Name: Özofagus Fibroblastlarının Organoid Ko-Kültürler Kullanılarak Fonksiyonel Karakterizasyonu ve Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Öğrenin özofagus organoid-fibroblast ko-kültür protokolünü, kök hücre nişi dinamiklerini ve kanser ilişkili fibroblast fonksiyonlarını incelemek için. Bu yöntem doku homeostazı ve onkoloji araştırmalarında değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma ERC StG TroyCAN (851241) tarafından desteklenmiştir. E.E. bir Cancerfonden Doktora Sonrası Yardımcısıdır. M.G. bir Ragnar Söderberg Üyesi ve Cancerfonden Junior Araştırmacısıdır. Biyomedikal Akış Sitometri Çekirdek Tesisi, Biyomedikal Görüntüleme Çekirdeği (BIC) ve Karşılaştırmalı Tıp Biyomedikal (KMB) hayvan tesisi de dahil olmak üzere Karolinska Enstitüsü çekirdek tesislerinden gelen teknik yardım için minnettarız. Genander laboratuvarı üyelerine protokolü dikkatlice okudukları ve yorumladıkları için teşekkür ederiz.

<ol><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kasagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esophageal+organoid+system+reveals+functional+interplay+between+notch+and+cytokines+in+reactive+epithelial+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%3A+Origins%2C+definitions%2C+and+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease.</a> Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesenchymal+cell+populations+generate+the+essential+intestinal+BMP+signaling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient.</a> Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).</li>
<li>Cordero-Espinoza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+contacts+between+periportal+mesenchyme+and+ductal+epithelium+act+as+a+rheostat+for+liver+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).</li>
<li>Pastula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+gastrointestinal+organoid+culture+in+combination+with+nerves+or+fibroblasts%3A+a+method+to+characterize+the+gastrointestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche.</a> Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>McGinn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomechanical+switch+regulates+the+transition+towards+homeostasis+in+oesophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium.</a> Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+stem+cells+of+the+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development and stem cells of the esophagus.</a> Development. 148 (6), (2021).</li>
<li>Ohlund, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+inflammatory+fibroblasts+and+myofibroblasts+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).</li>
<li>Pentinmikko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notum+produced+by+Paneth+cells+attenuates+regeneration+of+aged+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium.</a> Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).</li>
<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Burada sunulan protokol, fonksiyonel özofagus epitel-fibroblast etkileşimlerini araştırmak için in vitro bir model oluşturmaktadır.
Epitel tabakası stromadan ayrılır ve hem epitel hem de stromal bölme için optimize edilmiş bir ayrışma protokolüne izin verir. Epitelyal dissosiyasyon protokolünün optimizasyonuna rağmen, doku kümeleri belirgin kalmaktadır. Her 15 dakikada bir kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleme, kümelerin sayısını ve boyutunu önemli ölçüde azaltır. Diğer protokoller, epitel tabakası 5,6'yı daha da ayrıştırmak için tripsin kullanır. Burada, tripsin kullanımı veya ayrışma süresinin daha da arttırılması, epitel hücre canlılığının azalmasına ve organoid oluşturma verimliliğine neden olma eğiliminde olduğu için önerilmez. Epitelin aksine, stroma kolayca ayrışır ve ayrışma çözeltisinde 30 dakika, ~% 90 fibroblast canlılığına sahip tek hücreli bir süspansiyonla sonuçlanır (Şekil 1E). Protokolde epitelyal-stomal ayırma basamağının hariç tutulması, ayrışma süresini önemli ölçüde artırarak fibroblast canlılığının azalmasına ve epitel hücrelerinin veriminin düşmesine neden olur. Ek olarak, epiteli stromadan ayırmak, her popülasyonun hücre sayılarını belirlemek ve ortak kültürleri kurarken epitel hücrelerini ve fibroblastları farklı fare çizgilerinden karıştırmak için bir fırsat sağlar.
Organoid büyüme üzerine fibroblast fonksiyonunun incelenmesi, kök hücre biyolojisinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir 9,10,11,15,16. Yerleşik ko-kültür ortamları ya %10 fetal buzağı serumu (FCS)9,15 ile desteklenen DMEM ya da büyüme faktörü azaltılmış orta10,16'dır. Bu protokolde, büyüme faktörü azaltılmış ortam, fibroblastların büyük ölçüde sessiz olduğu in vivo kök hücre nişindeki koşulları taklit etmek için kullanılır. FCS, ko-kültürlerde fibroblastların aktivasyonu ve proliferasyonu ile sonuçlanan, muhtemelen in vivo durumdan farklı bir fibroblast hücre durumuna karşılık gelen büyüme faktörü bakımından zengin bir serumdur. FCS'yi dışlayarak ve büyüme faktörlerini azaltarak, böylece tek başına ortam (ERdüşük) organoid büyümeyi desteklemez ve fibroblast proliferasyonunu uyarmaz, fibroblastların organoid büyüme üzerindeki etkisini izole etmek mümkündür. Bu ortamda, NOGGIN kaldırılır ve RSPO minimuma indirilir (% 10 RPSO). Hem NOGGIN hem de RSPO'nun özofagus organoid büyümesi için gerekli olduğu gösterilmiştir6. EGF, organoid büyümeyi kendi başına desteklemediği için ko-kültür ortamında tutuldu. Bununla birlikte, fibroblastlar ayrıca EGF ile indirgenmiş bir ortamda organoid büyümesini destekleyebilir (E düşük, R,düşük; Şekil 2B,D).
Organoid ko-kültürler, tripsinizasyon sırasında fibroblastlar kaybolduğu için geçiş yoluyla sürdürülemez. Bununla birlikte, özofagus organoidleri korunabildiğinden, genişletilebildiğinden ve mono-kültürler olarak daha fazla deney için kullanılabildiğinden, organoid pasajlama protokole dahil edilmiştir. Mono-kültürlerden pasajlı organoidler, yeni izole edilmiş fibroblastlarla ortak kültürler oluşturmak için kullanılabilir. Birincil hücrelerin kullanılmasının bir dezavantajı, çoklu organoid ko-kültürleri kurmak için gereken fare sayısıdır. Fibroblastların küçük alt popülasyonlarına odaklanıldığında, elde edilen ko-kültürlerin sayısı sınırlıdır. Diğer protokollerde, fibroblastlar organoid ko-kültürleri kurmak için kullanılmadan önce kültürde ilk önce genişletilir10. Bununla birlikte, fibroblastlar geçiş sırasında morfolojiyi ve kimliği değiştirir, primer deri ve kardiyak fibroblastlar kullanılarak gösterilmiştir17,18. Özofagus fibroblastlarının konvansiyonel 2D geçişi hem morfoloji hem de fenotip değişikliklerine neden olur ve fibroblastların in vitro zenginleştirilmesinin endojen kök hücre nişini fenoskopi yapmayı amaçlayan ko-kültürler için uygun olmadığını gösterir.
Tüm montaj boyama, fibroblast-organoid etkileşimini korumak ve görselleştirmek için bir araç sağlar. Tüm organoidlerin doğrudan kendilerine bağlı fibroblastları olmasa da, çoğu organoidin fibroblastlarla temas halinde olduğu belirtilmelidir (bkz. Şekil 2C). Epitelyal-fibroblast etkileşimlerini sürdürmek için, organoidleri dikkatli bir şekilde ele almak ve kuvvetli pipetleme, vorteks ve yüksek hızlı eğirmeden kaçınmak önemlidir. Optimal fiksasyon, 3D doku mimarisini korumak ve endojen floresanı korumak için önemlidir. 30 dakikalık bir fiksasyon, H2BeGFP sinyalini korumak için yeterlidir ve bu protokolde kullanılan antikorlar için en uygunudur, ancak bu, kullanılan floroforlar ve antikorlar arasında değişebilir. Organoidlerin temizlenmesi ışık saçılımını azaltır ve tüm 3D yapının görselleştirilmesini önemli ölçüde geliştirir. Organoidler küçük olduğundan, temizleme kolay ve hızlıdır; Bununla birlikte, lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanarak tüm organoidlerin görüntülenmesi zaman alıcı olabilir, çünkü birden fazla Z-yığınının yapılması gerekir. Dönen disk gibi konfokal mikroskoplar, görüntüleme süresini azaltmak için kullanılabilir.
Genel olarak, fibroblastların varlığında yetiştirilen özofagus organoidleri, özofagus kök hücre nişinin yönlerini anlamak için değerli bir araç sağlar. Ek olarak, tüm montaj temizleme, fibroblastlar ve organoidler arasındaki etkileşimi görselleştirmek için erişilebilir bir yöntem sağlar.

