Name: Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Keşfedin, stomatal gelişimi düzenleyen genleri epidermal fenotip skorlaması ile nasıl tanımlayacağınızı. Arabidopsis fidelerinde toluidin mavisi O boyama kullanan bu yöntem, toksik kimyasal gerektirmeden güvenilir analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Kanada Doğal Kaynaklar ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif programı ve Concordia Üniversitesi tarafından finanse edilmiştir. K.B., Hindistan'dan Ulusal Denizaşırı Bursu tarafından desteklenmektedir.

1. Arabidopsis kotiledonlarının TBO ile boyanması
<ol><li>Tohum sterilizasyonu ve büyüme koşulları<ol><li>Bir mikrosantrifüj tüpünde genotip başına ~ 30 Arabidopsis tohumunu, 1 mL tohum sterilizasyon çözeltisi (% 33 ticari ağartıcı,% 0.1 Triton X-100) ekleyerek sterilize edin ve oda sıcaklığında (RT) 10-12 dakika boyunca hafifçe sallayın. NOT: Kimyasal olarak indüklenebilir bir gen (örneğin, Est::EPF2 7) taşıyan ~30 yabani tip Arabidopsis katılımının ~30 tohumunu ve/veya kimyasal olarak indüklenebilir bir gen (örneğin, Est::EPF27) taşıyan ~60 transgenik bitki tohumunu, kontrol olarak indükleyici olmadan (örneğin β, Şekil 1 ve Şekil 2) indükleyici olmadan (örneğin, %0,8 agar [w/v] içeren 2,16 g/L) sterilize edin (Şekil 1 ve Şekil 2).</li>
		<li>Sterilizasyon çözeltisini çıkarın, tohumları laminer bir akış başlığında 1 mL steril suyla dört kez yıkayın ve ~ 200 μL steril% 0.1 agar içinde tekrar askıya alın.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak transgenin kimyasal indüksiyonu için 1/2 MS agar plakalarına veya bir indükleyici (örneğin, 10 μM β-estradiol) içeren 1/2 MS agar plakalarına genotip başına ~ 30 tohum ekin ve mikropore bant ile kapatın. NOT: Tohumların yakın bir yere yerleştirilmemesi için plakaya eşit olarak dağıtılması gerekir, çünkü bu, fidelerin düzgün bir şekilde büyümesini önleyecektir.</li>
		<li>Çimlenmeyi senkronize etmek için plakaları 3-5 gün boyunca ışıksız 4 ° C'ye yerleştirerek tohumları tabakalaştırın.</li>
		<li>Tabakalaşmadan sonra, plakaları 10 gün boyunca 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyodu ile 120 μmol · m − 2 · s − 1 ışık altında 22 ° C'de bir büyüme odasında inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Arabidopsis kotiledonlarının örneklenmesi ve TBO boyanması<ol><li>Çimlenmeden sonraki 10 günde, değişkenliği sınırlamak için plakadaki diğer fidelerle eşit olarak büyüyen bireysel fidelerden kotiledonlardan birini dikkatlice seçin ve kesin. NOT: Kotiledonlar 10 günlük fidelerden örneklenir, çünkü epidermal fenotiplerin yorumlanmasını kolaylaştıran trikomlara ve olgunlaşmamış epidermis hücrelerine sahip değildirler.</li>
		<li>Forseps kullanarak her bir kotiledonu, 1 mL'lik bir sabitleme çözeltisi (asetik aside 9: 1 etanol) içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve numuneyi sabitleme çözeltisinde geceleyin, minimumda ve oda sıcaklığında bırakın. NOT: Numuneler daha sonra bu durumda birkaç yıla kadar saklanabilir. Şekil 2E görüntüsü, 3 yıldan fazla bir süredir sabitleme çözeltisinde saklanan bir kotiledon örneğinden alınmıştır. Kotiledonun kesildikten hemen sonra bir sabitleme çözeltisinde tutulması ve daha sonra homojen numune hazırlanması için her mikrosantrifüj tüpüne beşten fazla kotiledon yerleştirilmemesi önemlidir.</li>
		<li>Sabitleme çözeltisini çıkarın ve 1 mL% 70 etanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirdikten sonra, numuneleri içeren tüpü RT'de ~ 30 dakika bekletin.</li>
		<li>1.2.3 adımını 1 mL% 50 etanol ve ardından% 20 etanol kullanarak tekrarlayın.</li>
		<li>1 mL% 20 etanol'ü 1 mL damıtılmış su ile değiştirin ve ardından tüpü birkaç kez ters çevirdikten sonra kotiledon örneklerini içeren tüpü ~ 30 dakika bırakın. NOT: Numuneler damıtılmış suda 24 saatten fazla kalabilir, ancak kantitatif analiz için iyi kalitede görüntüler (farklı epidermal hücre tipleri için iyi boyanmış görüntüler) elde etmek için bu önerilmez.</li>
		<li>Tüm damıtılmış suyu tüpten çıkarın. Ardından, hemen ~2 dakika boyunca ~200 μL TBO boyama çözeltisi (H2O'da% 0.5 TBO, filtrelenmiş) ekleyin. NOT: İnkübasyon sırasında tüpleri hafifçe sallayarak her kotiledon numunesinin TBO çözeltisine eşit şekilde maruz kaldığından emin olun. TBO ile aşırı boyama önlemek için (boyama zamanlaması esastır ve her genotip için değişken olabilir), bir seferde numune içeren altıdan fazla tüp işlemeyin.</li>
