Name: Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerini FACS ile izole ederek tek hücreli RNA dizileme ve transkriptom kütüphanesi hazırlama yöntemlerini. Bu protokol, bitki biyolojisinde gen ifadesi farklılıklarını ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu protokolü Şangay Jiao Tong Üniversitesi Tarım ve Biyoloji Fakültesi'nin tek hücreli multi-omik tesisinde kurduk ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32070608), Şangay Pujiang Programı (Hibe No. 20PJ1405800) ve Şangay Jiao Tong Üniversitesi (Hibe No. Agri-X20200202, 2019TPB05) tarafından desteklendik.

Aşağıdaki protokol, aşağıdaki kök hücre tipleri için floresan ve floresan işaretleyici çizgileri olmayan A. thaliana vahşi tip (WT) tohumlar için optimize edilmiştir: ksilem-kutuplu perisiklus hücreleri (J0121), lateral kök başlangıç hücreleri, lateral kök kapak hücreleri (J3411), endodermis ve korteks hücreleri (J0571) (Şekil 1A). Tüm işaretleyici çizgileri, daha önce yayınlanmış bir rapor14'ü takiben vahşi tip bir Arabidopsis tesisine GATA23 promotör güdümlü GFP yapısının sokulmasıyla oluşturulan lateral kök başlatma hücresi işaretleyici hattı hariç, ticari bir kaynaktan (Malzeme Tablosuna bakınız) elde edilmiştir.
1. Bitki materyalinin hazırlanması
<ol><li>A. thaliana WT tohumlarını ve floresan işaretleyici hattı tohumlarını, tohumları oda sıcaklığında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dönen bir inkübatörde% 20 ağartıcıda inkübe ederek sterilize edin.</li>
	<li>Tohumları çift damıtılmış suda (ddH2O) üç ila beş kez durulayın. Bu adımı steril temiz bir tezgahta gerçekleştirin.</li>
	<li>WT ve muhabir hattı tohumlarını yarı güçlü Murashige ve Skoog (MS) ortamına %0,8 agar (w/v)15 ile kaplayın. 4 °C'de 2 gün boyunca tabakalaştıktan sonra bitkileri 5 gün boyunca dikey olarak büyütün (23 ° C'de 16 saat ışık).</li>
</ol>2. Protoplasting
<ol><li>Çözüm A ve Çözüm B olarak adlandırılan protopkalıcı çözeltiler 2,5'i hazırlayın (bkz.<ol><li>400 mM mannitol, %0,05 BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 ve 20 mM KCl içeren Çözelti A'yı hazırlayın (bkz. A Çözümünü −20 °C'de 1 aya kadar saklayın.</li>
		<li>Çözelti A'nın taze bir aliquotuna %1 (w/v) selülaz R10, %1 (w/v) selülaz RS, %1 (w/v) hemiselülaz, %0,5 (w/v) pektolyaz ve %1 (w/v) macerozyme R10 ekleyerek Çözelti B'yi hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Deneye başlamadan önce A Çözeltisi ve B Çözeltisini buz üzerinde yavaşça çözün.</li>
	<li>Kökleri temiz bir bıçak veya makas kullanarak kesin ve kökleri ~ 0,5 cm'lik parçalara ayırın. Kökleri 1,5 mL B Çözeltisine batırın ve ardından oda sıcaklığında 1,5-2 saat boyunca hafifçe döndürün (yaklaşık 18 rpm'de).</li>
	<li>Kök protoplastlarını 40 μm süzgeç ağından süzün (bkz.</li>
	<li>Süzgeç ağını 1-2 mL Çözelti A ile durulayın.</li>
	<li>Adım 2.4 ve adım 2.5'teki sıvıları birleştirin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı bir pipetle atın, hücre peletini 500-600 μL Çözelti A'da yeniden askıya alın ve ardından hemen buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Askıya alınmış hücre çözeltisini, hücre sıralama için yeni bir 5 mL test tüpüne aktarın.</li>
</ol>3. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS)
<ol><li>Sıralayıcıdaki cihaz kurulum adımlarını açın ve tamamlayın (bkz. Floresan kanallarını seçin, otofloresan taban çizgisini belirlemek için kontrol olarak bir WT tesisi (floresan yok) kullanın ve floresan yoğunluğuna ve FSC/SSC teklilerine göre sıralama kapısını ayarlayın (Şekil 2).</li>