Organoidler, kök ve progenitör hücreleri karakterize etmek ve kök hücre nişinin hücresel bileşenlerinden türetilen sinyal ipuçlarını anlamak için 3D in vitro tahliller olarak kullanılır 1,2,3,4. Fare özofagus organoidleri ilk olarak 2014 yılında tanımlanmıştır ve birkaç makale, özofagus organoidlerini korumak ve geçmek için gerekli olan R-Spondin (RSPO), NOGGIN ve epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörlerini tanımlamıştır 5,6,7, in vivo için benzer sinyal ipuçlarının gerekli olduğunu savunmuştur progenitör hücre yenilenmesi. Bununla birlikte, büyüme faktörleri genellikle fizyolojik olmayan konsantrasyonlarda eklenir ve bu da in vivo sinyal ortamını mutlaka yansıtmayan organoid büyüme koşullarına neden olur.
Fibroblastlar, birçok kök hücre nişinde progenitör hücre özelliklerini destekleyen heterojen stromal hücre popülasyonlarıdır8. Epitelyal progenitör hücrelerin ve fibroblastların aynı organoid kültürde birleştirilmesi, ekzojen olarak takviye edilmiş büyüme faktörlerinin azaltılmış konsantrasyonlarında organoid oluşumunu sağlar. İntestinal ve hepatik epitelden organoid ko-kültür sistemleri tanımlanmıştır, ancak özofagus organoid-fibroblast ko-kültürlerini oluşturmak için bir protokol hala göze çarpmaktadır 9,10,11.
Bu protokolde, transgenik PdgfrαH2BeGFP fare12 veya klasik antikor boyaması olan vahşi tip fareler kullanılarak yemek borusundan fibroblastlar için iki floresan aktive hücre sıralama (FACS) stratejisi özetlenmiştir. Fibroblastların farklı alt popülasyonları, tercih edilen hücre yüzey belirteçleri kullanılarak izole edilebilir, böylece protokole esneklik sağlanır. Ek olarak, fibroblast-organoid etkileşimlerini karakterize etmek için organoid morfolojiyi koruyan bir 3D floresan görüntüleme tekniği kullanılır. Organoid temizleme, organoidlerdeki ışık penetrasyon derinliğini arttırmak, organoid-fibroblast bağlantılarının görselleştirilmesini iyileştirmek ve organoid yapının bütünüyle özetlenmesini sağlamak için hızlı bir yöntem sağlar. Bu protokol, özofagus organoid ko-kültürünü bütün bir montaj görüntüleme stratejisi ile birleştirerek fibroblast-organoid etkileşiminin fonksiyonel karakterizasyonunu sağlar.

