Name: Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Keşfedin, kriyokorunmuş domuz bağırsak kriptlerinden 3D organoid ve 2D tek katman hücre kültürü oluşturma yöntemini. Bu protokol, bağırsak biyolojisi ve veteriner sağlık araştırmaları için besin taşınımı ve bariyer fonksiyonu çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig" projesi) ve INRAE HOLOFLUX ("Holopig" projesi) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Genotoul çekirdek tesislerine (TRI) minnettardır. Christelle Knudsen'e (GenPhySE, INRAE, Toulouse) dikkatli redaksiyonu için teşekkür ederiz.

<ol><li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465(2013).</li>
<li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368(2021).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+enteroids%3A+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682(2019).</li>
<li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375(2020).</li>
<li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li>
<li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031(2022).</li>
<li>Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance%2C+intestinal+development%2C+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Tsai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li>
<li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+porcine+intestinal+organoids%3A+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li>
<li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li>
<li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced%2C+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li>
<li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143(2021).</li>
<li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94(2021).</li>
<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821(2020).</li>
<li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1%2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011(2020).</li>
<li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease%2C+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Stem+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li>
<li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196(2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394(2019).</li>
<li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430(2019).</li>
<li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu protokol, uzun süreli depolama ve daha sonra 3D organoidlerin kültürü için domuz yavrusu bağırsağından epitel kriptlerini kriyoproteksiyon için kullanılan bir yöntemi tanımlar. Bu protokol DMSO, FBS, Y27632 ROCK inhibitörü, DMEM ve antibiyotik içeren bir dondurma çözeltisi kullanır. Domuzlarda yapılan bir başka çalışmada, benzer bir dondurma çözeltisinde kriyokorunmuş kriptlerden organoidler elde edildi, ancak ROCK inhibitörü15 olmadan. Y27632 ROCK inhibitörü, apoptozu önlemek ve kök hücre havuzunu korumak için dahil edilmiştir, çünkü çözüldükten sonra epitel kript hücreleri ayrışır, bu da hücre ölümüne ('anoikis') yol açabilir27,28. İlginç bir şekilde, at enteroidleri, sadece DMEM ve DMSO16 içeren bir kültür ortamında dondurulmuş epitel kriptlerinden elde edilmiştir; Bu basit yöntem henüz domuz epitel kriptleri için test edilmemiştir. Epitel kriptleri yerine dondurulmuş dokulardan veya biyopsilerden insan ve domuz organoidleri yetiştirmek için başka yöntemler de yayınlanmıştır 4,17. Bu yöntemin avantajı, zaman ve laboratuvar ekipmanı gerektiren kript izolasyon prosedürünü gerçekleştirmeden bağırsak dokularını doğrudan kriyoproteksiyon yeteneğidir. Bu, dokuların laboratuvardan uzakta toplanması gerektiğinde uygun olabilir. Bununla birlikte, kesimden hemen sonra kriptleri izole ederken, küçük donmuş doku parçalarından başlayarak durum böyle olmayan çok sayıda kript elde etmek için bağırsağın büyük bölümleri işlenebilir. Epitel kriptlerinin çözülmesinden sonra, organoidler tohumlamadan 3-4 gün sonra gözlendi ve 10 gün sonra ayrıldı. Bu, kültürün taze epitel kriptlerinden başlatılmasından daha yavaş bir büyüme oranıdır, bunun için organoidler tohumlama sonrası 1. günden elde edilmiştir ve genellikle 5. gün11 civarında bölünebilir. Khalil ve ark. ayrıca dondurulmuş kriptlerden15 başlayarak domuz enteroidlerinin gecikmiş bir büyümesini bildirmiştir, bu da kök hücrelerin proliferatif kapasitelerini geri kazanmaları için zamana ihtiyaç duyabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, dondurulmuş kriptlerden başlarken, dondurma işlemi sırasında kök hücrelerin ölümünden kaynaklanabilecek taze kriptlere kıyasla daha az sayıda organoid elde ettik. Bazı kript çözme girişimlerinde (% <20), muhtemelen optimal olmayan bir kriyoprezervasyon prosedürü nedeniyle (örneğin, muhtemelen 1 saatten fazla kript izolasyonundan sonra gecikmiş dondurma) dondurulmuş kriptlerden organoidler elde edemedik. Bu nedenle, kriptleri sayana kadar buz üzerinde tutmanızı ve mümkün olduğunca çabuk dondurmanızı öneririz.
3D organoidler için, insanlar için formüle edilmiş ticari bir organoid kültür ortamı kullanmayı seçtik. Gerçekten de, önceki raporlar domuz bağırsak organoidlerinin bu ortamla verimli bir şekilde büyüdüğünü göstermiştir 8,11,14,19,25,26,29,30. Bu kültür ortamının kullanıma hazır olması ve bir parti içinde standart bir büyüme faktörü konsantrasyonuna sahip olması ilgi çekicidir. Bununla birlikte, bu kültür ortamı maliyetlidir, bileşimi açıklanmamıştır ve bu nedenle bileşimini modüle etmek mümkün değildir. Buna karşılık, diğer çalışmalarda domuz bağırsak organoidleri farmakolojik inhibitörler, rekombinant büyüme faktörü ve / veya şartlandırılmış ortam 5,6,7,21 içeren özelleştirilmiş ortamlarda kültürlenmiştir. Son derece esnek ve daha ucuz olmasına rağmen, bu yöntem şartlandırılmış ortamların üretimi için zaman alıcıdır ve koşullu ortamdaki büyüme faktörlerinin konsantrasyonundaki potansiyel değişkenlik nedeniyle tekrarlanabilirlikten yoksun olabilir. Bu nedenle, her bir koşullu ortam partisinin kalitesi, organoid büyüme veya marker gen ekspresyonu31 ölçülerek doğrulanmalıdır.
