Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi
17 Şubat 2023
Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.
Bu protokol, bilinen bir RNA dizisinin protein bağlanma ortaklarının, biyotinile RNA oligonükleotidleri kullanılarak hücresel ekstrakttan aşağı çekilerek tanımlanmasını sağlar. Proteinleri RNA'dan ayırmak için deterjan veya yüksek sıcaklık gerektiren yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokoller bunun yerine potansiyel protein komplekslerini korumaya izin veren çok hafif koşullar kullanır. Prosedürü gösteren, benim hükmüm altında doktora öğrencisi olan Jakob Rupert olacak.
Ortamı HEK 293T hücre plakasının kuyucuklarından çıkararak toplam protein hasadına başlayın ve altı kuyucuk plakasının kuyucuklarını bir mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi atın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre lizis tamponu eklemeden önce plakaları buza aktarın. İki kuyucuktan türetilen hücre ekstraktını aynı 1.5 mililitrelik tüpe aktarmadan önce bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırın ve kırın.
Buz ve santrifüjleme üzerinde 30 dakikalık inkübasyondan sonra, süpernatantı önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın. Daha sonra, 1.5 miligram proteine karşılık gelen protein ekstraktının hacmini hesaplayın. Daha sonra tüm numuneleri bir lizis tamponu kullanarak 600 mikrolitrelik son bir hacme getirin.
Numuneleri kullanana kadar buz üzerinde tutun. Boncukları hazırlamak için, tüpü hareket ettirerek depolama tamponunda karıştırın. Numune başına 100 mikrolitre bulamaç ortamını hesapladıktan sonra, bulamacın hesaplanan hacmini manyetik bir rafa yerleştirin.
Boncukları yıkamak için, depolama çözeltisini çıkarın ve bir mililitre lizis tamponu ekleyerek ve manuel olarak ters çevirerek boncukları yıkayın. Ardından manyetik rafı kullanarak tamponu çıkarın ve yıkama adımını tekrarlayın. Boncuklara, bulamaç ortamının başlangıç hacmine eşit bir miktarda lizis tamponu ekleyin ve ortamı numuneler olarak eşit olarak 1,5 mililitrelik tüplere dağıtmadan önce tüpü hafifçe vurarak karıştırın.
Boncuk blokajı için, manyetik rafı kullanarak tamponu çıkarın ve lizis tamponunda hazırlanan mililitre maya TRNA çözeltisi başına 600 mikrolitre 0.25 miligram ekleyin. Dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. 600 mikrolitre lizis tamponu eklemeden önce manyetik rafı kullanarak TRNA çözeltisini çıkarın ve manuel olarak karıştırarak yıkayın.
Yıkama adımını tekrarlayın ve tamponu atın. Bulamaç ortamının ilk 100 mikrolitresini içeren her tüp için, 600 mikrolitre lizis tamponunda 200 mikrogram RNA oligonükleotid hazırlayın. Oligo'yu boncuklara ekleyin ve dönerken oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Çözeltiyi boncuklardan çıkarın ve tüpleri oda sıcaklığında her biri beş dakika döndürerek 600 mikrolitre lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Arabelleği atın. Boncuklara protein bağlanması için, 600 mikrolitre protein çözeltisinden% 5 veya 30 mikrolitre hacim ayırın ve daha fazla analiz için girdi veya IN olarak saklayın.
Kalan protein karışımını her bir yüklü boncuk tüpüne ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede yavaş dönüşlerle inkübe edin. Manyetik rafı kullanarak bağlanmamış protein fraksiyonunu boncuklardan çıkarın. Hacminin% 5 veya 30 mikrolitresinden tasarruf edin ve içinden geçtiği veya FT olarak etiketleyin. Boncuklara bir mililitre yıkama tamponu 1 ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika döndürün.
Tamponu atın ve bu yıkamayı bir kez tekrarlayın. Boncuklara bir mililitre yıkama tamponu 2 ekleyin. Ve beş dakika boyunca bir rotatör üzerinde dört santigrat derecede inkübe ettikten sonra, süpernatanı atın.
Belirli bağlayıcıları salgılamak için, boncuklara 100 mikrolitre elüsyon tamponu 1 ekleyin. Hafifçe vurarak manuel olarak karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Tüpleri bir termal karıştırıcıya yerleştirin ve 95 santigrat derecede beş dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın.
Daha sonra tüpü manyetik rafa yerleştirin ve salınan fraksiyonu temiz bir tüpe toplayın. İşiniz bittiğinde, elüatın geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için boncukları bir tezgah santrifüjü ile hızlı bir şekilde döndürün. Ve daha ileri analizler için toplam elüat veya EL hacminin% 5 veya beş mikrolitresinden tasarruf edin.
Salınan proteinler kütle spektrometrisi ile tanımlandı. Bir volkan grafiğinde önemli ölçüde zenginleştirilmiş proteinlerin çizilmesi, toplam protein içeriğinin ve RNA'dan salınan zenginleştirilmiş proteinlerin RNA'dan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur, bu da RNA'nın daha fazla sayıda spesifik etkileşim kurabileceğini düşündürmektedir. Tahmin edilen ve elde edilen sonuçlar arasındaki anlaşmanın örnekleri olarak, artı RNA ve eksi RNA'nın insan proteomundan proteinlerle etkileşim puanları, HNRNPH3'ün artı RNA'yı seçici olarak ve PCBP2'nin spesifik olarak RNA ile etkileşime gireceği tahmin edildiğini göstermiştir.