<table><tbody><tr><td>B-27 Takviyesi (50X), serum içermeyen</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Matrigel&nbsp; Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran</td><td>Matrisi fisher scientific</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviye</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı</td><td>yok Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 çözeltisi</td><td>Merck</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td> <td>25200-056</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Kimyasallar, Peptitler ve rekombinant proteinler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI Çözeltisi</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Ayrışma çözeltisi: 0.25 mg / ml Liberaz TM, HBSS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td> içinde 0.25 mg / ml Dnaze<td></td><td></td>11284932001</tr><tr><td>Formaldehit, %37, %10-15 metanol ile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Liberaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N-Asetil-sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin murin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td><td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare EGF Proteini, CF</td><td>R& D sistemleri</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin-1 murin</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Mavi Ölü Hücre Lekesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Termolizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Plastik ve Züccaciye< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Corning Steril Hücre Süzgeçleri 40um</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Corning Steril Hücre Süzgeçleri 70um</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Deckgl & auml; ser/ kapak fişleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal reaksiyon tüpü, 1,5 mL, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Çıtçıtlı Kapaklı Düşük Tutmalı Mikrosantrifüj Tüpleri 0,6 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Slaytları</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05 mm 4 dairesel kuyu iSpacer</td><td>SunJin Lab</td><td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps, biyoloji ucu</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>VectorLaboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Yaylı Makas Yan Top Ucuna Açılı 8mm Kesme</td><td>Kenarı FST</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop Stellaris 5&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu ZEISS Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td><FACS için güçlü>Konjuge Antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-fare CD104 Antikor Klon: 346-11A</td><td>123608</td><td>123608</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-fare CD26 (DPP-4) Antikoru</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cy7 anti-fare / insan CD324 (E-Cadherin) Antikoru</td><td>147310</td><td>147310 147310</td><td></td></tr><tr><td><İmmünofloresan için güçlü > antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CD104 (&szlig; -integrin 4) Klon: 346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>Sitokeratin 14</td><td>Acris Antikorları (AbD Serotec)</td> <td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>Sitokeratin13 Klon: EPR3671</td><td>abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-kaderin (CD324) Klon: 2.40E+11</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 5 Poliklonal Tavuk Antikoru, Saflaştırılmış Klon: Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63 Klon: 4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Anti-KLF4 antibod Klon: EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İkincil antikorlar</güçlü>/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eşek anti-türleri* tercih edilen florofor ile antikorlar</td><td>Jackson İmmüno</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Özofagus fibroblastlarının organoid ko-kültürler kullanılarak fonksiyonel karakterizasyonu ve görüntülenmesi

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

Epitel kök ve progenitör hücreleri, yaşam boyunca epitel bariyerinin oluşumuna ve korunmasına katkıda bulunur. Çoğu kök ve progenitör hücre popülasyonu, anatomik olarak farklı yerlerde sıkışıp kalır ve bu da köklülüğü koruyan niş sinyallerle özel etkileşimler sağlar. Epitelyal organoid kültürlerin gelişimi, kök ve progenitör hücrelerin homeostaz ve hastalıktaki rolünü anlamak için güçlü bir araç sağlarken, niş ortam içindeki etkileşim büyük ölçüde yoktur, böylece kök hücre davranışını etkileyen faktörlerin tanımlanmasını engeller. Fibroblastlar epitel sapı ve progenitör kaderini yönlendirmede anahtar rol oynamaktadır. Burada, özofagus progenitör hücre yenilenmesi ve farklılaşmasında fibroblast alt popülasyonlarının tanımlanmasını sağlayan kapsamlı bir organoid-fibroblast ko-kültür protokolü sunulmuştur. Bu protokolde, hem epitel hücrelerini hem de fibroblastları yemek borusundan paralel olarak izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır. Hem özofagus progenitör hücrelerini hem de fibroblast alt popülasyonlarını transgenik muhabir veya vahşi tip farelerden izole etmek için farklı floresan aktive hücre sıralama stratejileri özetlenmiştir. Bu protokol, spesifik fibroblast alt popülasyonlarının izolasyonuna uyum sağlamak için uyarlanabilecek çok yönlü bir yaklaşım sağlar. Özofagus epitelyal organoid mono-kültürlerinin kurulması ve geçiştirilmesi bu protokole dahil edilmiştir ve ko-kültür sistemi ile doğrudan karşılaştırma yapılmasına olanak sağlanmaktadır. Ek olarak, epitelyal-fibroblast etkileşimlerinin ayrıntılı görüntü analizine izin veren bir 3D temizleme yaklaşımı açıklanmaktadır. Toplu olarak, bu protokol, özofagus kök hücre niş bileşenlerini in vitro olarak tanımlamak ve anlamak için karşılaştırmalı ve nispeten yüksek verimli bir yöntemi tanımlamaktadır.

