Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Bu protokol, bilinen bir RNA dizisinin protein bağlanma ortaklarının, biyotinile RNA oligonükleotidleri kullanılarak hücresel ekstrakttan aşağı çekilerek tanımlanmasını sağlar. Proteinleri RNA'dan ayırmak için deterjan veya yüksek sıcaklık gerektiren yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokoller bunun yerine potansiyel protein komplekslerini korumaya izin veren çok hafif koşullar kullanır. Prosedürü gösteren, benim hükmüm altında doktora öğrencisi olan Jakob Rupert olacak.

Ortamı HEK 293T hücre plakasının kuyucuklarından çıkararak toplam protein hasadına başlayın ve altı kuyucuk plakasının kuyucuklarını bir mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi atın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre lizis tamponu eklemeden önce plakaları buza aktarın. İki kuyucuktan türetilen hücre ekstraktını aynı 1.5 mililitrelik tüpe aktarmadan önce bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırın ve kırın.

Buz ve santrifüjleme üzerinde 30 dakikalık inkübasyondan sonra, süpernatantı önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın. Daha sonra, 1.5 miligram proteine karşılık gelen protein ekstraktının hacmini hesaplayın. Daha sonra tüm numuneleri bir lizis tamponu kullanarak 600 mikrolitrelik son bir hacme getirin.

Numuneleri kullanana kadar buz üzerinde tutun. Boncukları hazırlamak için, tüpü hareket ettirerek depolama tamponunda karıştırın. Numune başına 100 mikrolitre bulamaç ortamını hesapladıktan sonra, bulamacın hesaplanan hacmini manyetik bir rafa yerleştirin.

Boncukları yıkamak için, depolama çözeltisini çıkarın ve bir mililitre lizis tamponu ekleyerek ve manuel olarak ters çevirerek boncukları yıkayın. Ardından manyetik rafı kullanarak tamponu çıkarın ve yıkama adımını tekrarlayın. Boncuklara, bulamaç ortamının başlangıç hacmine eşit bir miktarda lizis tamponu ekleyin ve ortamı numuneler olarak eşit olarak 1,5 mililitrelik tüplere dağıtmadan önce tüpü hafifçe vurarak karıştırın.

Boncuk blokajı için, manyetik rafı kullanarak tamponu çıkarın ve lizis tamponunda hazırlanan mililitre maya TRNA çözeltisi başına 600 mikrolitre 0.25 miligram ekleyin. Dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. 600 mikrolitre lizis tamponu eklemeden önce manyetik rafı kullanarak TRNA çözeltisini çıkarın ve manuel olarak karıştırarak yıkayın.

Yıkama adımını tekrarlayın ve tamponu atın. Bulamaç ortamının ilk 100 mikrolitresini içeren her tüp için, 600 mikrolitre lizis tamponunda 200 mikrogram RNA oligonükleotid hazırlayın. Oligo'yu boncuklara ekleyin ve dönerken oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Çözeltiyi boncuklardan çıkarın ve tüpleri oda sıcaklığında her biri beş dakika döndürerek 600 mikrolitre lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Arabelleği atın. Boncuklara protein bağlanması için, 600 mikrolitre protein çözeltisinden% 5 veya 30 mikrolitre hacim ayırın ve daha fazla analiz için girdi veya IN olarak saklayın.

Kalan protein karışımını her bir yüklü boncuk tüpüne ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede yavaş dönüşlerle inkübe edin. Manyetik rafı kullanarak bağlanmamış protein fraksiyonunu boncuklardan çıkarın. Hacminin% 5 veya 30 mikrolitresinden tasarruf edin ve içinden geçtiği veya FT olarak etiketleyin. Boncuklara bir mililitre yıkama tamponu 1 ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika döndürün.

Tamponu atın ve bu yıkamayı bir kez tekrarlayın. Boncuklara bir mililitre yıkama tamponu 2 ekleyin. Ve beş dakika boyunca bir rotatör üzerinde dört santigrat derecede inkübe ettikten sonra, süpernatanı atın.

Belirli bağlayıcıları salgılamak için, boncuklara 100 mikrolitre elüsyon tamponu 1 ekleyin. Hafifçe vurarak manuel olarak karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Tüpleri bir termal karıştırıcıya yerleştirin ve 95 santigrat derecede beş dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın.

Daha sonra tüpü manyetik rafa yerleştirin ve salınan fraksiyonu temiz bir tüpe toplayın. İşiniz bittiğinde, elüatın geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için boncukları bir tezgah santrifüjü ile hızlı bir şekilde döndürün. Ve daha ileri analizler için toplam elüat veya EL hacminin% 5 veya beş mikrolitresinden tasarruf edin.

Salınan proteinler kütle spektrometrisi ile tanımlandı. Bir volkan grafiğinde önemli ölçüde zenginleştirilmiş proteinlerin çizilmesi, toplam protein içeriğinin ve RNA'dan salınan zenginleştirilmiş proteinlerin RNA'dan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur, bu da RNA'nın daha fazla sayıda spesifik etkileşim kurabileceğini düşündürmektedir. Tahmin edilen ve elde edilen sonuçlar arasındaki anlaşmanın örnekleri olarak, artı RNA ve eksi RNA'nın insan proteomundan proteinlerle etkileşim puanları, HNRNPH3'ün artı RNA'yı seçici olarak ve PCBP2'nin spesifik olarak RNA ile etkileşime gireceği tahmin edildiğini göstermiştir.

Ek olarak, RBM41 proteininin her iki RNA oligonükleotidi için de karışık olduğu tahmin edildi. Protein aşağı çekme testi örneklerinin kütle spektroskopisi analizi, RNA'da HNRNPH3 ve eksi RNA'da PCBP2'nin varlığını doğruladı. RBM41'in her ikisiyle de etkileşime girdiği bulundu.

Western blot, sonuçlarda ve protokol optimizasyon adımlarında TDP-43'ün varlığını tespit etmek için kullanıldı. RNA'da, TDP-43, giriş örneğinde ve elüatta gözlendi ve başlangıçtan itibaren varlığını gösterdi. TDP-43, yıkama adımları sırasında RNA tarafından tutuldu ve sonunda yüksek bir tuz tamponu ile salındı.

Protein RNA etkileşimlerini haritalayarak, bu yöntem birçok fizyolojik yolun arkasındaki makromoleküler ağları ortaya çıkarabilir. Örneğin, transkripsiyonel düzenleme veya kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere patolojik mekanizmalar.