	<li>Hücrelerin zarar görmesini önlemek için 1,5 mL'lik bir toplama tüpüne 500 μL Çözelti A (adım 2.1.1) ekleyin. Tüp başına 2.000-3.000 hücre toplayın.</li>
	<li>Sıralamadan sonra, numuneleri hemen buzun üzerine yerleştirin, hücreleri içeren toplama tüpünü 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>2 μL sıralanmış hücre alın ve floresan mikroskobu kullanarak floresan olup olmadığını kontrol edin (bkz.</li>
	<li>Sıralanan hücreleri −80 °C'de saklayın veya kütüphane yapımı için hemen kullanın (adım 4).</li>
	<li>Tek hücreli dizin sıralama için, 96 delikli plakayı bağdaştırıcıya yerleştirin. Plakanın konumunu, damlacık plakanın orta deliğine düşecek şekilde kalibre edin. Sıralama yaparken tek hücreli sıralama modunu seçin, sıralanan hücrelerin hedef sayısını 1 olarak girin ve sıralamaya başlayın.</li>
</ol>4. Smart-seq2 kütüphane hazırlığı
<ol><li>Ultra düşük girdi miktarının bir sonucu olarak, kontaminasyonsuz bir ortamda tek hücreli tip RNA-seq kütüphanesi inşası gerçekleştirin. Deneye başlamadan önce, tezgahı bir yüzey dekontaminantı8 (bakınız Malzeme Tablosu) ve% 75 etanol ile temizleyin.</li>
	<li>0.33 μL% 10 Triton X-100, 0.55 μL RNaz inhibitörü ve 0.22 μL 0.1 M DTT'yi birleştirerek lizis tamponunu (karışım A) (Tablo 1) hazırlayın (bkz.</li>
	<li>Sıralanan numuneye 1 μL karışım A ekleyin ve steril bir havaneyle öğütün. Tercih edilen numune hacmi ≤0,5 μL'dir; hacmi 14 μL'ye çıkarmak için RNaz içermeyen su kullanın. her bir hücre örneğini 0,2 mL ince duvarlı bir PCR tüpüne aktarın.</li>
	<li>0.44 μL oligo-dT 30 VN ters transkripsiyon (RT) reaksiyon astarı (100 μM) ve 4.4 μL dNTP (10mM) içeren karışım B'yi hazırlayın (Tablo 2) (bkz.</li>
	<li>Her tüpteki 14 μL'lik numuneye 4,4 μL B karışımı ekleyin, numuneyi karıştırmak için yavaşça pipet yapın ve numuneyi 72 °C'de 3 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, oligo-dT'yi poli A kuyruğuna melezleştirmek için numuneleri hemen buz üzerine koyun.</li>
	<li>Ters transkripsiyon reaksiyonu karışımını (karışım C) hazırlayın (Tablo 3) (bakınız Malzeme Tablosu). Numuneleri içeren her tüpe 21,6 μL C karışımı ekleyin. RT programını ortak bir PCR cihazında açın (Tablo 4).</li>
	<li>Ön amplifikasyon reaksiyonunu buz üzerinde gerçekleştirin. 44 μL 2x PCR polimeraz karışımı ve 0.88 μL IS PCR primeri (10 μM) birleştirerek D karışımını hazırlayın (Tablo 5) (bkz . 40 μL RT reaksiyon ürününe 40,8 μL karışım D ekleyin ve ön amplifikasyon programını çalıştırın (Tablo 6).</li>
	<li>Ampure XP boncuklarını kullanarak ön amplifikasyon reaksiyonu ürünlerini saflaştırın (bkz. Adım 4.7'den itibaren her numuneye 48 μL boncuk (0,6:1 oranında) ekleyin ve pipetleme ile numuneleri nazikçe karıştırın.</li>
	<li>Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Numuneleri içeren 1,5 mL'lik tüpleri manyetik bir ayırma standına 5 dakika boyunca yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı numunelerden dikkatlice atın.</li>
	<li>Boncukları 200 μL% 80 etanol içinde yeniden askıya alarak yıkayın ve etanol içeren süpernatanı atmadan önce numuneleri manyetik ayırma standına ( Malzeme Tablosuna bakınız) 3 dakika daha yerleştirin.</li>
	<li>Numuneleri 10 dakika boyunca hava ile kurutun ve hava kurutması sırasında kontaminasyonu ve çapraz kontaminasyonu önlemek için tüpü örtün.</li>
	<li>Boncukları 20 μLddH2O içinde tekrar askıya alın, numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve ardından manyetik ayırma standına 5 dakika boyunca yerleştirin.</li>