Bir çalışma, burada kullanılan aynı ticari organoid kültür ortamında kültürlenen domuz jejunal organoidlerinin, rekombinant büyüme faktörü ve / veya şartlandırılmış medya içeren ortamlarla kültürlenen enteroidlere kıyasla daha hızlı büyüdüğünü ve daha az farklılaşmış göründüğünü göstermiştir23. Yüksek proliferatif bir durum, 3D organoidlerin kültürünü kolaylaştırır, ancak bağırsak fizyolojik özelliklerini daha fazla temsil etmek için farklılaşmayı indüklemeyi gerektirebilir. Bu protokolde, 3D organoidlerin geçişi için, hücreler sayım için tamamen ayrıştırılır ve ECM'de tohumlanan hücre sayısını kontrol etmeye izin verir. Bu, yoğunluklarından oldukça etkilenen organoidlerin fenotipinin tekrarlanabilirliğini arttırır. Dahası, hücreleri saymak, kültür programını uyarlamayı gerektiren çok düşük veya aşırı kalabalık bir kültür elde etmekten kaçınır. Diğer çalışmaların çoğu, tek hücrelere tamamen ayrışmamış organoid fragmanlar hazırladı ve geçiş için bir seyreltme oranı kullandı. Bu yöntem daha basittir, ancak kültürün organoid yoğunluğuna göre değişkenliğe neden olabilir.
Tek katmanlı kültür için, organoid hücreler, hücrelerin bağlanmasına izin veren, ancak organoidlerin 3D'de büyümesini önleyen ince bir ECM tabakası ile önceden kaplanmış kültür eklerine ekilir. Bu protokol, daha önce domuzlarda23'te tarif edildiği gibi, bir ECM proteini olarak kollajen tip IV'ü kullandı. Domuz organoid monokatmanları ile yapılan diğer çalışmalar, burada 3D organoidleri 6,8,9,21,25,30'u kültürlemek için kullanılan tümör kaynaklı ECM'yi kullanmıştır. Kollajen kullanmanın avantajı, protein konsantrasyonunu tümör kaynaklı ECM'de geçerli olmayan, tam olarak tanımlanmış bir bileşimle standartlaştırma yeteneğidir. Hücre monokatmanları kültürünün başarısı için kritik bir adım, iyi tanımlanmış kenarlara ve siyah döküntü içermeyen boş bir lümene sahip olması gereken öncü 3D organoidlerin görsel görünümüne dikkat etmektir. Gerçekten de, yüksek olgunlaşma seviyesine ve düşük proliferatif orana sahip organoidler, 2D kültür için uygun bir hücre kaynağı değildir. Bu nedenle, 3D organoidlerin tek hücrelere ayrışmasının zamanlaması, bu adımın başarısı için çok önemlidir.
Tek hücrelerden 2D tek katmanlı kültür, tohumlanan hücre sayısının standartlaştırılmasına izin verir, bu da diğer bazı yöntemlerde yapıldığı gibi organoid parçalardan başlarken daha zordur. Cm2 başına 7.6 x 10 5 hücre tohumladık, bu da cm2 başına 0.25 x 105 hücre ile cm2 başına 1.78 x 10 5 hücre arasında değişen daha düşük bir hücre yoğunluğu kullanan domuzlarda 21.22.23 diğer çalışmaların çoğuna kıyasla yüksektir. Çok sayıda organoid hücrenin gerekliliği bu protokolün bir sınırlamasını oluşturur, ancak 1 gün sonra kültür ekini tamamen kaplayan hızlı bir şekilde akıcı bir tek katman elde etmemizi sağladı. Buna karşılık, Vermeire ve ark.23, tohumlanan hücrelerin daha düşük bir yoğunluğu ile 4-7 gün sonra akıcılık elde etmişlerdir (0.25 x 10 5 hücre / cm2'den 0.4 x 105 hücre /cm2'ye). Bazı çalışmalar, virüs 8,30 ile enfeksiyonlar için kültür yüzeyini tam olarak kaplamayan domuz organoid hücre monokatmanlarınıda kullanmıştır. Bu koşullarda, epitel hücrelerinin apikal tarafına tedaviler için erişilebilir, ancak amaç besin emilimini veya epitel geçirgenliğini incelemek ise, tamamen birleşen tek katmanlar gereklidir.
