Name: Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Keşfedin, ışık, transmisyon elektron ve konfokal mikroskopi kullanarak fare modellerinde retinal pigmentli epitel patolojilerini değerlendirme ve ölçme yöntemini. Bu protokol, istatistiksel karşılaştırmalar için niceliksel değerlendirmeler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, dokularımızı ışık mikroskobu için hazırladıkları için Satoshi Kinoshita ve Wisconsin Üniversitesi (UW) Patolojide Translasyonel Araştırma Girişimleri laboratuvarına (TRIP) teşekkür etmek ister. Bu çekirdek, UW Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü, Wisconsin Üniversitesi Carbone Kanser Merkezi (P30 CA014520) ve Direktör-NIH Ofisi (S10OD023526) tarafından desteklenmektedir. Konfokal mikroskopi, UW Biyokimya Vakfı Bölümü'nün desteğiyle kurulan UW Biyokimya Optik Çekirdeği'nde gerçekleştirildi. Bu çalışma aynı zamanda Ulusal Göz Enstitüsü'nden (R01EY022086'dan A. Ikeda'ya; R01EY031748'den C. Bowes Rickman'a; P30EY016665 UW Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümüne; P30EY005722 Duke Göz Merkezi'ne; NIH T32EY027721 - M. Landowski; F32EY032766 - M. Landowski), Timothy William Alabalık Başkanlığı (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Ödülü (C. Bowes Rickman); ve Körlüğü Önleme Araştırması'ndan (Duke Göz Merkezi) sınırsız bir hibe.

<ol><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).</li>
<li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+age-related+macular+degeneration+%28AMD%29%3A+relationships+between+the+photoreceptor%2Fretinal+pigment+epithelium%2FBruch%27s+membrane%2Fchoriocapillaris+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progess+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).</li>
<li>Bharti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+to+study+retinal+pigment+epithelium-related+pathogenesis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).</li>
<li>Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+models+and+therapies+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Cellular models and therapies for age-related macular degeneration.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).</li>
<li>Landowski, M., Bowes Rickman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lipid+metabolism+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration%3A+Insights+from+preclinical+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).</li>
<li>Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models of age related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).</li>
<li>Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+retinal+diseases+and+their+applicability+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperreflective+foci%2C+optical+coherence+tomography+progression+indicators+in+age-related+macular+degeneration%2C+include+transdifferentiated+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34(2021).</li>
<li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+complement+factor+H+prevents+age-related+macular+degeneration-like+retina+damage+and+kidney+abnormalities+in+aged+Cfh+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice.</a> The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).</li>
<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+project+MACULA+retinal+pigment+epithelium+grading+system+for+histology+and+optical+coherence+tomography+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).</li>
<li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-amyloid+therapy+protects+against+retinal+pigmented+epithelium+damage+and+vision+loss+in+a+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histologic+findings+in+age-related+macular+degeneration+with+RPE+flatmount+images%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images.</a> Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+A+comparison+to+unaffected+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).</li>
<li>Gambril, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+retinal+pigment+epithelium+dysmorphia+and+loss+of+histologic+autofluorescence+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).</li>
<li>Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+atrophy%3A+a+histopathological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Geographic atrophy: a histopathological assessment.</a> JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).</li>
<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+retinal+pigment+epithelium+phenotypes+in+the+transition+to+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Retina. 36, 12-25 (2016).</li>
<li>Sura, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+contributions+of+basal+laminar+deposit+and+Bruch%27s+membrane+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19(2020).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160(2018).</li>
<li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+morphology+of+human+macular+and+peripheral+Bruch%27s+membrane+in+older+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes.</a> Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).</li>
<li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy%3A+a+clinicopathological+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).</li>
<li>Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biometrics%2C+impact%2C+and+significance+of+basal+linear+deposit+and+subretinal+drusenoid+deposit+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33(2021).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).</li>
<li>Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial-section+electron+microscopy+using+automated+tape-collecting+ultramicrotome+%28ATUM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM).</a> Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).</li>
<li>Yamaguchi, M., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+of+microorganisms+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56235(2018).</li>
<li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+4%3A+improvements+in+speed%2C+utility+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).</li>
<li>Landowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Tmem135+leads+to+retinal+pigmented+epithelium+pathologies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16(2020).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+age-related+changes+to+the+elastic+lamina+of+Bruch%27s+membrane+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelial+cell+multinucleation+in+the+aging+eye+-+a+mechanism+to+repair+damage+and+maintain+homoeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis.</a> Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).</li>
<li>Ortín-Martínez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-topographic+maps+for+regionally+enhanced+analysis+of+visual+space+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).</li>
<li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119(2022).</li>
<li>Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+Potential+targets+for+protection+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).</li>
<li>Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+fundus+and+retinal+studies+with+SD-OCT%3A+a+comparison+of+five+mouse+inbred+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains.</a> Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).</li>
<li>Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+correlation+of+mouse+photoreceptor-RPE+thickness+between+SD-OCT+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).</li>
<li>Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structural+assessments+of+ocular+disease+in+rodent+models+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61588(2020).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li>
</ol>

Bu protokolün yazarlarının hiçbir açıklaması ve çıkar çatışması yoktur.