	<li>Her tüpten 18 μL süpernatantı pipetleyin ve numuneleri yeni 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın. Bir DNA niceleme kiti kullanarak cDNA'nın kalitesini değerlendirmek, bir parça analizörü kullanarak her bir ön kütüphanenin boyut dağılımını belirlemek için numunenin 1 μL'sini kullanın (bkz.</li>
	<li>Bir dizileme kütüphanesi hazırlama kiti kullanarak adım 4.13'ün kütüphane öncesi ürününden Illumina dizilimi16 için bir cDNA kütüphanesi 8 oluşturun (bkz.</li>
	<li>Ampure XP boncuklarını kullanarak kütüphaneleri saflaştırın (adım 4.14'ten itibaren), saflaştırılmış kütüphaneleri ölçün ve adım 4.13'ü takip eden her kütüphanenin boyut dağılımını belirleyin. NOT: Her kütüphanenin eşit nanomollerini bir araya getirerek, hiçbirinin aynı Illumina indeksi kombinasyonuna sahip olmamasını sağlayın. Aksi takdirde, kütüphaneler istenen sıralama çıktısına dayalı bir oranda bir araya getirilebilir ve Illumina sıralayıcısının aynı şeridinde birlikte sıralanabilir. Genel olarak, her kütüphaneyi >10 milyon haritalanmış okuma sağlayan 4-6 GB derinliğe kadar sıralamak, Arabidopsis genomunun 20x-30x kapsama alanını sağlar. Daha düşük sıralama derinlikleri de kabul edilebilir, ancak diferansiyel ifade analizinin önemini etkileyebilir.</li>
</ol>5. RNA-seq veri analizi
<ol><li>Trim-Galore17 kullanarak ham okumaları kırpın, ardından hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2) kullanarak referans genoma eşleyin ve Picard19 (broadinstitute.github.io/picard) kullanarak PCR çoğaltılmış parçaları çıkarın.</li>
	<li>Her numune için en az üç biyolojik replika kullanarak DESeq220 ile diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin (DEG) ham sayım işlemesini ve müteakip analizini gerçekleştirin. Pheatmap paketi ile gen ekspresyonunun kümelenmesini gerçekleştirin ve bir ekspresyon ısı haritasında görselleştirin. NOT: Genlerin ve TE'lerin (dönüştürülebilir elementler) RPKM (milyon eşlenmiş okuma başına kilobaz başına okuma) değerleri Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) ile hesaplanmış ve bir genom tarayıcısında görselleştirilmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).</li>
<li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li>
<li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li>
<li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li>
<li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+aux%2FIAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li>
<li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li>
<li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li>
<li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAsik%3A+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Source+Software%22%5BJournal%5D)">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li>
<li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li>
<li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139(2016).</li>
<li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li>
<li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Smart-seq2 tabanlı protokol, yüzlerce hücreden güvenilir sıralama kitaplıkları oluşturabilir8. Başlangıç malzemesinin kalitesi, transkriptom analizinin doğruluğu için esastır. FACS, ilgilenilen hücreleri hazırlamak için güçlü bir araçtır, ancak bu prosedür, özellikle de protoplasting adım, bitki uygulamaları için optimize edilmelidir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) veya manuel disseke hücreler de girdi25,26 olarak kullanılabilir, bu nedenle burada sağlanan protokol<s...