Organoid hücre monokatmanları için, sığır enteroid türevi monokatmanlar32 üzerine yapılan yeni bir araştırmaya dayanarak,% 20 FBS ile desteklenmiş ticari bir organoid kültür ortamı kullanılmıştır. Testlerimizde, muhtemelen yüksek bir büyüme faktörü gereksinimi nedeniyle, tamamen akıcı tek katmanlı elde etmek için% 20 FBS takviyesi gerekliydi. Aksine, aynı ticari ortamı kullanan diğer çalışmalar, ek FBS 8,25,30 olmadan, ancak tam akıcılığa ulaşmadan tek katmanlar oluşturmuştur. Diğer çalışmalar ayrıca, domuz organoid hücre monokatmanlarının kültürü için özelleştirilmiş bir ortamda% 20 FBS ile takviye kullanmıştır21,22. Deneylerimizde, TEER tohumlamadan 1 gün sonra yüksektir (yaklaşık 700 Ω · cm2) ve 3. güne kadar yüksek kalır (yaklaşık 1.500 Ω ·cm2; Bu, oklüdin ifadesiyle belirtildiği gibi sıkı bağlantıların oluşumu ile tutarlıdır. Van der Hee ve ark., jejunum organoid hücre monokatmanları21 için 72 saat üzerinde benzer TEER değerleri elde etmişlerdir. Ayrıca, tek katmanların günlük medya değişiklikleriyle 12-15. güne kadar korunabileceğini gösterdiler. Buna karşılık, diğer çalışmalar domuz organoid hücre monokatmanları için çok daha düşük TEER değerleri (yaklaşık 200 Ω ·cm2) bildirmiştir 6,22. Çalışmalar arasındaki bu farklılıklar, çalışılan bağırsak segmenti veya epitel farklılaşmasını etkileyen kullanılan medya ile ilgili olabilir.
Sonuç olarak, dondurulmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsağı 3D organoidleri yetiştirmek için yukarıdaki protokol, kültür çalışmalarının organizasyonunu kolaylaştırır. Canlı hayvanlardan elde edilecek taze dokulara olan ihtiyacı azaltır. Ayrıca, domuz organoidlerinden türetilen tamamen birleşik hücre monokatmanlarının 3 günden daha kısa sürede nasıl oluşturulacağını da açıklıyoruz. Bu nedenle, protokollerimiz veterinerlik veya biyomedikal araştırmalar için domuz bağırsak epitelini inceleyen bilim adamları için yararlı kaynaklar olabilir.

Bağırsak epiteli, luminal ortam ile arayüzde sindirim mukozasını kaplayan tek katmanlı bir hücre tabakasından oluşur. Bu pozisyon, kök hücrelerin varlığı ve çoklu farklılaşmış epitel hücre tipleri (emici, enteroendokrin, Paneth ve kadeh hücreleri)1 ile desteklenen besin emilimi ve bariyer fonksiyonu gibi çeşitli işlevlerle ilişkilidir. Geleneksel olarak epitel hücrelerini incelemek için kullanılan ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, bağırsak epitelinin hücresel karmaşıklığını yansıtmadıkları ve genomik anormallikler gösterdikleri için büyük sınırlamalara sahiptir2. Sato ve ark.3 tarafından üç boyutlu (3D) organoidlerin geliştirilmesi, bağırsak epitelini gelişmiş bir fizyolojik alaka düzeyi ile incelemek için yeni bir model sağlamıştır. Gerçekten de, bağırsak organoidleri dönüştürülmemiş kök hücrelerden türetilir, çoklu hücre tiplerinden oluşur ve bağırsak epitelinin işlevselliğini özetler. Bağırsak organoidleri, bağırsak epitelinin gelişimini ve işlevlerini ve patojenler, besinler, toksinler, ilaçlar, mikrobiyota ve metabolitleri ile etkileşimlerini anlamak için giderek daha fazla kullanılmaktadır2.
Başlangıçta insanlar ve fareler için geliştirilen bağırsak organoidlerini kültürlemek için kullanılan yöntemler son zamanlarda domuzlar4 de dahil olmak üzere diğer türlere uyarlanmıştır. Gonzales ve ark.5, jejunumdan domuz organoidlerini kültüre alan ilk kişilerdi; O zamandan beri, domuz organoidleri diğer bağırsak segmentleri (duodenum, ileum ve kolon)6,7,8 için tanımlanmıştır ve konuma özgü bir fenotip9,10,11'i koruduğu gösterilmiştir. Domuz bağırsağı 3D organoidleri artık besin maddelerinin12,13 veya enterik enfeksiyonların 6,8,14 etkisini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Çalışmaların çoğu, yeni izole edilmiş epitel kriptlerinden başlayarak bağırsak organoidlerinin kültürünü tanımlamıştır. Bununla birlikte, bu, özellikle domuzlar gibi büyük hayvanlarla çalışırken, lojistik nedenlerden dolayı her zaman mümkün değildir. Gerçekten de, domuzlar için hayvan tesisleri, organoidlerin kültürlendiği laboratuvardan uzağa yerleştirilebilir ve bu da iş organizasyonunu zorlaştırır. Dahası, organoid kültür zaman alıcıdır; Bu nedenle, örneğin farklı bağırsak segmentlerinden veya birkaç hayvandan aynı anda birden fazla organoid çizgi yetiştirmek pratik değildir. Bu sorunları aşmak için, insanlarda, atlarda ve domuzlarda yapılan birkaç çalışma, organoidleri dondurulmuş bağırsak dokularından (veya biyopsilerden) veya izole epitel kriptlerinden 4,15,16,17 kültürleme yöntemlerini tanımlamıştır. Bu yöntemler, bağırsak epitel kök hücrelerinin tek bir hayvanın birden fazla bağırsak segmentinden kriyoprezervasyonuna izin verir, bu da gerektiğinde organoidleri büyütmek için kullanılabilir. Dahası, bu, kök hücre bağışçısı olarak kullanılan canlı hayvan sayısında güçlü bir azalmaya izin verir, çünkü büyük kriyokorunmuş kript stokları oluşturulabilir (3R ilkeleri). Bu yöntemin bir diğer avantajı, bağırsak organoidlerinin, fenotipik veya genotipik sonuçlar elde edildikten sonra sadece ilgili hayvanlardan büyümesidir ve bu da oldukça uygun maliyetlidir.