Yemek borusu farklı katmanlara ayrılır: epitel, lamina propria, submukoza ve muscularis eksterna (Şekil 1A). Fibroblastlar, stroma olarak adlandırılan submukoza ve lamina propriada bulunur. Bu protokolde, muscularis eksterna mekanik olarak çıkarılır (Şekil 1B), bu da stromada bulunan fibroblastların (PdgfrαH2BeGFP +) kaybına yol açmaz (Şekil 1C). Dissosiyasyondan önce, epitel stromadan ayrılır ve iki doku segmenti oluşur (Şekil 1B). İki tabakanın ayrılması, kırılgan stromal tabakaya kıyasla daha sağlam epitel tabakası için ayrışma süresini arttırma fırsatı sağlar. Bu şekilde, hem canlı epitelyal progenitör hücreleri hem de stromal fibroblastları veren etkili bir izolasyon protokolü oluşturulmuştur (Şekil 1B). Özofagus progenitör hücreleri yüksek INTEGRIN-β4 ve E-CADHERIN ekspresyonlarına göre sıralanır (Şekil 1C, D).
Fibroblastların alt popülasyonları farklı belirteçler kullanılarak izole edilebilir. Bu protokolde, yaygın olarak kullanılan fibroblast belirteçleri PDGFRα ve DPP4'e (CD26) dayanan fibroblast izolasyonu için bir strateji sağlanmıştır. PdgfrαH2BeGFP muhabir ekspresyonu veya DPP4 antikoru ile izolasyon, izole edilen hücrelerin yaklaşık% 50'sinin fibroblast olduğunu göstermektedir (Şekil 1E, F). Ek olarak, PDGFRa + fibroblastlarının% 70'i DPP4 + 'dır, bu da büyük ölçüde örtüşen, ancak aynı olmayan bir fibroblast popülasyonunun elde edildiğini gösterir. Hem epitel hem de stromal hücre popülasyonlarını izole ettikten sonra, özofagus progenitör hücreleri ya tek başına ya da bir matriks kubbesinde fibroblastlarla birlikte kültürlenir. Fibroblastların organoid oluşumuna katkısını incelemek için, ko-kültür büyüme faktörü azaltılmış bir ortamda tutulur (Şekil 1G).
Özofagus progenitör hücreleri EGF, NOGGIN ve RSPO (ENR) varlığında organoidler oluşturur. NOGGIN'in giderilmesi ve RSPO miktarının azaltılması (25 ng/μL; ERdüşük) organoid oluşumunu önlemek için yeterlidir (Şekil 2A). İlginç bir şekilde, ERdüşük ortamdaki özofagus progenitör hücrelerine DPP4 + veya PDGFRa + fibroblastların eklenmesi, her iki fibroblast popülasyonu için destekleyici bir işlev göstererek organoid oluşturma yeteneğini geri yükler (Şekil 2A-D). PdgfrαH2BeGFP transgeninin görselleştirilmesi, fibroblastların organoid oluşumu sırasında epitel progenitör hücrelerle yakın temas halinde olduğunu göstermektedir (Şekil 2A). 6. günde, PdgfrαH2BeGFP + fibroblastlar hala ortak kültürde bol miktarda bulunur. Fibroblastlar kubbe boyunca, organoidlerin yakınında ve onlara dokunarak (tam ok) veya organoidlere (ok ucu; Şekil 2D).
Tüm montaj boyaması, fibroblastların organoidlerle etkileşiminin 3D gösterimini gösterir (Şekil 3). Tüm montaj protokolünü bir temizleme çözeltisi kullanmadan gerçekleştirmek mümkün olsa da, şeffaflığı ve organoidin lazer penetrasyonunu azaltır (Şekil 3B, z-view). Organoidleri monte ederken, ara parça organoid morfolojisinin korunmasına yardımcı olur. Buna karşılık, kapak kaymasının doğrudan organoidler üzerine (ara parça olmadan) kaplanması organoidleri düzleştirir ve organoid yapı kaybına neden olur (Şekil 3A, B).
Hem DPP4+ hem de PDGFRα+ fibroblastlarının organoidlerin etrafına sarılmış olduğu bulunmuştur (Şekil 3C, Video1 ve Video 2). Özofagus organoidlerinin farklılaşması farklı belirteçler kullanılarak değerlendirilebilir. Şekil 4, sağlanan boyama protokolünün boyanması daha kolay keratinler (KRT14/13) ve boyanması daha zor transkripsiyon faktörleri (TRP63/KLF4) için uygun olduğunu göstermektedir. Ko-kültür protokolü, in vivo13,14 ve ENR ortamında yetiştirilen organoidlerde görüldüğü gibi, benzer bir farklılaşma paternine sahip organoidler üretir; KRT14+ veya TRP63+ progenitör hücreler dış tabakayı oluşturur ve KRT13+ veya KLF4+ farklılaşmış hücreler içe doğru yönelir.
Bu protokol, özofagus kök hücre nişini in vitro olarak incelemek için bir araç sağlar ve organoidler ile fibroblastlar arasındaki etkileşimi görselleştirir. Antikorlar kullanarak fibroblastların izolasyonu için bir protokol uygulayarak, yöntem uyarlanabilir ve transgenik farelere ihtiyaç duymadan fibroblast alt popülasyonlarını incelemek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg"> Şekil 1: Progenitör hücrelerin ve fibroblast alt popülasyonlarının yemek borusundan izolasyonu . (A) Yemek borusundaki farklı katmanlara şematik bakış. Stroma lamina propria ve submukoza içerir. (B) İzolasyon protokolüne şematik genel bakış. Kas (muscularis externa) forseps kullanılarak mekanik olarak çıkarılır; Kalan yemek borusu kesilir ve epitel tabakasını stromadan ayırmak için termolizin içinde inkübe edilir. Epitel ve stroma ayrılır, mekanik olarak kıyılır ve enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara sindirilir. Ayrışmış hücreler daha sonra boyanır ve FACS için hazırlanır. (C) Stromada PdgfrαH2BeGFP+ fibroblastları gösteren muscularis eksternasından sıyrılan yemek borusunun kesiti. INTEGRIN-β4 (ITGβ4) ve E-CADHERIN (ECAD) çift pozitif hücreleri yemek borusunun epitelyal progenitör