		<li>TBO boyama çözeltisini mümkün olduğunca iyice çıkarın ve ardından 1 mL taze damıtılmış su ekleyerek numuneleri birkaç kez hemen yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme ve veri analizi<ol><li>Bir mikroskop slaytı alın ve% 15 gliserol (~ 50 μL) damla ekleyin. Kotiledonu, abaksiyel tarafı yukarı doğru ince forseps kullanarak slaytta% 15 gliserol içine yerleştirin. Ardından, oluşan hava kabarcıklarının numuneden çıkarılabilmesi için yavaşça bir kapak kayması ile örtün.</li>
		<li>Kotiledon epidermisinin abaksiyel tarafını parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüleyin (Şekil 1 ve Şekil 2) ve ardından stoma sayısını ve diğer epidermal hücre tiplerini sayarak epidermal fenotipi inceleyin.</li>
		<li>Her genotip için, Jangra ve ark.17 tarafından açıklanan aşağıdaki formülleri kullanarak epidermal fenotipi hesaplayın: Stomatal indeks (%) = (Domates sayısı/Toplam epidermal hücre sayısı) × 100 Stomatal yoğunluk (mm−2) = Domates sayısı/Alan (mm2) NOT: Her genotip için en az sekiz kotiledon (N = 8) görüntüleyin ve her genotipin epidermal fenotipini, bir indükleyici olmadan yetiştirilen kimyasal olarak indüklenebilir bir transgeni ifade eden vahşi tip bitki ve / veya transgenik bitkilerin fenotipiyle karşılaştırarak belgeleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Stoma peptitleri için biyotahliller
NOT: Biyotahliller için prosedür Şekil 3'te gösterilmiştir.
<ol><li>Tohum sterilizasyonu ve büyüme koşulları<ol><li>Yukarıdaki gibi her işlem için ~ 25 tohumu sterilize edin ve tohumların yaklaşık yarısını laminer bir akış başlığında iki 1/2 MS agar plakasının her birine ekin. NOT: Peptitlerin epidermal hücre paternleme ve farklılaşması üzerindeki biyolojik aktivitelerini kolayca tespit etmek için vahşi tip bir arka plan (örneğin, Col-0) kullanmak yerine, yüksek ve / veya düşük epidermal hücrelerle (örneğin, epf2 2) genotipi kullanın (örneğin, epf2 2).</li>
		<li>Tohumları karanlıkta 4 ° C'de 3 gün boyunca tabakalaştırın.</li>
		<li>İki plakanın her birini ~ 10 saatlik aralıklarla çıkarın ve tohumları 1 gün boyunca 120 μmol · m − 2 · s − 1 ışık altında 22 ° C'de plakalar üzerinde 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyodu ile inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptit tedavisi ve görüntüleme<ol><li>Laminer bir akış başlığında, hazırlanan iki plakanın her birinden 10-12 günlük Arabidopsis fidelerini, her bir kuyucukta 1,5 mL 1/2 MS sıvı ortam içeren 24 kuyucuklu bir plakaya dikkatlice aktarın (kuyu başına ~ 20 fide). NOT: Fideler için peptid tedavisinin zamanlaması, peptid tedavisinin fenotipik sonuçları için kritik öneme sahiptir, bu nedenle tedavi için iki farklı fide gelişim aşaması elde etmek için tohumları iki ayrı plaka üzerinde hazırlayın.</li>
		<li>1/2 MS agar plakalarında çimlenmiş ~20 günlük Arabidopsis fideleri içeren her bir kuyuğa tek başına bir tampon (50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) veya iki farklı peptit konsantrasyonu (tipik olarak, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]'da 1 μM ve 2.5 μM peptid) ekleyin. NOT: Peptit çözeltisi alikotlarını bir dondurucudan çıkarın ve tedaviden önce birkaç dakika RT'de tutun. Bir dondurucuda -80 ° C'de depolanan peptitler birkaç yıl boyunca stabildir, ancak peptid çözeltisini küçük alikotlarda depolayarak donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır.</li>
		<li>Fideleri tek başına bir tamponla veya pipet kullanarak bir peptit çözeltisiyle hafifçe karıştırdıktan sonra, plakayı mikro gözenek bandı ile kapatın. Tahlil plakasını 22 °C'de 5-7 gün boyunca uzun gün koşullarında (16 saatlik fotoperiyot, 120 μmol · m − 2 · s − 1 ışık) inkübe edin. NOT: Her bir fidenin peptit çözeltisine bile maruz kalmasına izin vermek için fidelerin birbirine çok yakın büyümesini önleyin. Havalandırmayı arttırmak için plakayı bir büyüme odasında inkübe etmeden önce plakayı 2-3 saat yavaşça döndürün.</li>
		<li>Her bir fideyi tek başına tampon veya peptit içeren kuyudan bir kapak slaytına aktarın ve fidenin kotiledonunu disseke edin. Kotiledonun abaxial tarafını forseps kullanarak yukarı yerleştirin ve küçük parçalara ayırın.</li>
		<li>Başka bir temiz mikroskop slaytı alın ve üzerine bir damla propidium iyodür çözeltisi (~ 25 μL, H 2 O'da2mg / mL) yerleştirin.</li>