İn vivo, bağırsak epitel hücreleri polarize olur ve apikal taraf lümene doğru yönlendirilir. İn vitro, 3D organoidlerde, epitel hücrelerinin apikal tarafı da lümene (yani organoidlerin içine) bakar4. Bu organizasyon, luminal bileşenlerin (örneğin, besinler, mikroplar, metabolitler) epitel hücreleri üzerindeki etkilerini incelerken bir sorun olan apikal tarafa erişimi önler. Bu dezavantajı aşmak için, organoid hücrelerin 2D monokatmanlar olarak kültürlenmesi, mikroenjeksiyon ve polaritenin tersine çevrilmesi ("apikal-out organoidler") gibi çeşitli yöntemler geliştirilmiştir18,19. Organoid hücre monokatmanlarının kültürü, en verimli ve izlenebilir sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Prensip, 3D organoidleri tek hücrelere ayırmak ve daha önce ince bir hücre dışı matris (ECM) tabakası (ECM) 20 ile kaplanmış bir hücre kültürü kabına tohumlamaktır. Bu kültür koşullarında, epitel hücrelerinin apikal tarafı yukarı bakmaktadır ve bu nedenle deneysel tedaviler için erişilebilir20. Organoid hücre monokatmanlarının kültürü yakın zamanda domuz bağırsağı21,22 için uyarlanmıştır; Domuz 3D organoidlerinden türetilen hücre monokatmanları, enterik enfeksiyonların incelenmesi 6,23,24,25, besin maddelerinin taşınması9 ve sindirim hastalığı modellemesi 26 dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılmıştır.
Burada, bu çalışma ilk olarak kriyokorunmuş epitel kriptlerinden türetilen domuz bağırsağı 3D organoidlerinin kültürü ve bakımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır (Şekil 1). Daha sonra, domuz bağırsağı 3D organoidlerinden hücre monokatmanları oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Burada açıklanan yöntemler, besin taşınması, bariyer fonksiyonu ve konakçı-mikroorganizma etkileşimleri için domuz bağırsak epitelini incelemek için kullanılabilecek deneysel araçlar sağlar.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Oda sıcaklığında saklayınız.</td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu hücre kültürü plakası </td><td>Corning</td><td>003526</td><td></td></tr><tr><td>48 oyuklu hücre kültürü plakası </td><td>Corning</td><td>003548</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polipropilen konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin (BSA)</td> <td>Euromedex</td><td>A6003</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Santrifüj Universal 320 R</td><td>Hettich</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>İnsan plasentasından kollajen tip IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Stok çözeltisini üreticinin tavsiyesine göre asetik asit içinde 1 mg/mL'de hazırlayın. Alikot (500 &mikro; L) ve -20 ° C'de saklayın. </td></tr><tr><td>CoolCell LX Hücre Dondurma Kabı</td><td>Corning</td><td>432003</td><td>Kriptleri ve organoidleri kriyoprezervasyon yapmak için kullanılır. </td></tr><tr><td>Kontes 3 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16842556</td><td></td></tr><tr><td>Lamelleri, 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>630-1845</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube ClearLine 1 mL</td><td>Clear line </td><td>390706</td><td>Kriptleri ve organoidleri kriyoprezervasyon yapmak için kullanılır. </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Stok çözeltisini üreticiye göre 5 mg / mL suda hazırlayın s tavsiyesi. Alikot (20 &mikro; L) ve -20 ° C'de saklayın; C </td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT) </td><td>Merck</td><td>10197777001</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi, piruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31966047</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimetil Sülfoksit)</td> <td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td>Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Epredia Superfrost Plus Yapışma mikroskobik slayt</td><td>VWR</td><td>631-9483 </td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>5 mL alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Steril Hücre Süzgeçleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Kript izolasyonu için kullanılır. </td></tr><tr><td>Sabit Eğimli 3D Platform Döndürücü </td><td>VWR</td><td> 97025-564 </td><td>İmmün boyama protokolünde inkübasyonlar için kullanılır. </td></tr><tr><td>Gibco PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010015</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Gibco TrypLE Express Enzim (1x), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>Enzim ayrışma reaktifi. Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG, Alexa fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>İkincil antikor. 4 ° C'de saklayın Çalışma seyreltmesi 1:1000. </td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>6010</td><td>Organoid kültür ortamı. -20 ° C'de saklayın Bazal ortamı ve organoid takviyesini oda sıcaklığında çözdürün ve karıştırın (1: 1). Karışımı 4 ° C'de saklayın; 1 haftaya kadar C. </td></tr><tr><td>PET membranlı ek, plaka, 24 kuyulu şeffaf Falcon,</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr>, <tr><td>Ters mikroskop</td>, <td>Nikon</td><td> Eclipse, TS2</td><td></td></tr>, <tr><td>Matrigel Basement Membran Matrisi, Corning</td><td></td><td>354234</td><td>Organoidlerin 3D kültürü için kullanılan tümörden türetilmiş hücre dışı matris. Matrigel oda sıcaklığında polimerize olur. Matrigel'i pipetlemek için soğutulmuş uçları kullanın. 