hücreleridir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (D) Tüm tek hücrelerden canlı hücrelerin (üst panel) yüzdesini gösteren epitel hücre izolasyonunun temsili akış sitometrisi grafiği. Alt panel, tüm canlı hücrelerden izole edilmiş ITGβ4 + ECAD + progenitör (Prog.) hücrelerinin yüzdesini gösterir. (E) Canlı hücrelerin yüzdesini gösteren stromal hücre izolasyonunun temsili akış sitometri grafiği (sol üst panel). Tüm canlı hücrelerin izole DPP4+ fibroblastlarının (Fibr.; sağ üst panel) ve Pdgfrα+ fibroblastlarının (sol alt panel) yüzdesini gösteren temsili akım sitometri grafikleri. Pdgfrα+ fibroblastların p'i de DPP4+'tır (sağ alt panel). (F) Sadece DPP4+ hücrelerini (%2.5), DPP4+ PDGFRa+ hücrelerini (7.5) ve PDGFRa+ sadece hücreleri (.7) gösteren stromanın temsili akım sitometri grafiği. Yüzdeler tüm canlı hücrelere aittir. (G) Sadece epitelyal hücreler, 50 ng/μL EGF, 100 ng/μL NOGGIN ve 250 ng/μL RSPO (ENR) varlığında veya EGF ve düşük RSPO konsantrasyonu (25 ng/μL) varlığında fibroblastlarla birlikte bir matris kubbesi içinde kaplanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg"> Şekil 2: Organoid ko-kültürlerin temsili sonuçları. (A) Organoidlerin 1. günden 6. güne kadar büyümesini gösteren parlak alan görüntüleri. PdgfrαH2BeGFP+ fibroblastlarla birlikte kültürlenen organoidlerle parlak alan görüntüleri de nükleer eGFP sinyalini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 25 μm. (B) 6. günde tüm matris kubbesinin parlak alan görüntüleri. Sol sütun, ER düşük veya E düşük R düşük ortada Pdgfrα + fibroblastların varlığında yetiştirilen organoid ko-kültürlerigöstermektedir. Orta sütun, ER düşük veya E düşük R düşük ortada DPP4 + fibroblastların varlığında yetiştirilen organoid ko-kültürlerigöstermektedir. Sağ sütun, ENR ortamında yetiştirilen organoid mono-kültürleri göstermektedir. ENR ortamı = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) ve RSPO (250 ng/μL). ERdüşük = EGF ve 25 ng/μL RSPO. E düşükRdüşük = 5 ng/μL EGF ve 25 ng/μL RSPO. Ölçek çubuğu = 500 μm. (C) Organoid oluşturma verimliliğini (%) gösteren grafik (yani, farklı kültür koşullarında organoidleri oluşturan hücrelerin yüzdesi). Her nokta bir matris kubbesini temsil eder ve çubuk koşul başına tüm noktaların ortalamasını temsil eder. (D) PdgfrαH2BeGFP+ fibroblastlarla birlikte kültürlenmiş 6. gün organoidlerinin parlak alan ve floresan görüntüsü. PdgfrαH2BeGFP+ fibroblastlar kubbe boyunca bulunur, organoidlere (ok ucu) bağlanır ve bağlanmamış ancak organoidlerle temas halindedir (tam ok). Ölçek çubuğu = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg"> Şekil 3: Fibroblast-organoid etkileşimlerinin incelenmesi için tüm montaj boyama protokolü . (A) Tüm mount immünofloresan protokolüne şematik genel bakış. AB = antikor. (B) Temizlenmemiş tüm montaj boyamasının immünofloresan resmi, temizlenmiş organoidlere kıyasla lazer ışığının saydamlığının ve penetrasyonunun azaldığını gösterir. Bir ara parçanın yokluğu organoidin düzleşmesine ve organoid morfolojisinde kayba neden olur. (C) Birlikte kültürlenmiş organoidlerin tüm montaj görüntüleri, organoidlerin etrafına sarılmış ve organoid ile yakın temas halinde VIMENTIN + fibroblastları (Fibr.) ile 3D yüzeylerini göstermektedir. 3D kesitler ve 2D düzlem görüntüleri organoidin lümenini gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg"> Şekil 4: Tüm montaj görüntüleri farklı bazal ve suprabazal hücre popülasyonlarını ortaya koymaktadır. (A) Dış tabakada KRT14+ bazal hücreleri ve KRT13+ farklılaşmış suprabazal hücreleri gösteren PdgfrαH2BeGFP+ fibroblastları ile mono ve ko-kültürlü organoidlerin bütün montaj boyaması. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Dış tabakada TRP63+ bazal hücreleri ve KLF4+ farklılaşmış suprabazal hücreleri gösteren PdgfrαH2BeGFP+ fibroblastları ile mono- ve ko-kültürlenmiş organoidlerin bütün montaj boyaması. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Organoid kültür ortam bileşenlerini açıklayan tablo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Video 1: PdgfrαH2BeGFP+ fibroblast, organoidin etrafına sarılmış ve organoid ile yakın temas halindedir. Video, Şekil 3C'nin üst paneline eşlik eder. Şekil 3C'deki ölçek çubuğu 50 μm'dir ve organoid çapı ~ 120 μm'dir. VIMENTIN beyaz, E-CADHERIN kırmızı, PdgfrαH2BeGFP yeşil ve DAPI mavi renkte gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 2: DPP4 + fibroblast, organoid ile sarılmış ve yakın temas halindedir. Video, Şekil 3C'nin alt paneline eşlik eder. Şekil 3C'deki ölçek çubuğu 50 μm'dir ve organoid çapı ~ 120 μm'dir. VIMENTIN beyaz, E-CADHERIN kırmızı ve DAPI mavi renkte gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Organoid-fibroblast ko-kültürleri, in vivo kök hücre nişini incelemek için bir model sağlar. Burada, özofagus organoid-fibroblast ko-kültürleri için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, fibroblast-organoid etkileşimini görselleştirmek için tüm montaj görüntülemesi kullanılır.