Bu yazıda, fare modellerinin yapısal RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanıtıldı. Işık, transmisyon elektronu ve konfokal mikroskopi dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme teknikleri için gözlerin işlenmesi için gerekli adımları ve bu görüntüleme yöntemleriyle gözlenen tipik patolojilerin nicelleştirilmesini tanımladık. RPE fenotipleme protokolümüzün etkinliğini, Tmem135 TG ve 24 aylık WT farelerini inceleyerek kanıtladık, çünkü bu fareler RPE patolojilerini<sup class="xref...

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), 55 yaşın üzerindeki popülasyonları etkileyen yaygın bir körleme hastalığıdır1. Birçok araştırmacı, retinal pigmentli epitel (RPE) içindeki disfonksiyonun AMD2'de erken ve önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanmaktadır. RPE, komşu fotoreseptörlerin ve koroidal kan damarlarının homeostazını korumakla görevli polarize hücrelerin tek katmanlıdır3. RPE içindeki hastalıkla ilişkili mekanizmaları araştırmak için, hücre kültürü modelleri 4,5 ve fareler 6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli modeller mevcuttur. Yakın tarihli bir rapor, RPE hücre kültürü modelleri4 için standartlaştırılmış protokolleri ve kalite kontrol kriterlerini tanımlamıştır, ancak hiçbir rapor fare modellerinde RPE'nin fenotiplemesini standartlaştırmaya çalışmamıştır. Aslında, AMD'nin fare modelleri üzerine yapılan birçok yayın, RPE'nin tam bir tanımından veya içlerindeki RPE patolojilerinin nicelleştirilmesinden yoksundur. Bu protokolün genel amacı, AMD fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.
Önceki yayınlar, üç görüntüleme tekniği ile farelerde çeşitli RPE patolojilerinin varlığına dikkat çekmiştir. Örneğin, ışık mikroskobu, araştırmacıların murin retinasının brüt morfolojisini görmelerini (Şekil 1A) ve RPE incelmesi, vakuolizasyon ve göç gibi RPE patolojilerini tespit etmelerini sağlar. Bir AMD fare modelindeki RPE inceltmesi, RPE yüksekliğindeki ilgili kontrollerden sapma ile örneklendirilir (Şekil 1B). RPE vakuolizasyonu iki ayrı kategoriye ayrılabilir: mikrovakuolizasyon (Şekil 1C) ve makrovakuolizasyon (Şekil 1D). RPE mikrovakuolizasyonu, RPE'de toplam yüksekliğini etkilemeyen vakuollerin varlığı ile özetlenirken, makrovakuolizasyon, fotoreseptörlerin dış segmentlerine çıkıntı yapan vakuollerin varlığı ile gösterilir. RPE migrasyonu, retinal bir kesitte RPE tek katmanının üzerindeki pigmentin fokal agregası ile ayırt edilir (Şekil 1E). AMD donör gözlerindeki göçmen RPE hücrelerinin, farklılaşma kümesi 68 (CD68)9 gibi immünoreaktivite gösterdikleri ve RPE enkazını veya transdiferansiyasyon9 geçiren RPE'yi yutan bağışıklık hücrelerini temsil edebileceği unutulmamalıdır. İletim elektron mikroskobu adı verilen başka bir görüntüleme tekniği, araştırmacıların RPE'nin ve bazal zarının ultrayapısını görselleştirmelerine izin verebilir (Şekil 2A). Bu teknik, bazal laminer tortu (BLamD) olarak bilinen farelerde baskın sub-RPE birikintisini tanımlayabilir (Şekil 2B)10. Son olarak, konfokal mikroskopi, RPE düz montajlarını görüntüleyerek RPE hücrelerinin yapısını ortaya çıkarabilir (Şekil 3A). Bu yöntem, RPE dismorfisini, RPE'nin klasik petek şeklinden sapmasını ortaya çıkarabilir (Şekil 3B). Ayrıca RPE multinükleasyonunu, bir RPE hücresi içinde üç veya daha fazla çekirdeğin varlığını tespit edebilir (Şekil 3C). Mevcut AMD fare modellerinde bulunan RPE patolojilerinin bir özeti için, araştırmacıları literatürden bu incelemelere yönlendiriyoruz 6,7.