500 ve mikro hazırlayın; L alikotlar ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr>DAPI <td>Vectashield</td><td>H1250</td> <td>ile floresan için montaj ortamı</td><td> 4 ° C'de saklayın. </td></tr><tr><td>Oklüdin, poliklonal antikor</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>71-1500</td>, <td>Birincil antikor. -20 ° C'de saklayın Çalışma seyreltmesi 1:200. </td></tr><tr><td>Paraformaldehit %32</td> <td>Elektron mikroskobu bilimi</td><td>15714</td><td>35 mL PBS'ye 5 mL %32 PFA ekleyerek kimyasal başlık altında %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın. 10 mL alikot edin ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Antibakteriyel. 5 mL alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Aktin boyama için Phalloidin TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Probu. 1 mg / mL stok çözeltisi. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td>Bakteri, mikoplazma ve mantarlar üzerinde etkili birincil hücreler için antimikrobiyal ajan. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>ROCK İnhibitörü (Y27632)</td> <td>ATCC</td><td>ACS-3030</td><td>Kök hücreleri korumak için kullanılır. Stok çözeltisini üreticinin tavsiyesine göre steril suda 10 mM'de hazırlayın ve alikotları (50 &mikro; L) -20 ° C'de.</td></tr><tr><td>Döner çalkalayıcı karışımı XL</td><td>Clear line </td><td>062646CL</td><td>Kript izolasyonu için kullanılır. </td></tr><tr><td>Stripette Serolojik Pipetler 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı </td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>8787</td><td>Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Tripan Mavi leke %0,4 </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Vakum sistemi Vacusip</td><td>Integra</td><td>159000</td><td>Organoid kuyuların ortamını çıkarmak için kullanılır. </td></tr></tbody></table>

kriyokorunmuş epitel kriptlerinden domuz yavrusu bağırsak 3d organoidlerinin kültürü ve hücre tek katmanlarının oluşturulması

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Bağırsak organoidleri, sindirim hastalığı modellemesi için bağırsak epitelini incelemek veya ilaçlar, besinler, metabolitler, patojenler ve mikrobiyota ile etkileşimleri araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bağırsak organoidlerini kültüre alma yöntemleri, hem çiftlik hayvanı hem de insanlar için, örneğin zoonotik hastalıkları incelemek için translasyonel bir model olarak büyük ilgi çeken bir tür olan domuzlar da dahil olmak üzere birçok tür için artık mevcuttur. Burada, dondurulmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsak 3D organoidlerini kültürlemek için kullanılan bir prosedürün derinlemesine bir tanımını veriyoruz. Protokol, domuz bağırsağından epitel kriptlerinin nasıl korunacağını ve sonraki prosedürlerin 3D bağırsak organoidlerinin kültürüne nasıl uygulanacağını açıklar. Bu yöntemin başlıca avantajları, (i) kriptlerin 3D organoidlerin kültüründen izolasyonunun zamansal ayrışması, (ii) birden fazla bağırsak segmentinden ve aynı anda birkaç hayvandan elde edilen büyük kriyokorunmuş kript stoklarının hazırlanması ve böylece (iii) canlı hayvanlardan taze dokuları örnekleme ihtiyacının azaltılmasıdır. Ayrıca, epitel hücrelerinin apikal tarafına erişime izin vermek için 3D organoidlerden türetilen hücre monokatmanlarını oluşturmak için bir protokolü detaylandırıyoruz, bu da besinler, mikroplar veya ilaçlarla etkileşimlerin yeridir. Genel olarak, burada açıklanan protokoller, veterinerlik ve biyomedikal araştırmalarda domuz bağırsak epitelini incelemek için yararlı bir kaynaktır.

Yukarıda tarif edilen protokolü takiben, epitel kriptleri domuz bağırsağından elde edilir ve sıvı azotta uzun süreli depolama için kriyokorunur (Şekil 1 ve Şekil 2A). Çözüldükten sonra, kript kök hücreleri ECM'de tohumlanır (Şekil 2B). Crypt yapısı genellikle ECM'deki crypt yapısının parçalanması nedeniyle bu adımdan sonra kaybolur. Organoidler 3-4 gün içinde gözlenebilir ve daha sonra hızla büyür ve tomurcuklanan yapılar geliştirir (Şekil 2B). Dondurulmuş kriptleri çözdükten sonra girişimlerin% &gt;80'inde organoidleri başarıyla elde ettik. Çözülmeden yaklaşık 10 gün sonra (organoidlerin büyüme hızına göre), kültürü genişletmek için bir organoid geçişi yapılır (Şekil 3). Organoidler ayrıldıktan sonra daha hızlı büyürler ve bazı kistik ve tomurcuklanan organoidlerin çoğunluğu ile çeşitli morfolojiler sunarlar. Kültürün optimal bakımı için, geçiş için kullanılan organoidler, olgun organoidlerde gözlendiği gibi, lümende siyah döküntü içermeyen (kırmızı oklarla gösterilen) net ve boş bir lümen ve iyi tanımlanmış kenarlar (yeşil oklarla gösterilen örnekler) sunmalıdır (Şekil 3). Siyah hücre kalıntılarının, geçişten sonraki 6. gün civarında birikmeye başladığını bulduk. Bu nedenle, organoidlerin 4-5. günde pas sonrası ayrılması veya dondurulması önerilir.
Organoidlerin olgunluk aşaması da hücre monokatmanlarının elde edilmesinde önemli bir noktadır. İleri olgunluğa sahip organoidler (lümende siyah hücre kalıntılarının varlığı ile gösterilir), tek katmanlı tohumlar için optimal değildir. Genellikle 2D kültür için hücre toplamak için geçişten 4 gün sonra 3D organoidleri ayırırız. ECM'nin 50 μL kubbesi başına 3.000 hücrede kültürlenmiş yaklaşık bir ila üç kuyucuk 3D organoid, 2,5 x 105 hücreli bir kültür ekinin tohumlanması için gereklidir. Hücreler 1 gün içinde bağlanır ve tamamen birleşen bir tek katman oluşturur (Şekil 4A), bu da yaklaşık 700 Ω ·cm2'lik yüksek TEER ile doğrulanır (Şekil 4B). Bununla birlikte, hücre kenarlarının, muhtemelen düşük bir farklılaşma seviyesi nedeniyle, bu erken zaman noktasında parlak alan mikroskobu ile görselleştirilmesi zordur. TEER 3 gün boyunca yüksek kalır (Şekil 4B).
Aktin boyaması, epitel hücrelerinin apikal tarafının 3D organoidlerde lümene doğru yönlendirildiğini gösterir (Şekil 5A). Kültür ekinde tohumlanan organoid hücreler, apikal tarafı üst bölmeye doğru yönlendirilmiş olarak birleşen tek bir epitel hücresi tabakası oluşturur (Şekil 4B, C). Oklüdin boyaması, 3D organoidlerde ve hücre monokatmanlarında epitel hücrelerinin apikal tarafında sıkı kavşakların varlığını ortaya koymaktadır (Şekil 5A-K).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Şekil 1: Organoidlerden türetilen 3D organoidleri ve hücre monokatmanlarını kültürlemek için kullanılan yöntemlerin şematik gösterimi. Epitel kriptleri domuz yavrusu bağırsağından izole edilir. Bu kriptler i) 3D organoidleri kültürlemek için hemen kullanılabilir veya ii) dondurulabilir ve sıvı azotta bir biyobankada saklanabilir. Kriyokorunmuş kriptler çözülebilir ve 3D organoidleri kültürlemek için kullanılabilir. 3D organoid kültür, ardışık bölme ile korunabilir veya dondurulabilir ve biyobankada saklanabilir. Hücrelerin apikal tarafına erişime izin vermek ve epitel bariyer fonksiyonunu incelemek için 3D organoid kültürden hücre monokatmanları elde edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Şekil 2: Kriyokorunmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsağı 3D organoidlerinin kültürü. (A) Yeni izole edilmiş jejunal kriptlerin temsili mikroskobik görüntüsü. (B) Jejunal kriptlerin çözülmesinden sonra elde edilen 3D organoidlerin temsili mikroskobik görüntüleri. Organoidler, 48 delikli bir plakada 25 μL'lik bir ECM kubbesinde kültürlendi. Şekil, tohumlamadan 4, 7, 8, 9 ve 10 gün sonra 3D organoidlerin görüntülerini göstermektedir. Ölçek çubuğu 500 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Şekil 3: İlk geçişten sonra kriyokorunmuş epitel kriptlerinden türetilen domuz bağırsağı 3D organoidlerinin morfolojisi. 4. günden 7. güne kadar ilk geçişten sonra kriyokorunmuş jejunum kriptlerinden türetilen organoidlerin gelişimini gösteren temsili mikroskobik görüntüler. Yeşil oklar, tek katmanların geçişi veya tohumlanması için uygun olan berrak organoidleri gösterir. Kırmızı oklar, tek katmanları bölmek veya tohumlamak için uygun olmayan olgun organoidleri gösterir; Bu nedenle, kuyular bu morfolojinin ortaya çıkmasından önce kullanılmalıdır. Ölçek çubuğu 500 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Şekil 4: Domuz bağırsağı 3D organoidlerinden türetilen hücre monokatmanlarının özellikleri . (A) Tek katmanlı morfolojinin 3 gün boyunca temsili mikroskobik görüntüleri. Jejunum organoid hücreleri 2.5 x 105 hücrede, 50 ng/mL'de kollajen IV ile kaplanmış0.33 cm2 hücre kültürü eklerine tohumlandı. Ölçek çubuğu, 3 gün boyunca organoid hücreli monokatmanların 500 μm. (B) Transepitelyal elektrik direncini (TEER) temsil eder. Bir çizgi ile bağlanan noktalar, farklı zamanlarda aynı kuyuya karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Şekil 5: 3D veya 2D olarak kültürlenmiş domuz jejunum organoidlerinin görüntülenmesi. (A) 3D organoidlerin bölünmeden 5 gün sonra ve (B,C) organoid hücreli monokatmanların tohumlamadan 3 gün sonra konfokal mikroskopi görüntülenmesi (B: XZ kesiti; C: XY bölümü). DNA (mavi) DAPI ile boyandı. Aktin (kırmızı) faloidin ile boyandı. Occludin (yeşil) poliklonal antikor ile boyandı. Beyaz oklar, sıkı kavşakta lokalize olan oklüdini gösterir. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, kriyokorunmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsak 3D organoidlerini kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, epitel hücrelerinin apikal tarafına erişime izin veren 3D organoidlerden türetilen hücre monokatmanları oluşturmak için bir yöntem de açıklıyoruz.

Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Protokolümüz, veterinerlik ve biyomedikal araştırmalar için domuz bağırsak epitelini incelemek için araçlar sağlar. Domuzlardan elde edilen bağırsak organoidleri, besin taşınmasını, bariyer fonksiyonunu ve konakçı-mikrop etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Domuz bağırsağının korunması sayesinde, epitel kriptleri, daha sonra 3D veya 2D monokatmanlarda organoidi kültürlemek için kullanılabilecek büyük bir kök hücre stoğu oluşturmaya izin verir.Bu protokol jejunum için detaylandırılmıştır, ancak duodenum, ileum ve kolon gibi diğer bağırsak segmentleri için de kullanılabilir. Başlamak için, 37 santigrat derecedeki bir su banyosunda 900 dondurulmuş kript içeren bir şişeyi hızla çözün. Kript çözeltisini 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. 25 mikrolitre ECM başına 150 kript nihai konsantrasyonu elde etmek için soğutulmuş bir uçla 150 mikrolitre hücre dışı matris veya ECM ekleyin. ECM'de homojen bir kript süspansiyonu elde etmek için 10 kez yukarı ve aşağı pipet yapın.Önceden ısıtılmış 48 delikli bir plakada kuyu başına 25 mikrolitrelik bir damla ile altı kuyucuğu tohumlayın. ECM'nin polimerizasyonu için 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında ortam kültürü kuyusu başına 250 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.Kültür ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Dondurulmuş kriptlerden elde edilen 3D organoidleri tohumlamadan 10 gün sonra geçmek için, kültür ortamını çıkarın ve 37 santigrat derecede 250 mikrolitre önceden ısıtılmış PBS ekleyin. İnkübasyondan sonra, PBS'yi, her bir kuyucukta 37 santigrat derecede 10 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş 250 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim ayrışma reaktifi ile değiştirin.ECM'deki organoidleri bir P-1000 pipetle kazıyarak ayırın ve beş kez pipetleyerek dikkatlice homojenize edin. 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırmadan önce 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte beş dakika boyunca inkübe edin. Ayrışmış hücreler içeren her bir kuyucuğa 500 mikrolitre DMEMc ekleyin ve üç mililitre soğuk DMEMc içeren 15 mililitrelik bir konik tüpte 12 kuyucuğa kadar çekin.Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti bir mililitre soğuk DMEMc'de yeniden askıya alın. Bir hücre sayacı ile tripan mavisinde bir ila iki seyreltme ile hücreleri sayın.Kubbe başına 3000 canlı hücreye sahip olmak için hücre çözeltisinin gerekli hacmini santrifüjleyin. Pelet, buz üzerindeki 3000 canlı hücre başına 17 mikrolitre soğuk DMEMc ile tekrar askıya alın. Ses seviyesini gerekli kuyu sayısına ayarlayın.3000 canlı hücre başına yavaşça 33 mikrolitre soğuk ECM ekleyin. Ses seviyesini gerekli kuyucuk sayısına ayarlayın ve kabarcık yapmadan homojenize edin. Ardından, önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakada kuyucuk başına 50 mikrolitre ECM hücre süspansiyonu bulunan kuyucuklara bakın ve ECM'nin polimerizasyonu için 30 dakika boyunca inkübe edin.Kuyu başına 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra her iki ila üç günde bir kültür ortamını inkübe edin ve değiştirin. Kültür ekini kaplamak için, soğuk PBS'de mililitre başına 50 mikrogramda seyreltilmiş kollajen IV içeren kaplama çözeltisini hazırlayın.Her hücre kültürü ekine 150 mikrolitre seyreltilmiş kaplama çözeltisi ekleyin ve gece boyunca veya üç saat boyunca inkübe edin. Bölmeden beş gün sonra, organoidleri bir P-1000 pipetle kazıyarak ECM ile ayırın. Kültür ortamında pipetleme ile dikkatlice homojenize edilir ve buz üzerinde beş mililitre soğuk DMEMc içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarılır.Toplanan organoidleri 500 x g'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş bir mililitre önceden ısıtılmış enzim ayrışma reaktifinde yeniden askıya alın. Organoidlerin ayrışmasını başlatmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipet.Enzimatik sindirim için 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika inkübe edin. 10 kez pipetleme yaparak organoidleri mekanik olarak bozun ve dört mililitre buz gibi soğuk DMEMc ekleyin. Organoid hücre peletini bir mililitre DMEMc'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve atın.Bir hücre sayacı ile tripan mavisindeki hücreleri sayın ve kültür eki başına 2,5 kez 10 ila beşinci hücreyi tohumlamak için gerekli hacmi hesaplayın. Kültür eki başına beşinci hücrelerin 2,5 katı 10'a karşılık gelen hücre süspansiyonunun gerekli hacmini santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, kaplama çözeltisini kültür uçlarından dikkatlice aspire edin ve kapaksız kaputun altında beş dakika kurumasını bekleyin.