Özofagus Fibroblastlarının Organoid Ko-Kültürler Kullanılarak Fonksiyonel Karakterizasyonu ve Görüntülenmesi

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...

Böylece progenitör hücreler, doku homeostazını korumak için çevre ile etkileşime girer. Ve bu protokolü kullanarak, fibroblastların özofagus progenitör hücre davranışını nasıl etkilediğini anlamaya başlayabiliriz. Ko-kültür sistemi, normal özofagus progenitör nişini taklit eden ilk olarak izole edilmiş hücreleri kullanır.Görüntülemeden önce organoidlerin temizlenmesi, hem hücre etkileşimlerinin hem de organoid morfolojinin analizini sağlar. Bu yöntem insan özofagus organoidlerine uygulanabilir. Örneğin, sağlıklı veya kanser hastalarından gelen materyalleri kullanmak.Bunu yaparken, kanserle ilişkili fibroblastların spesifik işlevi hakkında bilgi edinebiliriz. Epitel ve stromal hücrelerin ayrışması, canlı organoidler elde etmek için kritik öneme sahiptir. Sindirim altında, düşük hücre verimi ile sonuçlanacak, burada aşırı sindirim hücre canlılığını ve organoid oluşturma kapasitesini azaltacaktır.Başlamak için, bir diseksiyon mikroskobu ve forseps kullanarak yemek borusunun muscularis eksternasını mekanik olarak çıkarın. Disseke özofagusun distal ucunu bir çift forseps kullanarak tutun ve kası distalden yemek borusunun proksimal ucuna kadar tutmak ve çekmek için diğer forsepsleri kullanın. Kas tabakasını çıkarın ve atın.Yemek borusunu uzunlamasına açmak için, yemek borusunun bir ucunu tutun ve doku hasarını önlemek için mikro diseksiyon yay makası topunu lümene yerleştirin. Ucunu tutarken yemek borusunu kesin ve 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne veya 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin. Açılan yemek borusunu HBSS'de mililitre termolizin başına 0.5 miligrama batırın ve 15 dakika boyunca bir rocker çalkalayıcıda 37 santigrat derecede inkübe edin.Yemek borusunu termolizin çözeltisinden çıkardıktan sonra, özofagus epitelini stromadan dikkatlice ayırın. Epitel ve stromal tabakayı, HBSS'de 200 mikrolitre ayrışma çözeltisi içeren iki ayrı 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Özofagus epitelini keskin bir neşter kullanarak kıyın ve kıyılmış dokuyu Petri kabından 200 mikrolitre ayrışma çözeltisi ile toplayın.1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 800 mikrolitre taze ayrışma çözeltisi ekleyin ve tüpü kıyılmış epitel tabakası ile 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir rocker çalkalayıcıya yerleştirin. Her 15 dakikada bir 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak çözeltiyi yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetin.Diseksiyon makası kullanarak stromal tabakayı 200 mikrolitre ayrışma çözeltisi içeren 1.5 mililitrelik bir tüpte ince parçalara ayırın ve 800 mikrolitre taze ayrışma çözeltisi ekleyin. Tüpü 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir rocker çalkalayıcıya yerleştirin. Stromal çözelti için 30 dakikalık inkübasyondan ve epitel çözeltisi için 60 dakikalık inkübasyondan sonra, çözeltiyi 20 kez daha yukarı ve aşağı pipetleyin.Stromal çözeltiyi 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden ve epitel çözeltisini 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden yeni 1,5 milimetrelik mikro santrifüj tüplerine geçirin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300G'de santrifüj yapın ve fazla sıvıyı bir mililitrelik pipetle çıkararak süpernatantı atın. Pelet 200 mikrolitre antikor karışımında tekrar askıya alın.Karışımı bir akış sitometri tüpüne aktardıktan sonra, hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Üç mililitre% 1 FBS ekleyin ve beş dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Daha sonra hücreleri en az% 1 FBS'nin en az 200 mikrolitresinde yeniden askıya alın.Canlı hücreleri izole etmek için faks sıralamadan beş dakika önce bir ila 10.000 seyreltilmiş ölü hücre leke işaretleyicisi ekleyin. Sıralanmış epitel hücrelerini ve fibroblastları bir tüpte bir ila iki oranında karıştırın. Beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı 200 mikrolitrelik bir pipetle dikkatlice çıkararak atın.Peletleri soğuk, bazik organoid ortamda tekrar askıya alarak hücreleri bir kez yıkayın ve beş dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve süpernatantı 200 mikrolitrelik bir pipetle dikkatlice çıkararak atın. Hücreleri kubbe başına 10 mikrolitre matris karışımında tekrar askıya alın ve tüpü tekrar buza koyun.