AMD'yi inceleyen araştırmacılar, fenotipleme protokolünden önce RPE patolojilerini araştırmak için fare kullanmanın avantaj ve dezavantajlarının farkında olmalıdır. Fareler, nispeten kısa ömürleri ve maliyet etkinliklerinin yanı sıra genetik ve farmakolojik manipüle edilebilirlikleri nedeniyle avantajlıdır. Fareler ayrıca AMD donör gözlerindegözlenen RPE göçü, dismorfi ve çoklu çekirdeklenme dahil olmak üzere RPE dejeneratif değişiklikler sergiler 11,12,13,14,15,16,17; bu, benzer mekanizmaların farelerde ve insanlarda bu RPE patolojilerinin gelişiminin altında yatabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, fare çalışmalarının insan AMD'sine çevrilebilirliğini sınırlayan önemli farklılıklar vardır. İlk olarak, farelerde AMD'de tercihen etkilenen görme keskinliği için gerekli olan insan retinasının anatomik olarak farklı bir bölgesi olan bir makula yoktur. İkincisi, farelerde RPE incelmesi ve vakuolizasyon gibi bazı RPE patolojileri tipik olarak AMD donör gözlerinde görülmez18. Üçüncüsü, fareler AMD patolojisinin ayırt edici bir özelliği olan drusen geliştirmezler19. Drusen, RPE bazal lamina ile Bruch zarının (BrM) iç kollajenöz tabakası arasında oluşan çok az bazal membran proteinine sahip lipit ve protein içeren birikintilerdir19. Drusen, farelerde ortak alt RPE birikintisi olan BLamD'den hem bileşimlerinde hem de anatomik konumlarında farklılık gösterir. BLamD'ler, BrM'nin RPE bazal laminası ile RPE20'nin bazal kıvrımları arasında oluşan yaşa ve strese bağlı hücre dışı matriks ile zenginleştirilmiş anormalliklerdir. İlginç bir şekilde, BLamD'ler hem farelerde hem de insanlarda benzer bir protein bileşimine ve görünümüne sahiptir 6,10,21. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, BLamD'lerin AMD'nin sonraki aşamalarına ilerlemesini etkileyerek AMD'nin patobiyolojisinde hareket edebileceğini düşündürmektedir18,22; Bu nedenle, bu birikintiler fare retinasında hastalıklı RPE'yi temsil edebilir. Bu faydalar ve sınırlamalar hakkında bilgi sahibi olmak, fare çalışmalarından elde edilen sonuçları AMD'ye çevirmek isteyen araştırmacılar için kritik öneme sahiptir.
Bu protokolde, RPE patolojilerini görselleştirmek için gözleri ışığa, iletim elektronuna ve konfokal mikroskopiye hazırlama yöntemlerini tartışıyoruz. Ayrıca, istatistiksel testler için RPE patolojilerinin tarafsız bir şekilde nasıl ölçüleceğini de açıklıyoruz. Kavramın kanıtı olarak, transmembran protein 135- (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip (WT) C57BL / 6J farelerde gözlenen yapısal RPE patolojilerini araştırmak için RPE fenotipleme protokolünü kullanıyoruz. Özetle, AMD fare modellerinde RPE'yi karakterize etmek için fenotipleme metodolojisini tanımlamayı amaçlıyoruz, çünkü şu anda standart protokoller mevcut değildir. AMD fare modellerinde de etkilenen fotoreseptörlerin veya koroidin patolojilerini incelemek ve ölçmek isteyen araştırmacılar, bu protokolü çalışmaları için yararlı bulamayabilirler.