		<li>Küçük kotiledon parçalarından birini forseps kullanarak bir damla propidium iyodür çözeltisine yerleştirin ve kapak kaymasını yavaşça yerleştirin. Oluşan hava kabarcıklarını gidermek için kapak kaymasının kenarına ek propidiyum iyodür çözeltisi uygulayın.</li>
		<li>Konfokal mikroskop kullanarak kotiledonun abaksiyel tarafını görüntüleyin ve görüntüleri yalnızca tampon içeren 1/2 MS ortamında yetiştirilen fidelerden elde edilen görüntülerle karşılaştırın. NOT: Şekil 4'te sunulan görüntüler, sadece tamponla muamele edilen vahşi tip Col-0 veya epf22,5 fidelerinden (Şekil 4A, B) veya iki parti EPF2 peptid çözeltisinden (Şekil 4C-F) alınmış ve 1 yıl boyunca -80 ° C'de saklanmıştır.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li>
<li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide%2C+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li>
<li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li>
<li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li>
<li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li>
<li>Nadeau, J. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stomatal+distribution+on+the+Arabidopsis+leaf+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface.</a> Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+Arabidopsis+SERK+family+receptor-like+kinases+in+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning.</a> Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).</li>
<li>Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+stomatal+initiation+is+controlled+by+MAPK-mediated+regulation+of+the+bHLH+SPEECHLESS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS.</a> Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).</li>
<li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li>
<li>Theunissen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+studying+grass+leaf+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An improved method for studying grass leaf epidermis.</a> Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).</li>
<li>Venkata, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crw1--A+novel+maize+mutant+highly+susceptible+to+foliar+damage+by+the+western+corn+rootworm+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle.</a> PLoS One. 8 (8), 71296(2013).</li>
<li>Tucker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+small+RNA+pathways+promote+the+mitotic+events+of+megagametogenesis+during+female+reproductive+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis.</a> Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).</li>
<li>Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NMR+structure+of+stomagen+reveals+the+basis+of+stomatal+density+regulation+by+plant+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones.</a> Nature Communications. 2, 512(2011).</li>
<li>Jangra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplicated+antagonistic+EPF+peptides+optimize+grass+stomatal+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation.</a> Development. 148 (16), (2021).</li>
<li>Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xylem+and+phloem+transcriptomes+from+secondary+tissues+of+the+Arabidopsis+root-hypocotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl.</a> Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+inflorescence+architecture+by+intertissue+layer+ligand-receptor+communication+between+endodermis+and+phloem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).</li>
<li>Tameshige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+peptide+and+its+receptors+shape+the+auxin+response+pattern+and+leaf+margin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis.</a> Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).</li>
<li>Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+signaling+specificity+in+Arabidopsis+by+spatially+restricted+buffering+of+ligand-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions.</a> The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).</li>
<li>Uchida, N., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plant+vascular+stem+cells+by+endodermis-derived+EPFL-family+peptide+hormones+and+phloem-expressed+ERECTA-family+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).</li>
<li>Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPFL+Signals+in+the+boundary+region+of+the+SAM+restrict+its+size+and+promote+leaf+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation.</a> Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.