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peleti 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş gerekli hacimde 2D ortamda yeniden askıya alın. Tohum 200 mikrolitre hücre süspansiyonu kaplanmış geçirgen membran üzerine serilir. Alt bölmeye 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 500 mikrolitre 2D ortam ekleyin ve inkübe edin.Membran üzerinde yüksek bir hücre yoğunluğu gözlenmelidir. Tohumlamadan bir gün sonra, epik ve bazal ortamları ROCK inhibitörü olmadan taze 2D medya ile değiştirin. Medyayı her gün değiştirin.Tek katman, tohumlamadan bir gün sonra birleşir ve deneyleri için kullanılabilir. Bu çalışmada, domuz bağırsağından epitel kriptleri elde edilmiş ve sıvı azotta uzun süreli depolama için kriyokorunmuştur. Çözüldükten sonra, kript kök hücreleri ECM'de tohumlandı.Organoidler üç ila dört gün içinde gözlendi ve hızla büyüdü ve tomurcuklanan yapılar geliştirdi. Çözülmeden yaklaşık 10 gün sonra, kültürü genişletmek için organoidlerin geçişi yapıldı. Kültürün optimum bakımı için, paketleme için kullanılan organoidler, olgun organoidlerde gözlendiği gibi lümende siyah döküntü içermeyen berrak ve boş bir lümen ve iyi tanımlanmış kenarlar sunmalıdır.Hücreler bir gün içinde bağlanır ve yaklaşık 700 kubbe santimetrekarelik yüksek transepitelyal elektrik direnci veya TEER ile doğrulanan tamamen birleşen bir tek katman oluşturur. TEER üç gün boyunca yüksek kalır. Aktin boyaması, epitel hücrelerinin apikal tarafının 3D organoidlerde lümene doğru yönlendirildiğini gösterir.Kültür eklerinde tohumlanan organoid hücreler, apikal tarafı üst bölmeye doğru yönlendirilmiş olan tek bir epitel hücresi tabakası oluşturur. Oklüdin boyaması, 3D organoidlerde ve hücre monokatmanlarında epitel hücrelerinin apikal tarafında sıkı kavşakların varlığını ortaya koymaktadır. Hücre monokatmanlarını tohumlamak için kullanılan organoidin, ölü hücrelerin birikmesine karşılık gelen siyah döküntü olmadan boş bir lümen ile net görünmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.Domuz bağırsak organoidinden elde edilen monokatmanlar, metabolitlerin veya mikropların epitel bariyer fonksiyonu üzerindeki etkilerini fonksiyonel tahliller, görüntüleme ve gen ekspresyon analizi kullanarak test etmek için kullanılabilir.

culture-piglet-intestinal-3d-organoids-from-cryopreserved-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

Burada, bir protokol kültür insan enteroid veya ana bilgisayar microbiota epitel etkileşimleri hücresel ve biyokimyasal düzeyde çalışmaya sağlam bariyer fonksiyonu var colonoid monolayers mevcut.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Bu protokolde, murine primer epitel kolon monolayerlerinin doğrudan bağırsak mahzenlerinden nasıl üretılacağını açıklıyoruz. Geçirgen filtreler üzerinde birleştirici monolayerler, çizik yarası iyileşmesi ve biyokimyasal çalışmalar için birikme monolayerleri ve immünofluoresans analizi için seyrek ve birleştirici monolayerler üretmek için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

Burada bağırsak apikal spesifik etkileşimlerin modellenmesine izin veren iki protokol sunuyoruz. Organoid türevli bağırsak monolayerleri ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürleri, hem aydınlık hem de bazolateral taraflardan erişilebilen iyi ayırt edilmiş epitellerin üretilmesini kolaylaştırırken, polarite ters bağırsak organoidleri apikal yanlarını ortaya çıkarır ve yüksek verim testlerine uygundur.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

Enteroidler, doku fizyolojisi ve patofizyolojisi, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp çalışmaları için yeni bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, ilgili doku hücresi tipleriyle ko-kültüre izin veren bir sığır birincil hücre 2D enteroid türevi kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu model, gastrointestinal araştırma modellemesi için translasyonel bir avantaj sunar.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Keşfedin, kriyokorunmuş domuz bağırsak kriptlerinden 3D organoid ve 2D tek katman hücre kültürü oluşturma yöntemini. Bu protokol, bağırsak biyolojisi ve veteriner sağlık araştırmaları için besin taşınımı ve bariyer fonksiyonu çalışmalarına olanak tanır.

Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması

Daha fazla video keşfet