Hücreler tüm canlı organizmaların temel birimidir ve yapısal ve fizyolojik işlevleri yerine getirir. Çok hücreli organizmalardaki hücreler belirgin bir eşzamanlılık göstermesine rağmen, farklı tipteki hücreler ve bireysel hücreler, gelişim ve çevresel tepkiler sırasında transkriptomlarında farklılıklar gösterir. Yüksek verimli tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), hücresel heterojenliği anlamak için benzeri görülmemiş bir güç sağlar. ScRNA-seq'in bitki bilimlerinde uygulanması, bir bitki hücresi atlası1'in başarılı bir şekilde oluşturulmasına katkıda bulunmuş, bitki dokularındaki nadir hücresel taksonları tanımlamak için kullanılmıştır2, bitki dokularındaki hücre tiplerinin bileşimi hakkında fikir vermiş ve hücresel kimliği ve bitki gelişimi ve farklılaşması sırasında kullanılan önemli işlevleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ek olarak, yeni belirteç genleri keşfetmek için bitki dokularındaki uzaysal zamansal gelişimsel yörüngeleri çıkarmak mümkündür 1,2,3 4 ve farklı bitkilerde aynı hücre tipinin evrimsel korunumunu ortaya çıkarmak için scRNA-seq kullanarak önemli transkripsiyon faktörlerinin işlevlerini incelemek5. Abiyotik stresler, bitki büyümesi ve gelişimi üzerindeki en önemli çevresel etkiler arasındadır. Tek hücreli transkriptom dizilimi yoluyla farklı tedavi koşulları altında bitki dokularındaki hücre tiplerinin bileşimindeki değişiklikleri araştırarak, abiyotik stres yanıt mekanizması6'yı da çözebilirsiniz.
ScRNA dizilimini kullanarak hücre tipleri arasındaki transkripsiyonel heterojenliği çözme potansiyeli, hücre izolasyon yöntemine ve dizileme platformuna bağlıdır. Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), ışık saçılmasına ve hücrelerin floresan özelliklerine dayanan scRNA-seq için hücrelerin bir alt popülasyonunu izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Transgenik teknoloji ile floresan işaretleyici hatlarının geliştirilmesi, FACS7 ile hücre izolasyonunun verimliliğini büyük ölçüde artırmıştır. Smart-seq28 kullanarak scRNA-seq iletmek, hücresel heterojeniteyi disseke etme yeteneğini daha da geliştirir. Smart-seq2 yöntemi, gen tespiti için iyi bir duyarlılığa sahiptir ve düşük bir transkript girişi9 ile bile genleri tespit edebilir. Toplu hücre tipi toplamaya ek olarak, modern hücre sıralayıcıları, Smart-seq210 veya CEL-seq211 gibi diğer çoğullanmış RNA-seq yöntemlerini kullanarak tek hücreli çözünürlükte transkriptom analizine izin veren tek hücreli bir dizin sıralama formatı sağlar. Tek hücreli veya hücre tipi sıralama, paralel multi-omik çalışmalar12,13 gibi diğer birçok aşağı akış uygulaması için potansiyel olarak kullanılabilir. Burada, ksilem-kutup perisiklus hücreleri, lateral kök kapak hücreleri, lateral kök başlangıç hücreleri, korteks hücreleri ve endodermal hücreler gibi bitki hücre tiplerini FACS tarafından Arabidopsis thaliana marker hücre hatlarının köklerinden izole etmek için sağlam ve çok yönlü bir protokol sunulmaktadır. Protokol ayrıca aşağı akış transkriptom analizi için Smart-seq2 kütüphanesinin oluşturulmasını içerir.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m süzgeç</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>622110</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Yeasen</td><td>70101ES76</td><td></td></tr><tr><td>Agilent parça analizörü</td><td>Aglient</td><td>Aglient 5200</td><td></td></tr><tr><td>Agilent yüksek hassasiyetli DNA kiti</td><td>Aglient</td><td>DNF-474-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP boncukları</td><td>BECKMAN</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Betain</td><td>yuanye</td><td>S18046-100g</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır Suyu</td><td>Bay Kas</td><td>FnBn83BK</td><td>%20 (h/h) çamaşır suyu</td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>yuanye</td><td>S24109-500g</td><td></td></tr><tr><td>Selülaz R10</td><td>Yakult (Japonya)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>Selülaz RS</td><td>Yakult (Japonya)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü (1.5 mL)</td><td>Eppendolf</td><td>30121589</td><td></td></tr><tr><td>DNaz, RNase, DNA ve RNA Uzak Yüzey Dekontaminantları</td><td>Beyotime</td><td>R0127</td><td></td></tr><tr><td>dNTP'ler (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (0,1 M)</td><td> invitrojen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd</td><td>100092680</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD FACS Melodi</td><td>BD-65745</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu&nbsp; (1000 ve mikro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu&nbsp; (200 & L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF140-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu (10 & mikro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF104-10-Q</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ucu (100 & mikro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Dört Boyutlu Döner Karıştırıcı</td><td>Kylin -Bell</td><td>BE-1100</td><td></td></tr><tr><td>Hemiselülaz</td><td>sigma</td><td>9025-56-3</td><td></td></tr><tr><td>IS PCR astarı</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA</td></tr> <tr><td>HiFi HotStart ReadyMix( 2X)</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>7958935001</tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Makrozyme R10</td><td>Yakult (Japonya)</td> <td>9032-75-1</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik ayırma standı</td><td>invitrojen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>aladdin</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>aladdin</td><td>145224948</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 &nbsp;</td><td>yuanye</td><td>R21455-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüjler</td><td>Eppendorf</td><td>Santrifüj 5425</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-mini santrifüj</td><td>Titan</td><td>Timi-10k</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti</td><td>illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>oligo-dT30VN astarı</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'PCR</td></tr> <tr><td>cihazı</td><td>Termal döngüleyici</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Pektolyaz</td><td>Yakult (Japonya)</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>Bitki işaretleyici çizgileri</td><td>Nottingham Arabidopsis Stok Merkezi (NASC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA HS Test Kiti</td><td>invitrogen</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 florometre</td><td>invitrojen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>RNaz inhibitörü ve nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>invitrojeni</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Çözeltisi A</td><td></td><td></td><td>400 mM mannitol, %0,05 BSA, 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl<alt>2</alt>, 20 mM KCl</td></tr><tr><td>Çözelti B</td><td></td><td></td>, <td>%1 (a/h)selülaz R10, %1 (a/h) selülaz RS, %1&nbsp; (w/h)hemiselülaz, %0.5 &nbsp; (w/h)pektoliyaz ve %1&nbsp; (w/v) Taze bir çözelti alikotunda Macerozyme R10 Steril bir</td></tr><tr><td>havaneli</td><td>BIOTREAT</td><td>453463</td><td></td></tr><tr><td>Süzgeç (40 & mikro; m )</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>251100</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV ters transkriptaz (200 U/&mikro; L)</td> <td>canlandırıcı</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV tamponu (5x)</td> <td>canlandırıcı</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Test tüpü (5 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı ince duvarlı PCR tüpleri (0,5 mL)</td><td>AXYGEN</td><td>PCR-05-C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600198-0500</td><td></td></tr><tr><td>TSO astarı</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'Girdap</td></tr> <tr><td></td><td>Titan</td><td>VM-T2</td><td></td></tr></tbody></table>