Burada sunulan stoma paternleme ve farklılaşmayı kontrol eden genleri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılan iki fenotipik analiz yöntemi, protokoller epidermal peelinglerin ve özel ekipmanların (zaman alıcı olan ve numune hazırlama için özel eğitim gerektiren) kullanılmasını gerektirmediğinden, ancak epidermal fenotiplerin kantitatif analizi için yüksek kaliteli görüntüler ürettiğinden, uygun ve güvenilir analizlerdir.
TBO boyalı Arabidopsis kotiledonları kullanılarak yapıla...

Bitki stomalarının uygun şekilde modellenmesi ve farklılaşması, fotosentez ve terleme olmak üzere iki temel biyolojik süreçteki işlevleri için kritik öneme sahiptir ve EPF peptid sinyal yolları tarafından uygulanır. Arabidopsis'te, salgılanan üç sistein bakımından zengin peptit, EPF1, EPF2 ve STOMAGEN / EPFL9, stoma gelişiminin farklı yönlerini kontrol eder ve ERECTA-ailesi reseptör kinazları (ER, ERL1 ve ERL2), SERK'ler ve TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 dahil olmak üzere hücre yüzeyi reseptör bileşenleri tarafından algılanır. . Bu tanıma daha sonra MAPK'ya bağımlı bir süreç11 ile stoma farklılaşmasını teşvik eden transkripsiyon faktörlerinin aşağı regülasyonuna yol açar. Bu çekirdek stoma genlerinin keşfi öncelikle epidermal defekt sergileyen mutantların fenotipik taraması ile sağlanır. Bu yazıda, stoma paternini ve farklılaşmasını kontrol eden potansiyel genleri tanımlamak ve karakterize etmek için gerekli olan stomaların ve diğer epidermal hücrelerin görselleştirilmesi için nispeten basit ve etkili fenotipleme yöntemleri sunulmaktadır.
Bitki epidermisinin detaylarının gözlemlenmesi tipik olarak, toluidin mavisi O (TBO) veya safranin12,13,14 gibi bir boya ile lekelenmiş veya lekelenmemiş epidermal kabuklar kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin temel zorluğu, yaprakları yırtmadan yaprak epidermisini soymak ve yaprağın farklı bölgelerinden alınan görüntülerden kaçınırken desen verilerini dikkatlice gözlemlemek ve analiz etmek için özel eğitim gerektirmesidir. Doku örneklerini kloral hidrat bazlı temizleme çözeltileri gibi reaktiflerle temizlemeye yönelik kimyasal işlemler, çeşitli biyolojik materyaller için de yaygın olarak kullanılmaktadır 8,15; Bu tedaviler, yüksek kaliteli görüntüler sağlayarak çok sayıda fenotipik bilgi üretir, ancak aynı zamanda tehlikeli kimyasalların (örneğin, formaldehit, kloral hidrat) kullanılmasını gerektirir. Bu yazıda ilk olarak, kantitatif analiz için yeterli görüntü üreten, ancak numune hazırlama için tehlikeli kimyasalların ve epidermal yaprak kabuklarının kullanılmasını gerektirmeyen nispeten kolay ve kullanışlı bir fenotipleme yöntemi sunulmaktadır. TBO boyalı kotiledon epidermisi stoma gelişiminin incelenmesi için de idealdir, çünkü trikomların eksikliği ve kotiledonlardaki daha küçük gelişimsel gradyan, epidermal fenotiplerin basit ve izlenebilir bir şekilde yorumlanmasına izin verir.