<table><tbody><tr><td>0.1 M Kakodilat Tamponu pH7.2</td><td>PolyScientiifc R& D</td><td>Company S1619</td><td></td></tr><tr><td>100 Kapasiteli Slayt Kutusu</td><td></td><td></td><td>Bu protokol için iki adet gereklidir (biri H & E lekeli kızaklar ve RPE düz montajlar için bir tane.)</td></tr><tr><td>% 100 Etanol &</td><td>MDS Depo</td><td>2292-CASE</td><td>Bu protokolde seyreltilmiş etanol çözeltileri yapmak için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>1 Musluk, 2 Dişi Luer Kilidi</td><td>Qosina</td><td>11069</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS)</td><td></td><td></td><td>Bu protokolde hazır 1x PBS kullanılabilir.</td></tr><tr><td>2.0 mL mikrotüpler</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-283-LR</td><td></td></tr><tr><td>24 Boşluk Gömme Kapsül İkame Kalıp Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>70165</td><td></td></tr><tr><td>Luer Uçlu 24 inç PVC Boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1376778</td><td></td></tr><tr><td>400 Mesh Gilder İnce Çubuk Kare Mesh Izgaralar</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>%95 Etanol</td><td>MDS Deposu</td><td>2293-KASA</td><td></td></tr><tr><td>Su Geçirmez Nem Bariyerli Emici Alt Pedler (23 inç x 24 inç)</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>Ayarlanabilir 237 ml&nbsp; Sprey Şişesi</td><td>VWR</td><td>23609-182</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 Konjuge Eşek anti-Tavşan IgG ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Hassas kayma 19 Ölçer Şırınga İğnesi</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z192546</tr><tr><td>eğrelti otu forseps; Kıvrımlı; İnce çapraz tırtıklar; 4" Uzunluk, 1 mm Uç Genişliği</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5211</td><td>Bu protokolde kavisli forseps olarak bilinir.</td></tr><tr><td>Deve Kılı Fırça Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>65575-02</td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit Ötenazi Odası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit Akış Ölçer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit Tankı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castaloy Çatal Uzatma Kelepçeleri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-769-7Q</td><td></td></tr><tr><td>Dökme Demir L-şekilli Taban Destek Standı</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11-474-207</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Prolifer Programı</td><td></td><td></td><td>İndirilebilir: https://cellprofiler.org/releases</td></tr><tr><td>Şeffaf Oje Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Colorfrost Mikroskop Slaytları Lavanta</td><td>VWR</td><td>10118-956</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Bu protokolde Milli-Q Arıtma Sisteminden</td> <td>damıtılmış H20</td><td></td><td></td> Su kullanılmıştır.</tr><tr><td>Dumont İnce Uçlu Cımbız; Model #55</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-4984</td><td>Bu protokolde ince uçlu forseps olarak bilinir ve bu protokol için 3 adet gereklidir (ikisi diseksiyon için ve biri elektron mikroskobu işlemi için).</td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu Izgara Tutucu Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>71147-01</td><td></td></tr><tr><td>EPON 815 Reçine Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>14910</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Mark-It Doku İşaretleme Sarı</td><td>Boya Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22050460</td><td>Bu doku işaretleme boyasını kullanırken lütfen üreticinin protokolüne uyun.</td></tr><tr><td>Epredia Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-610</td><td>H & montajı için kullanın E slaytlar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiber-Lite Mi-150 Aydınlatıcı Serisi, 150 w Halojen Işık Kaynağı</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Mi-150</td><td>Diseksiyon mikroskobu için ışık kaynağı.</td></tr><tr><td>Fiji ImageJ Programı</td><td></td><td></td><td>İndirilebilir: https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Flexaframe Castaloy Kanca Konektörü</td><td>Thermo Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>14-666-18Q</td><td></td></tr><tr><td>Çeker ocak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit %2.5 Fosfat Tamponunda, pH 7.4, %32</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>16537-05</td><td></td></tr><tr><td>ORIUS (1000) CCD Kamera</td><td></td><td></td><td></td>Laboratuvarı Tezgah Üstü Çalkalayıcı</tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>ile JEM-1400 Transmisyon Elektron Mikroskobu (JEOL)Bu deneyler için iki tanesine ihtiyaç vardır. Biri oda sıcaklığında, diğeri ise 4 santigrat derece soğuk odada olmalıdır.</td></tr><tr><td>Lazer Cryo Etiket Etiketleri Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>77564-05</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun Sitrat Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC7Ultramikrotom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Reichert Ultracut S Mikrotom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaldırıcıSlipler</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>22X22I24788001LS</td><td>Yükseltilmiş kenarlara sahip oldukları ve RPE'nin kalınlığına uydukları için RPE düz montajları için bu lameller kullanın.