bitki hücre tiplerinin İzolasyonu ve transkriptom analizi

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Çok hücreli organizmalarda, gelişimsel programlama ve çevresel tepkiler, farklı hücre tiplerinde ve hatta hücresel heterojenite olarak bilinen hücreler içinde oldukça farklı olabilir. Son yıllarda, yeni nesil dizileme (NGS) teknikleriyle birleştirilen tek hücreli ve hücre tipi izolasyon, biyolojik süreçleri tek hücreli çözünürlükte incelemek için önemli araçlar haline gelmiştir. Bununla birlikte, bitki hücrelerinin izole edilmesi, bitkilerde tek hücreli yaklaşımların uygulanmasını sınırlayan bitki hücre duvarlarının varlığı nedeniyle nispeten daha zordur. Bu protokol, aşağı akış multi-omik analizi ve diğer çalışmalar için uygun olan, bitki hücreleri ile floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tabanlı tek hücreli ve hücre tipi izolasyon için sağlam bir prosedürü açıklamaktadır. Arabidopsis kök floresan işaretleyici çizgilerini kullanarak, ksilem-kutup perisiklus hücreleri, lateral kök başlangıç hücreleri, lateral kök kapak hücreleri, korteks hücreleri ve endodermal hücreler gibi belirli hücre tiplerinin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. Ayrıca, Smart-seq2 kullanan etkili bir aşağı akış transkriptom analiz yöntemi de sağlanmaktadır. Hücre izolasyon yöntemi ve transkriptom analiz teknikleri, diğer hücre tiplerine ve bitki türlerine uyarlanabilir ve bitki biliminde geniş uygulama potansiyeline sahiptir.