Stomatal EPF peptitleri, nispeten büyük olgun boyutlara ve korunmuş sistein kalıntıları arasındaki intramoleküler disülfit bağlarına sahip bitkiye özgü, sistein bakımından zengin peptitler grubuna aittir. Doğru konformasyonel katlama, biyolojik işlevleri için kritik öneme sahiptir, ancak kimyasal sentez veya heterolog bir rekombinasyon sistemi tarafından üretilen sistein bakımından zengin peptitler inaktif olabilir ve hem uygun şekilde katlanmış hem de katlanmamış peptitlerin bir karışımıdır 3,7,16. Bu nedenle, stoma gelişiminin kontrolünde rol oynayan biyoaktif peptitlerin taranması çok zorlu bir görev olmuştur. Bu makale ayrıca biyoaktif stoma peptitlerinin daha iyi tanımlanması ve karakterizasyonu için bir biyotahlil açıklamaktadır. Bu yöntemde, Arabidopsis fideleri 6-7 gün boyunca potansiyel peptitleri olan ve olmayan ortamlar içeren çok kuyucuklu bir plakada yetiştirilir. Daha sonra, kotiledon epidermisi konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilir. Genel olarak, stoma gelişiminde potansiyel peptitlerin biyolojik aktivitesini açıkça görselleştirmek için, daha fazla epidermal hücre üreten epf2 mutantı ve azalmış epidermalhücre yoğunluğu 2,4,5 veren STOMAGEN-ami hattı gibi az ya da çok stoma soy hücreleri üreten genotipler, biyotahliller için vahşi tip Arabidopsis kontrolüne (Col-0) ek olarak kullanılır.
Genel olarak, burada sunulan iki protokol, çeşitli epidermal fenotiplerin hızlı ve verimli bir şekilde değerlendirilmesi ve stoma paterninin ve gelişiminin kontrolünde rol oynayan küçük peptitlerin ve hormonların taranması için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>18 mm x 18 mm kapak kayması</td>, <td>VWR</td><td>16004-326</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı 24 kuyulu steril plakalar</td><td>VWR</td><td>CA62406-183</td><td></td></tr><tr><td>3M Mikro gözenekli cerrahi bant</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td>MS plakalarını kapatmak için kullanılan mikro gözenekli cerrahi kağıt bant</td></tr><tr><td>76 x 26 mm Mikroskop lamı</td><td>TLG</td><td>GEW90-2575-03</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit, &ge; %99.8&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td></td></tr><tr><td>Bleech</td><td>Ev tipi çamaşır suyu (örneğin, Clorox)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td>Nikon C2 NIS-Elements tarafından işletilmektedir&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Greenfield</td><td>P210EAAN</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open-srouce</td><td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>Foreps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg'un vitamin karışımı</td><td>Cassson Labs</td><td>GBL01-100ML</td><td>4 & derece; C</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme odaları</td><td>Conviron,&nbsp; model E15</td><td></td><td>16h ışık döngüsü, 21 ° C'ye ayarlanmış; 120 & mikro ışık yoğunluğuna sahip C; Mol ve Orta Nokta; m-2 ve orta nokta; s-1.</td></tr><tr><td>Işıklar</td><td>HD Besleme</td><td>25272</td><td>Floresan ve nbsp; büyüme odalarındaki ışıklar, Sylvania F72T12 / CW / VHO 72 "T12 VHO 4200K ve nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td>Arabidopsis thaliana tohumlarının sterilizasyon yapmak için yerleştirildiği tüpler</td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE, DsRi2 dijital kamera</td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog bazal tuzları</td> ile donatılmıştır;<td>Cassson Labs</td><td>MSP01-1LT</td><td>Mağaza 4 > C</td></tr><tr><td>Petri Kabı 100 mm x 20 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11Z</td><td>Arabidopsis thaliana</td></tr><tr><td>Propidium Iodide&nbsp;</td><td>VWR</td><td>39139-064</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>BioShop</td><td>SUC700.5</td><td></td></tr><tr><td>Toluidin mavisi O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