</td></tr><tr><td>Mayer'in Hematoksilen VWR</td><td></td><td>100504-406</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Mikro Diseksiyon Yaylı Makas</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5600</td><td>Protokolde mikro diseksiyon makası olarak bilinir.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Fareler</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir AMD fare modeli ve ilgili kontrolleri bu protokol için çalışabilir.</td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Makasları; Standart versiyon; Kıvrımlı; Keskin noktalar; 24 mm Bıçak Uzunluğu; 4.5" Toplam Uzunluk</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5913</td><td>Bu protokolde kavisli makas olarak bilinir.</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotüp rafları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1RS Konfokal Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>SouthernBiotech</td><td>0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Numara 11 Steril Tek Kullanımlık Neşter Bıçakları</td><td>VWR</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %32</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Kalem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı</td><td>VWR&nbsp;</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetler&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal Anti-ZO-1 Antikor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>Propilen Oksit Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>20412</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>VWR</td><td>10040-386</td><td></td></tr><tr><td>Fare Perfüzyonları</td><td></td><td></td><td></td>İçin Sığ Tepsi</tr><tr><td>Shandon Eosin Y Alkollü</td><td>VWR</td><td>89370-828</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie Ultra İnce Uçlu Siyah Kalıcı Marker</td><td>Zımba</td><td>642736</td><td></td></tr><tr><td>Boyama için Sürgülü Raf</td><td></td><td>Grainger 49WF31</td><td></td></tr><tr><td>Kare Kapak Cam Slips</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı Boyama Kabı</td><td>Grainger</td><td>49WF30</td><td>H & için 15'e İhtiyaç Var E boyama prosedürü.</td></tr><tr><td>Hedef Tamamen Plastik Tek Kullanımlık Luer-Slip 50 mL Şırınga&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td>S7510-50</td><td>Yalnızca şırınga haznesini kullanın.</td></tr><tr><td>Zamanlayıcı</td><td>Fisher</td><td>1464917</td><td></td></tr><tr><td>Uranil Asetat Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu Fırın</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Montaj Ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td>RPE düz montajları monte etmek için kullanın.</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td></td><td></td>22050283</tr><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 Işık Mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Bu mikroskop, dikişli 20x görüntü oluşturma kapasitesine sahiptir. Bir ışık mikroskobu bu kapasiteye sahip değilse, tüm retinanın birbiriyle hafifçe örtüşen görüntülerini alın. Bu görüntüleri birleştirmek için Adobe Photoshop'u kullanın. Görüntü birleştirme için lütfen Adobe Photoshop programının kılavuzlarına bakın.</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000 Diseksiyon Mikroskobu Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>65575-02</td><td></td></tr></tbody></table>

yaşa bağlı makula dejenerasyonunun fare modellerinde retinal pigmentli epitel patolojilerini değerlendirme ve Ölçme protokolü

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), yaşlanan popülasyonlarda zayıflatıcı bir retina hastalığıdır. Retinal pigmente epitel (RPE) disfonksiyonunun YBMD'de önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanılmaktadır. RPE disfonksiyonuna yol açan mekanizmaları anlamak için, fare modelleri araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Önceki çalışmalarla, farelerin, bazıları AMD tanısı alan bireylerin gözlerinde gözlenen RPE patolojileri geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, farelerde RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanımlanmaktadır. Bu protokol, ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak retinal kesitlerin hazırlanmasını ve değerlendirilmesini ve ayrıca konfokal mikroskopi ile RPE düz montajlarının hazırlanmasını ve değerlendirilmesini içerir. Bu tekniklerle gözlemlenen yaygın murin RPE patolojileri türlerini ve bunları istatistiksel testler için tarafsız yöntemlerle ölçmenin yollarını detaylandırıyoruz. Kavram kanıtı olarak, bu RPE fenotipleme protokolünü, transmembran protein 135'i (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip C57BL / 6J farelerde gözlenen RPE patolojilerini ölçmek için kullanıyoruz. Bu protokolün temel amacı, AMD'nin fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.

Bu makalede açıklanan RPE fenotipleme protokolünün tamamlanması, AMD'nin fare modellerinde yaygın olarak gözlenen yapısal RPE anormalliklerinin nicel bir analizini sağlar. Bu protokolün etkinliğini doğrulamak için, tavuk beta-aktin promotörü (Tmem135 TG)30 ve yaşlı C57BL / 6J fareleri31,32 tarafından tahrik edilen WT Tmem135'i aşırı eksprese eden transgenik fareler de dahil olmak üzere RPE patolojileri gösterdiği bilinen farelerde...

