Name: Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somatanın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Öğrenin, patch-clamp kayıtları için yenidoğan kemirgenlerden vestibüler ve spiral ganglion somata izolasyonu ve kültürü yöntemlerini. Bu teknik, işitme ve denge nöronlarının iyon kanallarını incelemede araştırmacılara yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. Jing Bing Xue ve Ruth Anne Eatock'a bu yöntemlere erken katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NIDCD R03 DC012652 ve NIH NIDCD DC012653S tarafından desteklenmiştir ve R01 RK'ya ve T32'ye DC009975 DB, NN ve KR'ye DC0155512.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+diversity+and+the+organization+of+central+vestibular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways.</a> Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).</li>
<li>Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+set+spike+timing+regularity+of+mammalian+vestibular+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).</li>
<li>Smith, C. E., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stochastic+afterhyperpolarizaton+model+of+repetitive+activity+in+vestibular+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents.</a> Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).</li>
<li>Berglund, A. M., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+innervation+by+spiral+ganglion+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse.</a> The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).</li>
<li>Jagger, D. J., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+type+II+spiral+ganglion+neurones+identified+in+a+neonatal+rat+cochlear+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice.</a> Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).</li>
<li>Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+patterns+of+type+II+spiral+ganglion+neurons+in+vitro%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro).</a> The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).</li>
<li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons%3A+involvement+in+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li>
<li>Mo, Z. L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+firing+patterns+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).</li>
<li>Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity%2C+ontogeny%2C+and+cAMP+modulation+of+the+hyperpolarization-activated+current+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells%3A+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442(2010).</li>
<li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+membrane+conductance+in+the+giant+axon+of+Loligo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo.</a> The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+sodium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+ganglion+17eurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons.</a> Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).</li>
<li>Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential+in+mammalian+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The action potential in mammalian central neurons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).</li>
<li>Izhikevich, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIzhikevich%2C+EM+%22Dynamical+Systems+in+Neuroscience%22">Dynamical Systems in Neuroscience</a>. , MIT Press. (2018).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+depolarization-activated+potassium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).</li>
<li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li>
<li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li>
<li>Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity%2C+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li>
<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+cation+channels%3A+From+genes+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li>
<li>Davis, R. L., Crozier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+firing+properties+of+type+I+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+signaling+complex%3A+Regulation+of+type+I+spiral+ganglion+neuron+responses+in+the+auditory+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery.</a> Hearing Research. 336, 1-16 (2016).</li>
<li>Eatock, R. A., Christov, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEatock%2C+RA+%22Ionic+Conductances+of+Vestibular+Afferent+Neurons%3A+Shaping+Head+Motion+Signals+From+the+Inner+Ear%22">Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear</a>. , Elsevier. (2020).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+in+the+biophysical+properties+of+spiral-ganglion+and+vestibular-ganglion+neurons+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 710275(2021).</li>
<li>Armstrong, C. E., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+frog+saccular+hair+cells%3A+distortion+by+enzymatic+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).</li>
<li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li>
<li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+variations+in+K%2B+currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li>
<li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li>
<li>Liu, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion%3A+NaV1.5%2C+NaV1.8%2C+and+tetrodotoxin-sensitive+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Burada sunulan yöntemler, izole nöronlardan alınan kayıtlara özgüdür; Önceki çalışmalar, yarı bozulmamış bir preparatta akson terminallerinden alınan kayıtlara odaklanmıştır. Mevcut terminal kayıt teknikleriyle karşılaştırıldığında, izole kayıtlar üstün boşluk kelepçesi ve izo-potansiyel davranışı sunar. Ek olarak, bu protokol daha geniş bir nöron örneğine erişim sağlar, çünkü vestibüler epitelin yarı bozulmamış kayıtlarında yalnızca kaliks taşıyan alt popülasyonlara erişilebilir. Son olarak, izole kayıtlar, yırtılmış ya...