stomatal gelişimde rol oynayan genlerin epidermal fenotip skorlaması ile tanımlanması

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomalar, gaz değişimi ve su buharı salınımında rol oynayan kara bitkilerinin yüzeyindeki küçük gözeneklerdir ve işlevleri bitki verimliliği ve hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, stomaların geliştiği mekanizmaları ve desenini anlamak muazzam bir agronomik değere sahiptir. Bu yazıda Arabidopsis kotiledonlarının kullanıldığı ve stoma gelişimini ve paternlemesini kontrol eden genleri karakterize etmek için kullanılabilecek iki fenotipik yöntem anlatılmaktadır. İlk olarak toluidin mavisi O-boyalı kotiledonlar kullanılarak stoma fenotiplerini analiz etmek için prosedürler sunulmuştur. Bu yöntem hızlı ve güvenilirdir ve fenotipik analizler için yaygın olarak kullanılan ancak özel eğitim gerektiren epidermal peelinglerin kullanılmasını gerektirmez. Multipl sistein kalıntılarının varlığı nedeniyle, stoma gelişiminde rol oynayan biyoaktif EPF peptitlerinin tanımlanması ve üretilmesi zor olmuştur. Bu nedenle, ikinci sunulan stoma ligandlarını tanımlamak ve biyolojik aktivitelerini biyotahlillerle izlemek için kullanılan bir prosedürdür. Bu yöntemin temel avantajı, peptid çözeltisinin miktarını ve peptidlerin stoma desenini ve gelişimini kontrol etmedeki rolünü karakterize etmek için gereken süreyi azaltırken, nispeten kolay bir şekilde tekrarlanabilir veriler üretmesidir. Genel olarak, bu iyi tasarlanmış protokoller, aktiviteleri için oldukça karmaşık yapılar gerektiren sistein bakımından zengin salgı peptitleri de dahil olmak üzere potansiyel stoma düzenleyicilerini incelemenin verimliliğini arttırır.

Daha az veya daha fazla stoma yoğunluğuna ve kümelenmesine sahip olduğu bilinen çeşitli stoma transgenik bitkileri ve mutantları (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, STOMAGEN-susturulmuş bir hat4 ve estradiol ile indüklenebilir Est::EPF1 veya Est::EPF2 aşırı ekspresyon yapısını taşıyan transgeni...

Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

Burada sunulan iki fenotipik analiz yöntemi, kantitatif fenotipik analiz yapmak ve epidermal detaylarla peptid tedavisinin fenotipik yanıtlarını göstermek için yeterli olan yüksek kaliteli görüntüler sunmaktadır. Sonuç olarak, bu iki yöntem epidermal hücre paternini ve gelişimini anlamak için kullanılabilir. Bu iki yöntem, epidermal fenotipik analiz için yaygın olarak kullanılan herhangi bir toksik kimyasal veya epidermal parça gerektirmediğinden nispeten kolay ve güvenilir tekniklerdir.Bununla birlikte, teknikler karmaşıktır ve özel eğitim gerektirir. Başlamak için, değişkenliği sınırlamak için plakadaki diğer fidelerle eşit olarak büyüyen bireysel fidelerden kotiledonlardan birini dikkatlice seçin ve kesin. Her kotiledonu, forseps kullanarak bir mililitre sabitleme çözeltisi içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve numuneyi oda sıcaklığında gece boyunca sabitleme çözeltisinde bırakın.Sabitleme çözeltisini çıkarın ve bir mililitre% 70 etanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirin ve numuneleri içeren tüpü oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika bekletin. Bir mililitre% 50 etanol ve% 20 etanol kullanarak bu adımı tekrarlayın.Bir mililitre% 20 etanol'ü bir mililitre damıtılmış su ile değiştirin, kotiledon örneklerini içeren tüpü birkaç kez ters çevirin ve yaklaşık 30 dakika bekletin. Tüm damıtılmış suyu tüpten çıkarın ve hemen yaklaşık iki dakika boyunca yaklaşık 200 mikrolitre Toluidin Blue O veya TBO boyama çözeltisi ekleyin. TBO boyama çözeltisini mümkün olduğunca iyice çıkarın ve ardından bir mililitre taze damıtılmış su ekleyerek numuneleri birkaç kez hemen yıkayın.Laminer bir akış başlığında, hazırlanan iki plakanın her birinden 10 ila 12 adet bir günlük Arabidopsis fidanını, her bir kuyucukta 1,5 mililitre yarım MS sıvı ortamı içeren 24 kuyucuklu bir plakaya dikkatlice aktarın. Tek başına 50 milimolar tris HCL tamponu veya yarım MS agar plakaları üzerinde çimlenmiş fideleri içeren her bir kuyucuğa iki farklı peptit konsantrasyonu ekleyin. Fideleri tek başına tamponla veya bir pipet kullanarak bir peptit çözeltisiyle yavaşça karıştırın ve plakayı mikro gözenek bandı ile kapatın.Tahlil plakasını uzun gün koşullarında beş ila yedi gün boyunca 22 santigrat derecede inkübe edin. Fideyi kuyudan bir kapak kaydırağına aktarın ve fidenin kotiledonunu disseke edin. Kotiledonun abaxial tarafını forseps kullanarak yukarı yerleştirin ve küçük parçalara ayırın.Başka bir temiz mikroskop slaytı alın ve üzerine bir damla propidium iyodür çözeltisi yerleştirin. Forseps kullanarak küçük kotiledon parçalarından birini damlaya yerleştirin ve kapak kaymasını yavaşça yerleştirin. Oluşan hava kabarcıklarını gidermek için kapak kaymasının kenarına ek propidiyum iyodür çözeltisi uygulayın.Konfokal mikroskop kullanarak kotiledonun abaksiyel tarafını görüntüleyin ve görüntüleri yalnızca tampon içeren yarım MS ortamında yetiştirilen fidelerden elde edilen görüntülerle karşılaştırın. Üç Arabidopsis genotipi, vahşi tip, bir STOMAGEN susturulmuş çizgi ve epf1 epf2 mutantlarının 10 günlük fidelerinden abaxial kotiledon görüntüleri burada gösterilmektedir. Burada, STOMAGEN susturulmuş çizgisi düşük stoma sayısına sahip genotipleri temsil eder ve epf1 epf2 mutantları yüksek sayıda stomaya sahip genotipleri temsil eder.Epidermal fenotipin kantitatif analizi için 10 günlük yabani tip, tmm ve östradiol ile indüklenebilir epf2 veya epf1 aşırı ekspresyon yapısı taşıyan transgenik çizgilerden elde edilen kotiledonların temsili epidermis görüntüleri kullanılmıştır. Bir tampon çözeltisinde altı ila yedi gün boyunca yetiştirilen vahşi tip ve epf2 kotiledon epidermisinin temsili konfokal görüntüleri ve iki farklı epf2 peptid partisi ile yetiştirilen bir epf2 kotiledon epidermisi bu şekilde gösterilmiştir. Bu prosedürü uygulayarak, kotiledonlardan birini, diğer fidelerle eşit olarak büyüyen bireysel bir fideden kestiğinizden emin olun.Ayrıca değişkenliği sınırlamak için MS ortamına dokunmayan bir fide seçin. Hatırlanması gereken bir diğer nokta, tek bir mikrosantrifüj tüpüne beşten fazla kotiledon yerleştirmemektir. Ayrıca, TBO lekelerinin kotiledonların etrafına eşit dağılımını sağlamak için tüpü hafifçe hafifçe hareket ettirin ve onları iyi bir şekilde lekeleyin.Bir peptit çözeltisinde çoklu yapısal peptitlerin bulunduğu göz önüne alındığında, bu biyotahlil yöntemi, peptidin uygun şekilde katlanmış ve biyoaktif formlarının ve biyolojik işlevlerinin tanımlanması için çok yararlı olacaktır.