Protoplast izolasyonu Bu protokol, floresan A. thaliana kök işaretleyici çizgilerinin protoplast sıralaması için etkilidir. Bu belirteç çizgileri, floresan proteinlerinin özellikle hedef hücre tiplerinde eksprese edilen genlerle füzyonu veya arttırıcı tuzak çizgileri kullanılarak geliştirilmiştir (Şekil 1). Çok sayıda doku ve organ, model bitkilerde ve mahsullerde spesifik floresan belirteçleri eksprese eden hücre tiplerine diseke edilmiştir.
<p class="jove_c...

Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Tek hücre veya hücre tipleri üzerindeki transkriptom analizi, ayrıntılı hücre içi düzenleyici mekanizmaları ortaya çıkarmak için güçlü bir araç olan heterojenlik tarafından maskelenen gen ekspresyonunun ince farkını tespit edebilir. Floresan ile aktive hücre sıralama ve ardından RN-seq analizi, yüksek transkript algılama hassasiyeti ve diğer multi-omik yaklaşımlarla uyumluluk ile tek hücreli veya toplu hücre tipi modunda gerçekleştirilebilir. Bu protokolün ilk kez kullananların, protoplast sıralama ve RNA-seq kütüphanesi hazırlığındaki bazı adımlara dikkat etmeleri gerekir.Jun Zhang ile birlikte, laboratuvarımızda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Rongrong Xie, prosedürün gösterilmesinde yardımcı olacaktır. Başlamak için, Arabidopsis thaliana vahşi tip ve floresan işaretleyici hat tohumlarını% 20 ağartıcıya koyun ve tohumları sterilize etmek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dönen bir inkübatör kullanarak inkübe edin. Steril bir tezgahta çalışırken, tohumları çift damıtılmış suda üç ila beş kez durulayın.Yabani tip ve muhabir hattı tohumlarını yarı mukavemetli MS ortamına hacim agar başına% 0.8 ağırlıkla plakalayın. Bitkileri iki gün boyunca dört santigrat derecede tabakal

isolation-and-transcriptome-analysis-of-plant-cell-types

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki materyali belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılan bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu teknik, özellikle hücre tipleri, hücresel bölünmeler ve Floresans Aktif Hücre Sıralama floresan proteinleri ifade transgenik işaretleyici hatları kullanmaktadır. Ayrıca, büyüme kurulumu kolaylaştıran tedavisi burada...

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Kaynak: Rufián, J. S. ve diğerleri. Bitki dokusunda Pseudomonas Syringae genlerinin tek hücreli analizi. J. Vis. Exp. (2022).Bu video, floresan etiketlenmiş transkripsiyon faktörü kullanılarak bitkiden ekstra edilmiş patojenik bakterilerde gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Konfokal görüntüleme, virülans gen ifadesinde heterojenliği ortaya koyarak klonal bakteri popülasyonundaki fonksiyonel çeşitliliği ortaya koyuyor.

Bitki Ekstraksiyonu Patojenlerinden Gen İfadesinin Tek Hücreli Analizi

Burada, transkripsiyonel profilleme için belirli bitki hücre tiplerinin lazer destekli mikrodiseksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Protokol farklı türler ve hücre tipleri için uygun olsa da, odak noktası, turpgil cinsi Boechera'da eşeyli ve apomiktik üreme için önemli olan dişi germ hattının son derece erişilemez hücreleridir.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Burada sunulan bitki dokularının lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) için bir protokoldür. LCM, doku alanlarını kontaminasyonsuz bir şekilde izole etmek için mikroskobik bir tekniktir. Prosedür doku fiksasyonu, parafin katıştırma, kesit, LCM ve RNA ekstraksiyon içerir. RNA, transkripsiyonların alt dokuya özgü, zamansal olarak çözümlenmiş analizinde kullanılır.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

Arabidopsis bitkilerinin yaprak yüzeyinden ve apoplastından hücre dışı RNA'yı izole etmek için basit ama oldukça tekrarlanabilir bir yöntem tarif ediyoruz.

Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA'nın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz

Öğrenin, Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerini FACS ile izole ederek tek hücreli RNA dizileme ve transkriptom kütüphanesi hazırlama yöntemlerini. Bu protokol, bitki biyolojisinde gen ifadesi farklılıklarını ortaya çıkarır.

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

Daha fazla video keşfet