Vestibülokoklear sinirin bipolar nöronları, iç kulağın duyusal tüy hücrelerini beyin sapına bağlar. Ses ve kafa hareketleri hakkında temel bilgi taşıyıcılarıdır; Bu önemli hücrelerin zarar görmesi sağırlık ve denge bozukluklarına yol açar. Sinirin vestibüler ve işitsel kısımlarının her biri, morfolojik ve fonksiyonel olarak farklı hücre tiplerinden oluşur 1,2. Vestibüler sistemde, iki afferent alt popülasyon, düzenli veya düzensiz aralıklarla kendiliğinden ateşlenir2. Afferent spike zamanlamasının, iyon kanalı bileşimi 3,4'teki altta yatan bir çeşitliliği yansıttığı düşünülmektedir. İşitsel sistemde, spiral ganglion nöronlarının (SGN'ler) iki ana alt popülasyonu vardır; Tip I SGN'ler tek tek iç saç hücrelerine5 temas ederken, Tip II SGN'ler birden fazla dış saç hücresinetemas eder 5. Yarı bozulmamış ve organotipik kültürlerden elde edilen in vitro kayıtlar, Tip I ve Tip II SGN'lerin membran özelliklerinde farklılıklar olduğunu göstermektedir 6,7.
Bu nöronların terminallerinde bulunan birçok iyon kanalı ve nörotransmitter reseptörü de hücre gövdelerinde bulunur. Bu nedenle, izole vestibüler ve spiral ganglion somata kültürleri, iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin bu nöronların tepkisine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için in vitro olarak incelenebilir. İzole edilmiş hücre gövdelerinin kompakt morfolojisi, voltaj kapılı iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin ayrıntılı karakterizasyonu için uygun olan yüksek kaliteli elektriksel kayıtlara izin verir. Temsili çeşitlilikteki nöron alt tiplerine kolay erişim, hücre çeşitliliğinin yüksek verimli analizine olanak tanır.
Bu makale, sıçanlarda postnatal günde (P)9 ila P20'de vestibüler ganglionun üst kısmından ayrışmış ganglion hücre gövdelerini izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem sunmaktadır. Ganglion hücrelerinin başarılı bir şekilde çıkarılması, ayrıştırılması ve kaplanması için gerekli adımlara ek olarak, bu yöntemlerin spiral gangliona genişletilmesi için öneriler de sunulmaktadır. Bu yöntemler, çeşitli laboratuvarlardan 8,9,10 yayınlarda tasarlananların bir evrimidir. Bu yazıda ayrıca, yama kelepçesi kayıtları için sağlıklı hücrelerin seçilmesine yönelik rehberlik de yer almaktadır.
Son olarak, protokol, delikli yama yapılandırmasını kullanarak yama kelepçesi kaydı prosedürünü ana hatlarıyla belirtir11. Delikli yama konfigürasyonu, daha yaygın yırtılmış yama konfigürasyonundan daha fazla zaman alıcı ve teknik olarak daha zorlayıcı olsa da, uzun ve kararlı kayıt oturumlarına izin veren sitoplazmik ortamı korumak için daha iyidir. Bu kayıt konfigürasyonunun faydaları, yırtılmış yama kayıtlarına göre delikli yamadaki hiperpolarizasyonla aktive edilen katyonik akımların geliştirilmiş stabilitesi ile burada gösterilmektedir.
Bu protokol beş bölüm halinde düzenlenmiştir. Bölüm 1-3, önceden hazırlanabilecek ve depolanabilecek çözümleri ve araçları açıklar. Bölüm 4, vestibüler ve SGN'lerin diseke edilmesi ve kaplanması için adımları açıklar. Bölüm 5, kültürde bir süre sonra nöronlardan kayıt adımlarını açıklar. Bizim elimizde, bölüm 4 ve bölüm 5 art arda 2 günlük bir süre boyunca gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Amfoterisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4888-100MG</td><td>Delikli yama kayıtları için.</td></tr><tr><td>ATP di-sodyum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>İç çözeltiye katkı</td></tr> maddesi <tr><td>B27 Takviyesi (50x), serum içermeyen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>kültür ortamına katkı maddesi, SGN</td></tr><tr><td>Beherleri için (1000, 100, 10) mililitre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tezgah üstü santrifüj</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen brülörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td>İç çözeltiye katkı maddesi</td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5318</td><td>dokuyu sindirmek için üç enzimden biri</td></tr><tr><td>Kapak camı, dikdörtgen, # 1 kalınlık, 22x40 &</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0707</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biotium</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, sığır pankreasından</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>dokuyu sindirmek için üç enzimden biri</td></tr><tr><td>Dumont #3 Forseps (Künt)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps (İnce)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forseps ( İnce)</td> <td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>İç çözeltiye katkı</td></tr> maddesi <tr><td>Elektrot Çektirme</td><td>Narashige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Epi-aydınlatma ışık kaynağı&nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>CL 1500 ECO</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td> kafa <td>ve diseksiyon tezgahının etrafını temizlemek için</td></tr><tr><td>Elektrotlar için Filamentli Borosilikat Kılcal Damarlar</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF140-117-10</td><td></td></tr><tr><td>İnce kenarlı diseksiyon bıçağı</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pastör Pipetleri</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>öğütme pipetlerini çekmek için</td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Edilmiş Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td>kültür ortamına katkı maddesi</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>pH tamponlama için tüm çözeltiler</td></tr><tr><td>protokolde Sıcak plaka / manyetik karıştırıcılar&nbsp;</td><td>VWR</td><td>76549-914</td><td></td></tr><tr><td>Tüm numuneleri ve çözeltileri serin tutmak için</td>buzla <td></td><td></td><td>doldurulmuş yalıtımlı kova</td></tr><tr><td>K2SO4, Potasyum Sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9458-250G</td><td>İç çözeltiye katkı</td></tr> maddesi <tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P93333</td><td>İç çözeltiye katkı</td></tr> maddesi <tr><td>KOH (1 M)</td><td>Honeywell</td><td>319376-500ML</td><td>Dahili çözüm getirmek için istenen pH.