identification-genes-involved-stomatal-development-via-epidermal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz canlı bakteri stoma yanıt erişmek için basit ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntem daha önce bildirdiği epidermal peeling kullanımı ile karşılaştırıldığında yaprak yaralama ve manipülasyona en aza indirir.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Fizyolojisi ve morfolojisi bağlantılı nasıl çözülüyor bitkinin mekanik işleyişinin daha derin bir anlayış bırakır verir. Biz geleneksel fonksiyonel yaprak özellikleri ile stomatal iletkenlik ölçümleri ve korelasyon gelen stoma yönetmelik parametreleri türetmek için bir prosedür hem sunuyoruz.

Yaprak Fonksiyonel Özellikleri için ağıza ait iletkenlik İlişkin

Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Bu iletişim kuralı fizyolojik ve diğer biyolojik araştırmaları için yararlıdır zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama yöntemi açıklanır.

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

Bir bileşik kitaplığın büyük ölçekli taraması ile foliar transpirasyon modülatörlerini tanımlamak için bir yöntem salıyoruz.

Helianthus Annuus'ta Büyük Ölçekli Termal Görüntüleme Taraması ile Bitki Transpirasyonunun Yeni Regülatörlerinin Belirlenmesi

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Burada, Arabidopsis thaliana'da bakteri istilasına karşı stoma yanıtlarının doğrudan gözlemlenmesi ve otomatik ölçümü için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntüleri için tasarlanmış bir görüntü analizi boru hattı ile birlikte taşınabilir bir stoma görüntüleme cihazından yararlanır.

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Bu protokol, epidermal peeling, temizleme teknikleri ve yapay zeka destekli görüntü analizi kullanarak iki farklı türde stoma ve epidermal özellikleri değerlendirmek için karşılaştırmalı bir yöntem sunmaktadır. Amaç, tarımsal uygulamalar ve geniş bitki araştırmaları için stoma fonksiyonunun altında yatan hücresel yapıların yüksek verimlilik, tekrarlanabilir niceliklendirilmesini sağlamaktır.

Stomatal ve Epidermal Özelliklerin Peeling, Clearing ve AI Tabanlı Görüntü Analizi Kullanılarak Karakterize Edilmesi

Keşfedin, stomatal gelişimi düzenleyen genleri epidermal fenotip skorlaması ile nasıl tanımlayacağınızı. Arabidopsis fidelerinde toluidin mavisi O boyama kullanan bu yöntem, toksik kimyasal gerektirmeden güvenilir analiz sağlar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Daha fazla video keşfet