Ek olarak, RBM41 proteininin her iki RNA oligonükleotidi için de karışık olduğu tahmin edildi. Protein aşağı çekme testi örneklerinin kütle spektroskopisi analizi, RNA'da HNRNPH3 ve eksi RNA'da PCBP2'nin varlığını doğruladı. RBM41'in her ikisiyle de etkileşime girdiği bulundu.
Western blot, sonuçlarda ve protokol optimizasyon adımlarında TDP-43'ün varlığını tespit etmek için kullanıldı. RNA'da, TDP-43, giriş örneğinde ve elüatta gözlendi ve başlangıçtan itibaren varlığını gösterdi. TDP-43, yıkama adımları sırasında RNA tarafından tutuldu ve sonunda yüksek bir tuz tamponu ile salındı.
Protein RNA etkileşimlerini haritalayarak, bu yöntem birçok fizyolojik yolun arkasındaki makromoleküler ağları ortaya çıkarabilir. Örneğin, transkripsiyonel düzenleme veya kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere patolojik mekanizmalar.
Genel Bakış
Bu çalışma, kütle spektrometrisini kullanarak spesifik RNA dizilerinin protein etkileşimcilerini tanımlamak ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunar. Yöntem, ekstraksiyon işlemi sırasında hafif koşullar kullanarak protein komplekslerini korur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
- Sinirbilim
Arka Plan
- RNA-protein etkileşimlerini anlamak, hücresel mekanizmaları açıklamak için çok önemlidir.
- Geleneksel yöntemler genellikle protein komplekslerini bozar.
- Bu çalışma, RNA-bağlayıcı proteinlerin tanımlanmasını iyileştirmeyi amaçlamaktadır.
- Kütle spektrometrisi, protein etkileşimlerini analiz etmek için güçlü bir araç olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- RNA dizilerinin protein ortaklarını tanımlamak için bir yöntem geliştirmek.
- Kütle spektrometrisi kullanarak etkileşimleri doğrulamak.
- Ekstraksiyon işlemi sırasında protein komplekslerini korumak.
Kullanılan Yöntemler
- HEK 293T hücrelerinden toplam protein hasat etmek.
- Pull-down tahlilleri için biyotinle etiketlenmiş RNA oligonükleotidleri kullanmak.
- Protein bütünlüğünü korumak için hafif lizis koşullarını kullanmak.
- Elüte edilen proteinleri kütle spektrometrisi ile analiz etmek.
Ana Sonuçlar
- HNRNPH3 ile artı RNA gibi spesifik RNA-protein etkileşimlerini tanımladı.
- RNA örneklerinde TDP-43'ün varlığını doğruladı.
- RNA'nın daha yüksek sayıda spesifik etkileşim kurabileceğini gösterdi.
- Sonuçları Western blot analizi ile doğruladı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, RNA-protein etkileşim ağlarını etkili bir şekilde ortaya çıkarır.
- Çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçleri incelemek için uygulanabilir.
- Potansiyel uygulamalar arasında transkripsiyonel düzenleme ve nörodejenerasyonu anlamak yer alır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative pull-down analysis using biotinylated RNA enables precise mapping of RNA-protein interactions under near-physiological conditions, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach increases predictive confidence in identifying both canonical and non-canonical RNA-binding proteins, informing portfolio triage and advancing disease-relevant pathway interrogation. The method's compatibility with mass spectrometry and western blotting ensures robust, reproducible data for enterprise-scale R&D decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of RNA-binding proteins for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific from promiscuous protein-RNA interactions.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of disease-relevant pathways and regulatory networks.
- Provides quantitative enrichment data to inform predictive confidence and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated protein-RNA interaction systems for downstream screening workflows.
- Ensures assay reproducibility and standardization through quantitative mass spectrometry outputs.
- Prepares scalable platforms for reliable compound evaluation targeting RNA-protein complexes.
- Enables robust negative controls and specificity assessment using sequence-matched controls.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by mapping interactions implicated in neurodegeneration and cancer.
- Supports translational biomarker discovery through identification of unique RNA-protein partners.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation by preserving native complexes.
- Reduces risk of late-stage attrition by clarifying molecular mechanisms early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a foundation for downstream screening and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-protein interactions.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers mass spectrometry and western blot data for comparative analysis of binding specificity and enrichment.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease models by identifying interactions relevant to neurodegeneration and cancer.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow adaptable to diverse RNA sequences and protein extracts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying target engagement and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biochemistry, RNA handling, and mass spectrometry analysis.
- Needs access to high-quality protein extracts, biotinylated RNA synthesis, and analytical instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible quantitative outputs.
- Adaptable to various model systems but may require optimization for different cell types or RNA sequences.
- Potential limitations include transient or low-affinity interactions that may require further validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Total Protein Harvest and Protein Concentration Determination
1:48
Bead Preparation
3:12
Bead Loading and Protein Binding on Beads
4:13
Washing of Nonspecific Binders
4:53
Elution of Specific Binders
5:39
Results: Quantification and Validation of Protein Interactors of Specific RNA Sequences
7:24
Conclusion