</td></tr><tr><td>Büyük Yaylı Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14133-13</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz medium&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td>diseksiyon ve banyo solüsyonları&nbsp;</td></tr><tr><td>Kültür yemekleri için düşük profilli banyo kayıt odası</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0236</td><td></td></tr><tr><td>luer-lok şırıngalar,</td><td>L-15 / HEPES / HEPES çözeltisi çekmek için</td> 30 ml <td>BD</td><td>302832</td>.</tr><tr><td>MEM + Glutamax Takviyesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>41-090-101</td><td>kültür ortamının tabanı</td></tr><tr><td>MgCl2-Heksahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>İç çözeltiye katkı maddesi</td></tr><tr><td>mikropipetleri doldurmak için microFil iğnesi - 34 gauge&nbsp;</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>MF34G</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narashige</td><td>MF-90</td><td>Elektrot parlatma için.</td></tr><tr><td>N2 Takviyesi (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>kültür ortamına katkı maddesi, SGN</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>için Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>İç çözeltiye katkı</td></tr> maddesi <tr><td>NaOH (1 M)</td><td>Titrasyon için Thomas Scientific</td><td>319511-500ML</td><td>pH</td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Advanced Instruments Inc.</td><td>3320</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen, Tıbbi sınıf, yeterli regülatör ve boru ile</td><td>USC Malzeme Yönetimi</td><td>MEDOX200 (Tanımlayıcı: 00015)</td> <td>diseksiyon ve banyo solüsyonlarına çözündürmek için</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet ampulü (3 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td>öğütme pipetleri için ampul</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Kültür</td><td></td><td>ortamının kontaminasyonunu önlemek için bilimsel 15140122 katkı maddesi</td></tr><tr><td>Pentobarbital bazlı ötenazi çözeltisi (örneğin, Fatal Plus. 50 &ndash; 60 mg / kg dozlama) &nbsp;</td><td>Ötenazi için</td> <td>MWI Hayvan Sağlığı</td><td>15199</td></tr><tr><td>PES membran filtreleri,&nbsp; 0.2 mikrometre&nbsp;</td><td>Filtreleme çözümleri için</td> <td>Nalgene</td><td>566-0020</td></tr><tr><td>PES membran steril şırınga filtreleri, 0,22 um, 30 mm&nbsp;</td><td>Şırıngalara çekilen solüsyonları filtrelemek için</td> <td>CELLTREAT</td><td>229747</td></tr><tr><td>Petri kapları, 35 x 10 mm</td><td>Mikro diseksiyon ve tutma için Genessee</td>Scientific <td>32-103</td> Delikli yama konfigürasyonunda uç daldırma çözeltisi <td></td></tr><tr><td>Petri Kapları, 60 x 15 mm</td><td>Brüt diseksiyon için</td><td>Midland Scientific</td><td>P7455</td></tr><tr><td>pH Metre</td><td>Mettler Toledo</td><td>Model S20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleyiciler (1000, 200, 10) mikrolitre</td><td>ABD Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-d-lizin kaplı cam tabanlı kültür kabı</td><td>Mattek</td><td>P35GC-0-10-C'den</td><td>kültür için plaka nöronlarına</td></tr><tr><td>Hızlı değiştirme platformu, ısıtmalı taban, 35 mm kültür kapları için Warner</td><td>Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Referans Hücre</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>RC1T</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı</td><td>Miltex</td><td>4-315</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Saplı</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Bilimsel Ölçekli</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetler (10, 25) mililitre</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikon Gres Kiti (kapak camı ve haznenin sızdırmazlığı için)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0378</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Hayvan Giyotini</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>Küçük hayvan giyotini</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP,</td><td>P15'ten daha yaşlı sıçanların diseksiyonu durumunda dekapitasyon için.</td></tr><tr><td>Stereo Diseksiyon Mikroskobu&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Düz cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga (3, 10, 30) mililitre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td>dokuyu sindirmek için üç enzimden biri</td></tr><tr><td>Tüberkülin şırıngası&nbsp;</td><td>İntraperitoneal enjeksiyonla ötenazi solüsyonu sağlamak için</td> <td>Covidien</td><td>8881500105</td></tr><tr><td>Vannas Yaylı Makas, 2,5 mm Son Teknoloji</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Hacimsel şişe, 1000 mililitre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>VWR</td><td>945300</td><td></td></tr><tr><td>Su, steril u ltrapure, R>18.18 megaOhm cm (örneğin, Millipore-Sigma su arıtma ile filtrelenmiş sistem)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CDUFBI001</td><td></td></tr></tbody></table>

patch-clamp kayıtları için yenidoğan kemirgenlerinden vestibüler ve spiral ganglion somata'nın İzole edilmesi ve kültürlenmesi

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

İzole edilmiş ve kültürlenmiş iç kulak ganglion nöronlarının kompakt morfolojisi, bu popülasyondaki hücre çeşitliliğine katkıda bulunan iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin ayrıntılı karakterizasyonlarına izin verir. Bu protokol, yama-kelepçe kayıtları amacıyla iç kulak bipolar nöronlarının somalarının başarılı bir şekilde diseksiyonu, ayrıştırılması ve kısa süreli kültürlenmesi için gerekli adımları özetlemektedir. Vestibüler ganglion nöronlarının hazırlanması için ayrıntılı talimatlar, spiral ganglion nöronlarının kaplanması için gerekli modifikasyonlarla birlikte sağlanır. Protokol, delikli yama konfigürasyonunda tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Hiperpolarizasyonla aktive olan siklik nükleotid kapılı (HCN) aracılı akımların voltaj-kelepçe kayıtlarını karakterize eden örnek sonuçlar, daha standart yırtılmış yama konfigürasyonuna kıyasla delikli yama kayıt konfigürasyonunun kararlılığını vurgulamaktadır. Bu yöntemlerin kombinasyonu, izole somata artı delikli-yama-kelepçe kayıtları, uzun, kararlı kayıtlar ve G-proteinine bağlı reseptörler aracılığıyla sinyalleme gibi hücre içi ortamın korunmasını gerektiren hücresel süreçleri incelemek için kullanılabilir.

Voltaj adımları ailelerini uygulayarak voltaj-kelepçe protokollerini çalıştırmak, çeşitli farklı akım ailelerinin voltaja bağlı aktivasyonunu ortaya çıkarır. Bir VGN'den uyarılan ve yayınlanmış kayıtlardan13 uyarlanan tüm hücre akımlarının temsili örnekleri Şekil 1A,B'de gösterilmektedir. Depolarize edici voltajların uygulanması (Şekil 1B), çok hızlı bir şekilde etkinleşen ve etkisiz hale gelen bir içe doğru akımı (konvan...

Burada, iç kulağın vestibüler ganglion ve spiral ganglion nöronlarından diseksiyon, ayrıştırma, kültürleme ve yama-klemp kaydı için ayrıntılı talimatlar sağlayan yöntemler sunulmaktadır.

Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

İşitsel ve vestibüler afferent nöronların terminallerinde bulunan birçok iyon kanalı ve nörotransmitter reseptörü de hücre gövdelerinde bulunur. İzole edilmiş hücre gövdelerinin kültürleri, bu iyon kanallarının ve reseptörlerin nöronların tepkilerini nasıl etkilediğini anlamak için in vitro olarak incelenebilir. Hücre gövdelerinin kompakt morfolojisi, iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin voltaja bağlı özelliklerini karakterize etmek için yüksek kaliteli elektriksel kayıtlara izin verir.Ayrıca, çok çeşitli hücre tiplerine kolay erişim, hücre çeşitliliğinin fiziksel analizi ile yüksek verim sağlar. Prosedürler, yüksek lisans öğrencisi Katherine Regalado ve doktora sonrası araştırmacılar Dr.Daniel Bronson ve laboratuvarımdan Nathaniel Nowak tarafından gösterilecek. Başlamak için, hücre ayrışması için tritrasyon pipetleri hazırlamak üzere bir Bunsen brülörünün alevine bir cam mera pipeti tutun.Cam uç erimeye başladığında, camı istediğiniz uç çapına kadar uzatın. Küçük bir kıvrım oluşturmak için pipetin bir ucunu alevden çekin. Bükülmüş pipeti mikroskop altına yerleştirin.Bir puanlama karosu kullanarak, camı istenen çapta çizin ve kırın. Pipet ucunu brülör alevinin üstün

isolating-culturing-vestibular-spiral-ganglion-somata-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, spiral ganglion eksplantlarının iç kulaktan izole edilmesi ve bunların çok elektrotlu bir dizi üzerinde Corti organı ile birlikte kültürlenmesi sürecini göstermektedir. Spiral gangliyonlar dikkatlice ekstrakte edilir ve daha küçük doku bölümlerine veya eksplantlara ayrılır. Bu eksplantlar, nöronal süreç büyümesini teşvik etmek için çok elektrotlu dizinin aktif alanı üzerinde kültürlenir.

Murin Spiral Ganglion Nöron Eksplantlarının Çok Elektrotlu Dizilerde Kültürlenmesi

Bu video, bir fare yavrusunun iç kulağından vestibüler nöronları izole etmek için bir yöntem göstermektedir. İç kulağın diseksiyonu, vestibüler ganglionun toplanması ve ardından ganglionun tek hücrelere ayrılması ile ilgili adımları titizlikle ana hatlarıyla belirtir. Bu hücreler daha sonra bir vestibüler nöron kültürü oluşturmak için cam tabanlı tabaklar üzerinde kültürlenir.

Vestibüler Ganglion Nöronlarının Bir Fare İç Kulağından İzole Edilmesi

Bu video, düz montajlı bir fare retinasından elektrofizyolojik kayıt için tam hücre yama kelepçesi tekniğini göstermektedir. Retina içindeki yıldız patlaması amakrin hücrelerine (SAC'ler) yaklaşmak için elektrotlu ince bir cam pipet kullanılır. Bir conta oluşturduktan sonra, zarı yırtmak ve tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunu oluşturmak için emme uygulanır. Son olarak, iyonların SAC sinaptik reseptörlerinden akışı konfigürasyon kullanılarak ölçülür.

Düz Montajlı Bir Fare Retinasından Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturma

Bu video, iç kulak duyusal nöron hücre gövdelerindeki iyonik akımları ölçmek için yama-kelepçe tekniğini göstermektedir. Hücre içi koşulları korurken iyon hareketine izin vermek için zarı delen amfoterisin B içeren dahili bir çözelti ile doldurulmuş cilalı bir yama kelepçeli pipetin hazırlanmasını ve kullanımını detaylandırır. Voltaj darbeleri, iyon kanalı aktivitesini tetiklemek ve kaydetmek için uygulanır ve özellikleri ve davranışları hakkında bilgi sağlar.

İç Kulak Duyusal Nöron Hücre Gövdelerinin Delikli Yama-Klemp Kayıtları

Kızılötesi sinir stimülasyonu işitme sistemi ile ilgili olanlar dahil olmak üzere, sinir tipleri, bir dizi elektrik stimülasyonu için bir alternatif olarak önerilmiştir. Bu protokol, birincil işitsel nöronların bir kültür içinde kızılötesi sinir stimülasyonu mekanizmasını incelemek için bir yama kelepçe yöntem açıklanır.

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu...

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

Bu el yazması, yama kelepçesi kayıtları için sağlam dorsal kök gangliyonlarının nasıl hazırlanacağını açıklar. Bu hazırlık, nöronlar ve uydu glial hücreler için mikro çevreyi korur, böylece ayrışmış DRG nöronları kullanılarak görülen fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerden kaçınır.

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

Burada, fare stria vascularis'ten birincil marjinal hücrelerin izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için bir protokol sunuyoruz ve koklear yan duvar bozukluklarını incelemek için oksidatif stres ve hücresel yaşlanma için in vitro modeller oluşturulmuştur.

Stria vascularis'in Primer Marjinal Hücrelerinin Yenidoğan Farelerden İzolyasyonu ve Kültürü

We present a new dissection method to extract the vestibular ganglion and all five vestibular organs (utricle, saccule, and three cristae: lateral/horizontal, anterior, and posterior) as one whole-mount vestibular complex. Confocal imaging allows visualization of vestibular neuron cell bodies for quantification, as well as neuronal projections to the sensory...

Whole-Mount Dissection of the Vestibular Complex and Quantification of Vestibular Ganglion Neurons in Mice

Öğrenin, patch-clamp kayıtları için yenidoğan kemirgenlerden vestibüler ve spiral ganglion somata izolasyonu ve kültürü yöntemlerini. Bu teknik, işitme ve denge nöronlarının iyon kanallarını incelemede araştırmacılara yardımcı olur.

Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Daha fazla video keşfet