Önceden ısıtılmış 48 kuyu plakasını 37 santigrat derece inkübatörden alın ve kuyu başına bir matris kubbesi yapın. 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, organoid ko-kültürler içeren matris kubbelerine 200 mikrolitre önceden ısıtılmış, ER düşük ortam ve sadece epitel organoidleri içeren ilgili matris kubbelerine ENR ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin.Ve ilk iki gün boyunca, ortamı 10 mikromolar kaya inhibitörü ile destekleyin. Organoid ortamı çıkarın ve matris kubbelerine 200 mikrolitre buz gibi PBS ekleyin. Plakayı beş ila 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirdikten sonra, pipet yukarı ve aşağı doğru pipet yapın ve çözeltiyi 0,6 mililitrelik yapışkan olmayan bir tüpe aktarın.Organoidlerin dibe çökmesine izin vermek için 100G'de 30 ila 60 saniye boyunca kısa bir süre santrifüj yapın. Fazla sıvıyı çıkardıktan sonra, tüpe buz gibi soğuk PBS ekleyin ve 30 ila 60 saniye boyunca tekrar santrifüj yapın. Fazla sıvıyı daha önce gösterildiği gibi çıkarın ve organoidi PBS çözeltisinde 200 mikrolitre soğuk,% 4 formaldehit ile buz üzerinde 30 dakika sabitleyin.Organoidin batmasına izin vermek ve formaldehiti çıkarmak için tüpü dik olarak yerleştirin. Kalan formaldehiti yıkamak için 500 mikrolitre soğuk PBS ekleyin. Fazla PBS'yi çıkardıktan sonra, 500 mikrolitre blokaj tamponu ekleyin.Tüpü oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bir rocker çalkalayıcıya yerleştirin. Bloke edici tamponu çıkarın ve organoidleri 200 mikrolitre bloke tamponunda primer antikorlarla yeniden askıya alın. Organoidleri tekrar bir gece boyunca dört santigrat derecede bir rocker çalkalayıcıya yerleştirin.Birincil antikor karışımını çıkarın ve organoidleri PBS'de 500 mikrolitre% 0.02 Triton X 100 kullanarak oda sıcaklığında 60 dakika boyunca yıkayın. Bunu üç kez tekrarlayın. Benzer şekilde, yıkama tamponunu çıkarın ve bloke edici tampona gece boyunca dört santigrat derecede 200 mikrolitre floresan konjuge ikincil antikor ekleyin.PBS'de% 0.02 Triton X 100 ve ardından 500 mikrolitre PBS kullanarak organoidleri tekrar yıkayın. Tüm fazla sıvıyı çıkardıktan sonra, organoidlere 10 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bir mikroskop slaytına 0,05 milimetre çift taraflı yapışkan dört kuyucuklu bir ara parça yerleştirin.10 mikrolitre temizleme çözeltisini organoidlerle birlikte bir kuyucuğa ekleyin ve ara parçanın üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Konfokal mikroskopi sistemi kullanarak görüntüler elde edin. Özofagus progenitör hücreleri, yüksek entegre beta dört ve e-kadherin ekspresyonuna göre sıralanır.Epitel hücre izolasyonunun temsili akış sitometrisi grafiği, tüm tek hücrelerden canlı hücrelerin yüzdesini gösterir. Tüm canlı hücrelerden izole integrin beta dört ve e-kadherin progenitör hücrelerinin yüzdesi burada gösterilmiştir. Burada gösterilen akış sitometri grafikleri, izole DPP4 + ve Pdgf reseptör alfa pozitif fibroblastların yüzdesini temsil eder.Pdgf reseptörü alfa H2 BEGFP pozitif fibroblastlarla birlikte kültürlenen organoidlerle parlak alan görüntüleri nükleer EGFP sinyalini göstermektedir. Altıncı günde tüm matris kubbesinin parlak alan görüntüleri burada gösterilmektedir. Organoid oluşturma verimliliği bu grafiksel görüntü ile sunulmaktadır.Her nokta bir matris kubbesini temsil eder ve çubuk koşul başına tüm noktaların ortalamasını temsil eder. Burada altıncı gün organoidlerinin Pdgf reseptörü alfa pozitif fibroblastlarla birlikte kültürünün parlak alan ve floresan görüntüleri gösterilmiştir. Birlikte kültürlenmiş organoidlerin tüm montaj görüntüleri, organoidlerin etrafına sarılmış ve organoid ile yakın temas halinde olan vimentin pozitif fibroblastlarla 3D yüzeylerini göstermektedir.Mono ve kokültüre organoidlerin Pdgf reseptörü alfa pozitif fibroblastlarla boyanması, farklı bazal ve suprabazal hücre popülasyonlarını ortaya koymaktadır. Organoid oluşturma etkinliği ve organoid boyutu, ko-kültüre dahil edilen fibroblasttan etkilenir. Farklı fibroblast alt popülasyonları kullanıldığında varyasyonlar ve sonuçlar beklenir.Aynı strateji, hem farelerde hem de insanlarda tümörle ilişkili fibroblastları karakterize etmek için kullanılabilir.

