invaziv olmayan ve emek yoğun olmayan bir yaklaşıma izin verdi. Bu protokol, hücreler yapışık hücreler ise, farklı deney düzeneklerinde diğer hücre hatlarının vasküler bütünlük değişikliklerini analiz etmek için kullanılabilir.HUVEC'leri hazırladıktan sonra, masaüstündeki simgeye çift tıklayarak RTCA yazılım uygulamasını başlatın. Oturum açma penceresine kullanıcı adını ve parolayı yazın. Hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna A96 kuyusu içe bakacak şekilde 1 kuyulu bir RTCA direnç plakası yerleştirin.Ardından RTCA yazılımının deney notları sekmesine gidin ve deney adını, cihaz seri numarasını ve cihaz türünü yazın. RTCA yazılımının hücre sekmesinin altındaki düzen sekmesinde, tüm kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın. Ardından, RTCA yazılımının program sekmesini açın.Step_1'ı tıklatın ve taramaları 10'a ve aralığı 30 saniyeye ayarlayın. Ardından, doğrulama çalıştırmasını başlatmak için yazılımın sol üst köşesindeki devam etmeye başla'yı tıklayın. Çalıştırdıktan sonra, verileri kontrol etmek için hücre dizini sekmesini açın.Tüm hücre dizini değerleri 0,063'ten küçük olmalıdır. Ardından, makalede açıklandığı gibi tekrarlanan değer kalıpları için hücre dizini sekmesinin alt kısmındaki ham tarama verilerini kontrol edin. Doğrulama çalıştırmasını tamamlamak için plakaya tıklayın ve plakayı serbest bırak'ı seçin.96 kuyulu RTCA direnç plakasını RTCA istasyonundan çıkarın. RTCA'da arka plan okuması elde etmek için, kollajen tipi bir kaplamalı özel altın mikroelektrot plakasını HBSS'nin oyuğu başına 60 mikrolitre ile iki kez yıkayın. Kalan HBSS'yi atın ve hücre dışı matris kuyusu başına 50 mililitre ekleyin.Ardından plakayı, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin. RTCA yazılımının exp notes sekmesinde deney adını, cihaz seri numarasını ve cihaz türünü yazın. RTCA yazılımının hücre sekmesine gidin ve düzen sekmesini seçin.Kullanılacak kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın. Şimdi RTCA yazılımının program sekmesine gidin. Step_1'ye tıklayın ve arka plan okuması elde etmek için sol üst köşedeki başlat veya devam et'e tıklayın.Plaka artık hücre tohumlama ve RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır. Daha sonra, altın mikroelektrot plakasındaki HUVEC'lerin oyuğu başına 10 ila dördüncü hücreleri, şartlandırılmış ortamın oyuğu başına 50 mikrolitre ile tohumlayın. Plakayı, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna geri yerleştirin.Ardından yazılımın program sekmesinde, sol üst köşedeki bir adım ekle'yi tıklayın. Step_2'e tıklayın. Taramaları 601 olarak, aralığı iki dakika olarak değiştirin ve uygula'yı tıklayın.Step_2'e tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki başlat veya devam et'e tıklayın. 20 saatlik inkübasyondan sonra, kuyu grafiği sekmesindeki hücre indeksi değerleri bir plato gösterdiğinde, plaka enfeksiyona hazırdır. RTCA yazılımının zamanlama sekmesinde adımı iptal et'e tıklayın.Plaka artık RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır. HUVEC'leri enfekte etmek için, eksi 80 santigrat derece dondurucudan Zika virüsü stoğunu alın. Zika virüsü stoğunu 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerinde serumsuz hücre dışı matris ile seyrelterek 0.1 ve bir enfeksiyon çokluğu elde edin.Daha sonra, şartlandırılmış ortamı her bir kuyudan atın ve kuyu tarafını kullanırken her bir kuyuyu 60 mikrolitre HBSS ile durulayın. Kuyu kenarını kullanarak en yüksekten en düşüğe doğru 40 mikrolitre seyreltilmiş virüs örneği ekleyin. Virüs emilimine izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe% 5 karbondioksit ile inkübe edin.Hücre tek tabakası boyunca virüs emilimine izin vermek için plakayı her 15 dakikada bir beş kez döndürün. Bir saatlik inkübasyondan sonra, virüs süspansiyonunu en düşük konsantrasyondan en yükseğe çıkarın ve atın. Enfekte olmuş hücreleri 60 mililitre HBSS ile iki kez yıkayın.Kuyucukları% 2 FBS ile desteklenmiş hücre dışı matris ile kaplayın. Pozitif kontrol kuyucukları için, trombini mililitrede 20 birim olarak% 2 FBS ile desteklenmiş hücre dışı matris ile seyreltin ve kuyucukların yan tarafını kullanarak hücre dışı matris ortamı içeren trombin ile kaplayın. Şimdi zamanlama sekmesine tıklayın ve sol üst köşeye bir adım ekleyin.Step_3'a gidin ve taramaları 3.601 ve aralığı iki dakika olarak değiştirin. Uygula'yı tıklayın, ardından açılan pencerede Tamam'ı tıklayın. Enfekte olmuş özel altın mikroelektrot plakasını, A1 kuyusu içe bakacak şekilde kültür inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin.Son olarak, Step_3'e tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki devam etmeye başla'ya tıklayın. Zika virüsü P6-740 ile enfekte olan HUVEC'lerin 0.1'lik bir enfeksiyon çokluğunda hücre indeksi değeri, negatif enfeksiyon kontrolüne kıyasla enfeksiyondan 15 saat sonra düşmeye başladı. Daha yüksek dozda Zika virüsü P6-740 ile enfekte olan HUVEC'ler, enfeksiyondan 11 saat sonra hücre indeksinde bir düşüş gösterdi.Enfeksiyondan 24 saat sonra, endotel hücreleri sırasıyla 0.1 ve bir enfeksiyon çokluğunda enfekte olduğunda normalleştirilmiş hücre indeksi değerinde% 5 ve% 7'lik bir düşüş oldu. Normalleştirilmiş hücre indeksi değerinde, enfeksiyondan 96 saat sonra ve enfeksiyondan 66.75 saat sonra, sırasıyla 0.1 ve bir enfeksiyon çokluğunda normalleştirilmiş hücre indeksi değerinde% 50'lik bir azalma kaydedildi. Normalleştirilmiş hücre indeksi değeri, enfeksiyondan 107 saat sonra en düşük noktasına ulaştı ve enfeksiyondan sonra sırasıyla 0.1 ve bir enfeksiyon çokluğunda %51 ve %60'lık bir azalma oldu.Normalleştirilmiş hücre indeksi değerinin, enfeksiyondan 107 saat sonra, enfeksiyondan 168 saat sonra deneyin sonuna kadar% 4 ve% 13'lük bir artışa sahip olduğu bulundu. Her RTCA deneyinden önce, her bir biyosensörün güvenilir hücre indeksi değerleri üretmek için iyi çalışmasını sağlamak için 96 kuyulu RTCA plakasını kullanan bir direnç doğrulama çalışması gereklidir.

