İnsan mezenkimal kök hücrelerinin elektriksel davranışını karakterize etmek için ışığa bağlı dielektroforez

Bu ışığa bağlı dielektroforez protokolü veya LiDEP, insan mezenkimal kök hücrelerinin karakterizasyonu için adım adım bir yöntem sağlar. Bu yöntem, kök hücre örneklerinin heterojenliği hakkında cevaplar sağlamaya yardımcı olabilir. LiDEP'in avantajı, geleneksel DEP yöntemleri için mümkün olmayan kök hücre heterojenliğine yanıt olarak sanal elektrot konfigürasyonunda gerçek zamanlı değişiklikler yapma yeteneğidir.

Bu tekniğin yeni bir kullanıcısı, sanal elektrodu yapmak için projektör ışığını mikro akışkan cihaza yeterince yoğunlaştırmakla mücadele edebilir. Çalışana kadar kurulumu yeniden yapılandırmanızı öneririz. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak kişi, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Zuri Rashad olacak.

Başlamak için, kısa boyutun kenarından yaklaşık beş ila altı milimetre uzaklıkta ve bandın uzun kenarları arasında ortalanmış çift taraflı bir bant üzerinde dört milimetre çapında delikler açarak mikrokanalı hazırlayın. Bir neşter kullanarak, tüm mikrokanal kesimi sırasında bandın her iki yüzündeki koruyucu tabakaların açık olmasını sağlamak için delikler boyunca üç milimetre aralıklarla iki düz çizgi kesin. Tüm konumu yıkanabilir bir işaretleyici ile işaretleyin ve delinen deliklerin çift taraflı bantta delinen deliklerle aynı hizada olmasını sağlayın.

Bu iki delik, mikroakışkan cihazın giriş ve çıkış delikleri olarak kullanılacaktır. Üst ITO cam kızağına üç milimetre çapında iki delik açın. Daha sonra, delinmiş ITO kaplamalı camın üstüne, bandın uzun kenarını camın uzun kenarıyla aynı hizaya getirin.

Çift taraflı bant üzerindeki koruyucu filmin bir tarafını çıkarın. Bandın deliklerini üst ITO cam kızağından hizalayın ve özellikle mikrokanalın yakınındaki hava ceplerini çıkararak hafifçe birbirine bastırın. Diğer koruyucu filmi çift taraflı banttan çıkarın.

İki milimetre boşluk tarafının karşısındaki fotoğraf iletken slaytının kenarıyla eşleşen molibden ve amorf silikon kaplı ITO cam slayda çift taraflı bandın kenarı üst ITO cam slaytın ortasına doğru bastırın. Bu şekilde, ITO ile fotoğraf iletken ITO slaytı arasında bir akşamdan kalma olur. İyi yapışmayı sağlamak için düz bir yüzeye bastırın ve yanlardaki fazla bandı kesin.

Fonksiyon üretecini bağlamak için, ITO cam tabakasının kenarlarına bakır bant ve fotoğraf iletken kaplamalı ITO cam tabakası uygulayın. Bandı ITO'nun yan tarafına veya fotoğraf iletken malzemeye çift taraflı bandın kenarından cam alt tabakanın kaplanmamış tarafına yaklaşık üç santimetreye kadar sarın. Başarılı cihaz imalatını sağlamak için, hem cam yüzeylerin kaplanmış slaytları hem de cama tutturulmuş bakır bant arasındaki direnç okumasını test etmek için bir altimetre kullanın.

4.25 gram sakkaroz ve 0.15 gram glikoz içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe 25 mililitre ultra saf su ekleyin. Sakkaroz ve glikozun yarısı çözünene kadar iyice karıştırın ve 50 mililitreye kadar ultra saf suyla telafi edin. Daha sonra bu DEP arabelleğini tamamen çözünene kadar kuvvetlice karıştırın.

Hazırlanan sakkaroz ve glikoz çözeltisinin 20 mililitresini 50 mililitrelik bir konik tüpe yerleştirin. Tüpe 0.1 gram sığır serum albümini, BSA ekleyin. DEP tamponunda %0,5'lik bir BSA nihai konsantrasyonu elde etmek için tüm BSA çözünene kadar iyice girdap yapın.

Altı insan mezenkimal kök hücresine veya HMSC'lere veya insan embriyonik böbreğine bir kez 10 kez yerleştirin, HEK293 bir mililitre büyüme ortamında 10 mililitrelik bir santrifüj tüpüne asılıdır. Santrifüj, HEK293 hücreleri beş dakika boyunca 201 G'de ve HMSC'ler 10 dakika boyunca 290 G'de. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin.

01 Ve hücreleri% 0.5 BSA ile bir mililitre DEP tampon çözeltisinde yavaşça askıya alın. Santrifüjlemeyi iki kez daha tekrarlayın ve DEP tamponundaki hücreleri %0,5 BSA ile yeniden askıya alın. LiDEP'e hücresel yanıtları ölçmek için dizüstü bilgisayar, projektör, objektif lens, dijital mikroskop ve fonksiyon üreteci gibi deneysel kurulum öğelerini hazırlayın.

10x objektif lensi, LiDEP çipini ve tutucuyu projektör lensinin üzerine yerleştirin. Yıldız, elmas, üç çizgi ve oval gibi ışık projeksiyonları tasarlamak için dizüstü bilgisayarı kullanın ve dizüstü bilgisayarı projektöre bağlayın. AC elektrik alanını uygulamak için LiDEP çipini fonksiyon üretecine bağlayın.

LiDEP kuvvetini yaşayan hücreleri gözlemlemek için, NVIDIA kaydını görüntülemek için dijital bir mikroskop kullanın. Kurulumu tamamladıktan sonra, mikrokanalı% 70 etanol ile yıkayın, ardından önceki hücrelerdeki etanolün giderilmesi için yıkama% 0.5 BSA çözeltisi vardı. DEP alanına daha önce maruz kalan hücreler taze hücrelerden farklı tepki vereceğinden ve veri toplamayı bozabileceğinden, yıkamayı tamamen temizlediğinizden emin olmak için yıkamayı üç kez tekrarlayın.

%0,5'lik BSA çözeltisini bir pipetle çıkarın. Ardından, fonksiyon üretecini istenen voltaj ve frekansa ayarlayın. Hazırlanan hücre süspansiyonunun 70 mikrolitresini daha küçük bir pipet ucu kullanarak cihaz mikrokanalına dikkatlice ekleyin ve mikrokanalın inceliği nedeniyle dökülmeyi önlemek için delikte mikrokanala doğru hafifçe eğin.

Erişim çözümünü tek kullanımlık kağıt mendillerle silin ve biyolojik tehlike altındaki atıklara atın. Ardından, istenen sanal elektro geometri dairelerini, elmasları, yıldızları veya paralel çizgileri LiDEP çipine yansıtın. Dijital mikroskop yazılımında, video uzunluğunu üç dakikaya ayarlayın.

Laboratuvar zamanlayıcısını iki dakika 30 saniyeye ayarlayın. Hücreler LiDEP çipinin mikro kanalında durduktan sonra, video kayıt işlemine başlamak için dijital mikroskop yazılımında başlat düğmesine basın. 10 saniye sonra, AC elektrik alanını uygulamak için fonksiyon jeneratörü kanal çıkışının Açık düğmesine basın ve zamanlayıcı için başlat düğmesine basın.

Hücre DEP davranışını dijital mikroskopla izleyin ve kurulumun etrafında titremeyi veya hareketi önleyin. Zamanlayıcı söndüğünde, kanal çıkışını kapatan ve AC elektrik alanı artık elektrotlardan beslenmeyen fonksiyon jeneratörü kanal çıkışının Açık düğmesine basın. Video kaydını üç dakika sonra durdurun ve gelecekteki analizler için kaydedin.

%0,5 BSA içeren 60 mikrolitre DEP tamponunu yavaşça mikrokanala iterek ve aynı anda çıkışı toplayarak hücreleri LiDEP çipinin çıkış ucundan dışarı pipetleyin. Mikrokanalda çok az hücre olana veya hiç hücre kalmayana kadar devam edin ve DEP'yi gösterildiği gibi tüm frekanslarla tekrarlayın. HMSC'ler için hız açısından DEP yanıtları ve canlılık yüzdeleri belirlendi.

Beş, 10, amd 20 voltaj tepeden tepeye veya VPP'deki pozitif DEP yanıtlarının ölçümleri, hücrelerin sırasıyla saniyede 0.025, 0.036 ve 0.051 mikrometrelik ortalama bir hızda hareket ettiğini göstermiştir. DEP kuvvetini deneyimledikten sonra HMSC'lerin canlılık bulguları, daha yüksek voltajların genellikle 20 VPP'de canlı hücrelerin% 57'si ile daha düşük hücre canlılığı ile sonuçlandığını göstermiştir. Bu çalışma için beyaz, sarı, kırmızı ve mavi renkli elektrotlar seçildi, ancak LiDEP derinlik çipinden geçen aydınlatma, kırmızı turuncu renge sahip fotoğraf iletken katmandan etkilendi.

Bu nedenle, yansıtılan beyaz elektrot beyaz bir iç mekanla sarı göründü, kırmızı elektrot kırmızı bir taslakla turuncu göründü ve mavi elektrot açık yeşil göründü. Bu fenomen, sarı ve beyazın en güçlü DEP alanına sahip olduğunu, mavi ve kırmızının ise daha zayıf olduğunu göstermektedir. HMC'lerin DEP yanıtları, LiDEP ile 10 VPP'de üç derinlik analizöründe ölçüldü.

LiDEP ile, pozitif DEP yanıtında 30 kilohertz'den 20 megahertz'e bir düşüş oldu. Üç analizörden, hücreler pozitif DEP'de 37'den 255 kilohertz'e yükseldi ve pozitif DEP'de 1.772 kilohertz'den 20 megahertz'e düştü. Bu yöntemdeki iki önemli bileşen, elektrik alanının üretimini ve hücre manipülasyonunu sağlamak için güçlü bir ışık kaynağı ve sağlam bir elektrik bağlantısıdır.

Sanal elektrotlara yanıt olarak hücre eğirmesini gözlemledik. Bu nedenle elektro rotasyon da yapılabilecek bir diğer hücre analiz yöntemidir. Elektro rotasyon, HMSC'lerin heterojenliği ve nadir alt popülasyonları hakkında bilgi sağlayacaktır.