functional-characterization-visualization-esophageal-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, hücre dışı bir domuz iskelesi içinde birincil insan özofagus fibroblastı ve skuamöz epitel hücrelerini birlikte kültürleyerek insan organotipik özofagus yapıları oluşturmak için bir in vitro kültür tekniği açıklanmaktadır. Bu 3D kültür modelleri, in vivo doku muadillerinin işlevini ve fizyolojisini taklit eder.

Özofagus 3D Sal Kültür Modeli: İnsan Özofagus Mukoza Modeli Oluşturmak için İn Vitro Kültür Tekniği

Miyofibroblast fenotipine sahip murin ve insan özofagus stromal hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Kültürlenmiş hücreler iğ şeklinde morfolojiye sahiptir, α-SMA ve vimentin eksprese eder ve epitelyal, hematopoietik ve endotel hücre yüzey belirteçlerinden yoksundur. Karakterize edilmiş stromal hücreler, epitelyal-stromal etkileşimlerin fonksiyonel çalışmalarında kullanılabilir.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Bu yazının üretimi, karakterizasyonu ve normal birincil insan özofagus fibroblast ve de-cellularized domuz iskele içinde ekilmiş skuamöz epitel hücrelerinden hazırlanan bir dokuya işlenmiş 3D özofagus yapı potansiyel kullanımlarını açıklar. Sonuçlar normal insan yemek borusunda benzer olgun tabakalı epitel oluşumunu göstermektedir.

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

Biyomalzeme teknolojilerindeki gelişmeler, üç boyutlu çok hücreli tip yapıların geliştirilmesini sağlar. Hava yolu bronşiyol duvarının 3D in vitro modelini sağlamak için hava yolunun ana yapısal hücrelerini kültürlemek için üç ayrı iskele üretmek için elektrospinning protokolleri geliştirdik.

Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için<em&gt; In Vitro</em&gt; Havayolu Wall Modeli

Burada insan burun epitel hücrelerinden in vitro organoid modeli tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Protokol, standart laboratuvar ekipmanı gerektiren ölçümler için seçeneklere ve özel ekipman ve yazılımlar için ek olanaklara sahiptir.

İnsan Nazal Epitel Organoidlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Bu protokol, kimyasal karsinogenez yoluyla indüklenen normal, preneoplastik ve skuamöz hücreli karsinom lezyonlarını temsil eden murin oral-özofagus 3D organoidlerini üretmek ve karakterize etmek için anahtar adımları açıklamaktadır.

3D Organoidlerde Oral-Özofagus Skuamöz Hücreli Karsinomun Modellenmesi

Burada, insan özofagus organoidlerinin kültürü ve hava-sıvı arayüz kültürü için bir protokol sağlanmıştır. Özofagus organoidlerinin hava-sıvı arayüz kültürü, sitokinlerin özofagus epitel bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri 

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Bu protokol, tümör ilerlemesinin farklı aşamalarını temsil eden özofagus organoid modellerinin oluşturulmasını ve histolojik analizini açıklamaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların normalden kanserli dokulara geçiş sırasında hücresel morfoloji, mekansal organizasyon ve moleküler belirteç ekspresyon modellerindeki değişiklikleri incelemelerini sağlar.

Özofagus Organoidlerinin Kurulması ve Histolojik Analizi: Normal Dokulardan Kanserli Dokulara İlerlemenin Modellenmesi

Bu protokol, özofageal skuamoz hücreli karsinomlu (ESCC) hastadan kanser organoidlerini, karsinomla ilişkili fibroblastları (CAF'ler) ve tümör ilişkisiz fibroblastları (CF) aynı anda izole etme yöntemini tanımlar. Bu hasta eşleştirilmiş materyallerin kullanımı, hastalar arası değişkenlikten kaynaklanan sorunları önleyebilir ve ESCC araştırmaları için uygun bir deneysel platform sağlayabilir.

Aynı Özofagus Kanseri Hastasından Tümör Organoidlerinin, Karsinomla İlgili Fibroblastların ve Karşıt Fibroblastların Oluşturulması

Öğrenin özofagus organoid-fibroblast ko-kültür protokolünü, kök hücre nişi dinamiklerini ve kanser ilişkili fibroblast fonksiyonlarını incelemek için. Bu yöntem doku homeostazı ve onkoloji araştırmalarında değerli bir model sunar.

Özofagus Fibroblastlarının Organoid Ko-Kültürler Kullanılarak Fonksiyonel Karakterizasyonu ve Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet