Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Birkaç yöntem, hematopoetik progenitörlerin işlevselliğini hızlı bir şekilde değerlendirmeye izin verir. Bu protokol, ilk hücre bölünmelerinin hücre kaderi ve bağlılığı üzerindeki etkisini ölçer. Bu protokol, karmaşık ve kapsamlı manipülasyon gerektirmeden tek hücre düzeyinde ve yüksek verimde aynı anda bölünme ve farklılaşmayı ölçmeye izin verir.

Bu yöntem, kültürde korunabilen herhangi bir hematopoetik popülasyon için uygundur. Böylece kanser biyolojisi, immünoloji ve gelişim biyolojisine kolayca uygulanabilir. Başlamak için, CD34 + fraksiyonunun 250 mikrolitresini, dört adet 15 mililitrelik polipropilen tüpte eşit olarak aliquot.

Tüpleri metin makalesinde açıklandığı gibi etiketleyin. CD34 fraksiyonunun 250 mikrolitresini başka bir dört adet 15 mililitrelik polipropilen tüpe ayırın ve tüpleri etiketleyin. CFSE yüksek ve CSFE düşük çözümlerini metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın.

CF ve CV tüpüne 250 mikrolitre CFSE yüksek çözeltisi, VC tüpüne 250 mikrolitre CFSE düşük çözeltisi ve VI tüpüne fetal sığır serumu veya FBS olmadan 250 mikrolitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM'i ekleyin. Hücre boyasında hücre süspansiyonunun verimli bir karışımını sağlamak için, tüpü 90 derece eğin ve CFSE çözeltilerini tüp duvarına yatırın. Daha sonra, tüpü dikey olarak tutun ve CFSE çözeltilerinin askıya alınmış hücrelerle hızlı bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için üç veya dört kez karıştırın.

Süspansiyonu sekiz dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra,% 10 FBS içeren beş mililitre DMEM ekleyin ve tüpleri beş dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Tüpleri beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.

Peletleri rahatsız etmeden süpernatantı aspirasyon yoluyla çıkarın ve peleti beş mililitre PBS, ETDA ile yıkayın. Tüpleri tekrar döndürün ve peletleri 40 mikrolitre PBS, ETDA'da yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. CD34 + hücrelerini boyamak için, tek bir 0.5 mililitrelik tüpe ana bir antikor karışımı hazırlayın.

Dört CD34 + koşulunun her birine antikor ana karışımından yedi mikrolitre ekleyin. CD34 + hücrelerindeki boncuklar için her biri yaklaşık 500 mikrolitre ve CD34 tüpleri için bir mililitre kullanarak hücreleri boyama tamponunda yeniden askıya alın. Hücre sıralama için, nokta grafiği diyagramları oluşturarak geçit stratejisini ayarlayın.

İlk olarak, FSCA'ya karşı SSCA nokta grafiğindeki hücreleri görselleştirin ve düşük yan saçılımlı popülasyonu seçmek için Poligon geçit aracına çift tıklayın. Yeni oluşturulan bu kapıyı Hücreler olarak etiketleyin. Aşağıdaki nokta grafiğinde, FSCA'ya karşı FSCH, grafiğe sağ tıklayın ve üzerine tıklayarak açılır menüden kapı Hücreleri'ni seçin.

İki eksen arasındaki köşegen üzerinde sıkı bir popülasyon seçmek için aynı geçit aracını kullanın. Bu kapıyı Tek Hücreler olarak etiketleyin. Üçüncü nokta grafiğinde, APC'ye karşı FSH-H, popülasyon Tek Hücrelerini görüntüler ve APC soyunun ekspresyonu için negatif hücreleri geçitler.

Bu yeni oluşturulan popülasyonu Soy Negatifi olarak etiketleyin. Dördüncü grafikte, CFSE'ye karşı CTV, popülasyon Soyu Negatif'i görüntüleyin ve her boya kombinasyonu için bir tane olmak üzere dört ayrı kapı oluşturun. Kapı VI burada örnek olarak gösterilmiştir.

İlgilenilen öncülleri tanımlamak için beşinci ve altıncı grafikleri kullanın. Beşinci arsada CD34 + CD38 popülasyonunu ve CD34 + CD38 + 'yı cömertçe açın. Ardından, altıncı grafikte CD34 + CD38 popülasyonunu seçin ve LMPP, HSC ve MPP için üç kapı çizin.

CD34 + kesirlerini çalıştırın, tek hücre kapısına en az 5.000 olay kaydedin. Her boya kombinasyonu için kapıyı ayarlayın ve homojen bir popülasyon seçmek için sıkı bir kapı ayarlayın. Deneme Sıralama düzenini kullanarak Plaka Sıralama Şablonunu hazırlayın.

CD34 adı verilen kuyular, CF, CV, VC, VI kapısında sıralanmış 5.000 ila 10.000 hücre içerir. Toplu kuyular, CD34 + CD38 kapısında sıralanmış 500 hücre içerir - Tek hücreli kuyular, kuyu başına hücre bölünmesi boya kombinasyonu başına yalnızca bir olay içerir, bu nedenle toplamda kuyu başına dört olay içerir. Ardından, CD34-CF'yi Verim Saflığı modunda sıralamaya başlayın.