monitoring-changes-human-umbilical-vein-endothelial-cells-upon-viral

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video protokolü insan göbek kordonu, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) izolasyonu ve kültürü göstermektedir. Bir kere bu hücreler, in vitro Hughes laboratuvar gösterdiği Optimize Fibrin Jel Boncuk Testi gibi anjiyogenez tayinlerde için kullanılabilir izole edilmiştir.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Bu videoda, bir hücresel empedans testi aracılığıyla yapışık hücrelerin çoğalması da dahil olmak üzere hücresel olayların gerçek zamanlı izleme sürecini gösteriyoruz. Burada, yapışık hücreler, elektrotlar arasındaki akım akışını kısıtlayan ve empedansı artıran yalıtkan görevi görür.

Hücresel süreçlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesi için hücresel empedans tabanlı analiz

Bu videoda, sitopatik etkilere neden olan virüslerin hayatta kalma kinetiğini incelemek için hücresel empedans tabanlı bir teknik açıklanmaktadır. Yöntem, tuzlu su ile önceden muamele edilmiş virüs ile enfekte olmuş yapışkan hücrelerin elektriksel empedansını ölçer.

Virüs Sağkalımını Değerlendirmek için Hücresel Empedans Tabanlı Sağkalım Kinetik Testi

Bu protokol Electric Cell-substrat Empedans Algılama, hücre eki, çoğalması, hareketliliği ve farmakolojik ve toksik uyaranlara hücresel yanıtların ölçümü için yapışık hücrelerin empedans spektrumu kaydetmek ve analiz etmek için bir yöntemi incelemektedir. Endotelial geçirgenliğin ve hücre-hücre ve hücre-yüzey kontaktların değerlendirilmesi tespiti vurgulanmıştır.

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) kültürü için protokoller, mikrotübül büyümesinin floresan işaretli belirteçlerinin geçici transfeksiyonu, canlı hücre görüntüleme ve interfaz mikrotübül büyüme dinamiklerinin otomatik analizi detaylandırılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Burada, enfekte hücrelerin elektriksel empedansının gerçek zamanlı izlenmesi kullanılarak enfeksiyöz viral parçacıkların ölçülmesi için bir protokol bildirilmektedir. Bu yöntemin pratik bir uygulaması, influenza A virüs çürümesinin çevresel koşulları taklit eden farklı fizikokimyasal parametreler altında ölçülmesiyle sunulmaktadır.

Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında Influenza Virüsünün Hayatta Kalmasını İzleme

Burada, insan hücrelerinde Zika virüsü enfeksiyonunu ve replikasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için çok kolay ve basit bir yöntem olarak hücre bazlı elektriksel empedansın (CEI) kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca, CEI testi antiviral bileşiklerin değerlendirilmesi için yararlıdır.

Zika Virüsü İnhibitörlerini Gerçek Zamanlı Olarak Değerlendirmek için Hücre Tabanlı Elektriksel Empedans Platformu

Burada bildirilen TCID50 testi, etiketsiz gerçek zamanlı empedans ölçümlerini ve sistemin Viroloji modülünü kullanarak virüsle tetiklenen sitopatik etkileri (CPE) gerçek zamanlı olarak objektif olarak izler. Bu sade test, yüksek verimlilikte, nicel kinetik CPE ölçümlerini desteklerken uygulamalı zamanı önemli ölçüde azaltır ve otomatik, gerçek zamanlı TCID50 hesaplamalarını mümkün kılar.

Otomatik Virüs Titri Nic Ification için Empedans kullanarak Etiketsiz Gerçek Zamanlı 50% Doku Kültürü Enfeksif Doz (TCID50) Testi

Öğrenin, empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizi ile viral enfeksiyon sırasında insan umbilikal ven endotel hücrelerindeki morfolojik değişiklikleri sürekli izleme yöntemini. Bu protokol damar bütünlüğü araştırmalarına katkı sağlar.

Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanılarak Viral Enfeksiyon Üzerine İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerindeki Değişikliklerin İzlenmesi (Video) | JoVE Journal

Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanılarak Viral Enfeksiyon Üzerine İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerindeki Değişikliklerin İzlenmesi

Daha fazla video keşfet