Al düğmesine ve ardından Sırala düğmesine tıklayın. Al'ı tıklayın, ardından Sırala düğmesini tıklayın ve saflık derecesi olarak 0160'ı işaretlediğinizden emin olun. Son olarak, ilgilenilen hücreleri, kuyu başına bir hücre, tek hücre saflığında sıralayın ve Dizin Sıralama seçeneğini işaretlediğinizden emin olun.

Plakayı beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin ve plakayı bir kağıt havlu üzerinde kaputun altında hızla ters çevirerek süpernatantı çıkarın. A1'den A4'e kadar olan kuyucuklara sekiz mikrolitre ayakta duran tampon ekleyin, ardından karışımın sekiz mikrolitresini diğer kuyucuklara ekleyin. Çok kanallı pipet kullanarak kuyucuk başına 100 mikrolitre boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.

Hücreleri 85 mikrolitre boyama tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve çıkarın. Akış sitometresindeki analizi, özel şablonu kullanarak ve Özel'e tıklayarak Edinme modunda başlatın. Listeden ilgilenilen floroforları seçtikten sonra, en az bir hücre içeren kuyucuk sayısı için düzeltilmiş plaka şablonunu izleyerek plaka kurulumunu ayarlayın.

Karıştırma seçeneğini işaretleyin ve edinme hacmi sınırı olarak 100 mikrolitre seçin. Ardından, edinme oranını saniyede bir mikrolitreden daha üstün olmayan bir şekilde ayarlayın, çünkü daha düşük hız, kuyu başına analiz edilen toplam hacmi iyileştirir. Temsili geçiş için, farklı toplu kuyuları tek bir dosyada birleştirin.

Popülasyonları Birleştir seçeneğine tıkladıktan sonra, Parametreler menüsünden Tüm telafi edilmemiş parametreler'i seçin ve ardından Birleştir'e tıklayın. Birleştirilmiş dosyayı çalışma alanına yükleyin, ardından sürükleyip bırakarak ücret matrisini uygulayın. CV ve VC içeren hücre etiketlerinin dönüştürülmüş bir değere ihtiyacı vardır.

Dönüştürülen değeri almak için Araçlar ve Türev Parametresi'ne tıklayın. Belirtilen formülü formül kutusuna yapıştırın. Geçidi, histogram grafiği olarak her renge ayrı ayrı uygulayın.

CF ve VI için, sırasıyla CFSE-A ve CTV-A'yı X ekseninde ayarlayın. CV ve VC için, yeni türetilmiş parametreyi X ekseninde ayarlayın, ardından her tepe noktasına karşılık gelen kapıları ayarlayın. Kapıyı her bir hücreye iyi uygulayın.

Türetilmiş parametreyi analiz edilen her kuyuya eklediğinizden emin olun. Belirli bir tepe noktasına yanlış atanmış olayları algılamak için her bir kuyu için her renk kapısını el ile doğrulayın. Hücre kültüründen sonra akış sitometrisi analizi, hücresel fenotipleme ile birlikte her bir hücrenin akrabalığını kurmak için hassas geçit gerektirir.

Tepe tanımı ve ataması, akış sitometrisi analizinin çok önemli yönleridir. Histogramlar, iki benzer yoğunluk zirvesinden biri ve biri iki farklı yoğunluk zirvesine sahip olmak üzere birden fazla zirveye yayılmış iki aile örneği gösterir. HSC'ler ve MPP'ler için 72 saat sonra gerçekleştirilen iki ayrı deney için farklı veri gösterimi türleri ve istatistiksel testler burada gösterilmiştir.

HSC farklılaşması koşulu için ısı haritası, hem hücre kaderlerinde hem de hücre bölünmelerinde farklı hücre ailelerini temsil eder. HSC'lerin ve MPP'lerden türetilmiş hücre ailelerinin kaderini karşılaştıran histogram burada gösterilmiştir. Her iki hücre tipi için, koşul GT ve koşul farklılaşması arasındaki karşılaştırma, MPP'ler için yapılan istatistiksel testlerle birlikte görüntülenir.

Nesil başına hücre ailelerinin yüzdesini ve ilk bölünme için kaderdeki simetri veya asimetri tipini karşılaştıran histogramlar burada gösterilmiştir. MPP'ler için kaderlerin nesil başına dağılımı ve durum farklılaşması burada gösterilmiştir. Bu prosedür, uygun geçit stratejisini belirlemek için hücreleri toplu olarak izole etmeyi gerektirir.

Bu nedenle boyamaya en az 10.000 hücre ile başlamak daha iyidir. Bu yöntemi, canlı hücrelerin hayal ettiği gibi sürekli ölçümlerle birleştirmek çok güçlü olabilir, çünkü ikisi birlikte hücre dinamiğinin erken progenitörlerinin ayrıntılı bir tanımını sağlayabilir. Bu yaklaşım ilk olarak Hopkins Labs tarafından T hücre biyolojisi için geliştirilmiştir.

Kan kök hücreleri için uyarlanmış olan bu versiyon şimdi kanser ve kök hücre biyolojisine genişlemektedir.