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Bu protokol, ışık geçirgenliği elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak RP patolojileri için fare boyutunun nasıl işleneceğini ve değerlendirileceğini açıklayan ilk protokoldür. Bu protokolün temel avantajı, RP patolojilerinin kantitatif değerlendirmelerinin dahil edilmesi, istatistiksel karşılaştırmalar için bu üç görüntüleme tekniğinin kullanılmasıdır. Bu protokolde açıklanan teknikler, RPE sağlığı için önemli olan moleküler yollar hakkındaki bilgimizi genişletmeye de yardımcı olabilir.Daha önce fare boyutunu disseke etmemiş kişiler bu protokolle mücadele edebilir. Bu bireylere, bu protokolde açıklanan tekniklerde ustalaşmak için bazı farelerle pratik yapmalarını öneririz. Başlamak için, bir duman başlığında kardiyak perfüzyon için emici bir alt ped üzerinde bir yerçekimi besleme perfüzyon sistemi hazırlayın.Perfüzyon sisteminin şırınga fıçısına 40 mililitre taze hazırlanmış fiksatif tampon dökün. Tamponun boru hattından akmasına izin vermek için vanayı boru hattına paralel olarak çevirin. Tüm hava kabarcıkları hattan çıkarılana kadar çizgiyi yıkayın.Ardından, tamponun boru hattına akmasını önlemek için valfi boru hattına dik olarak çevirin. Kardiyak perfüzyon gerçekleştirmek için, ötenazi fareyi perfüzyon sisteminin yakınındaki sığ bir tepsiye aktarın. Karın yukarı bakacak şekilde.Karnı% 70 etanol ile püskürtün, ardından göğüs kafesinin altındaki farenin sol tarafındaki deri ve karın duvarından kavisli makas ve forseps kullanarak beş santimetre aşağı kesim oluşturun. Alt kesimin üstündeki cilt ve karın duvarından üç santimetrelik bir medial kesim yapmaya devam edin. Medialin sonunda, göğüs kafesinin altındaki farenin en uzak sağ tarafındaki deri ve karın duvarından beş santimetre daha aşağı kesim yapın.Kavisli forsepsli abdominal cilt flebini çıkarmak için üç santimetrelik bir medial kesi daha yapın. Daha sonra, kalbi açığa çıkarmak için diyaframı ve sternumu kesin. Gösterge iğnesini kalbin sol ventrikülüne yerleştirin ve kapağı çevirin.Kanın ve fiksatifin kalpten çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu kavisli makasla kesin. 10 mililitre fiksatif tamponun fareyi bir ila iki dakika boyunca veya karaciğerin rengi soluklaşana ve sağ atriyumdan kan akmayana kadar perfüze etmesine izin verin. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, tampon akışını durdurmak için vanayı boru hattına dik olarak çevirin.Gözleri çekirdeklendirmek için, fareyi sığ tepsiden çıkarın ve bir duman başlığındaki emici alt pedin üzerine yerleştirin. Ardından, farenin kafasını sol gözü deneyciye bakacak ve sağ gözü görüş alanı dışında olacak şekilde yönlendirin. Gözün üst tarafına bir doku işaretleme boyası ile açıklama ekleyin.Gözün göz yuvasından çıkıntı yapması için başparmak ve işaret parmağınızla göz yuvasının etrafını yavaşça aşağı doğru itin. Daha sonra kavisli makas kullanarak, gözü bıçakla göz yuvasından 30 derecelik bir açıyla tutun ve gözün etrafını kesin. Göz küresini kavisli forseps ile kafadan çıkarın ve emici bir alt pedin üzerine yerleştirin.Korneayı 11 numaralı neşter bıçağı ile çırpın ve kavisli forsepsli gözü iki mililitre fiksatif tampon içeren iki mililitrelik bir mikro tüpe yerleştirin. Her iki gözü de çekirdeklendirdikten sonra, onları 75 rpm hızında dört derecelik bir odada bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca fiksatif bir tamponda inkübe edin. Ertesi gün, fiksatif tamponu iki mililitre PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında ve 75 rpm'de bir çalkalayıcıda 10 dakika inkübe edin.Posterior segmentler oluşturmanın yanında, gözü diseksiyon mikroskobu altında PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Herhangi bir yağ ve kası ince uçlu forsepslerle göz küresinden yavaşça kaldırın. Göz küresi düzgün bir mavimsi-siyah renge sahip olana kadar yağ ve kası mikro diseksiyon makası ile göz küresine paralel bir yönde dikkatlice kesin Kornea delinme bölgesine ince uçlu forsepsler yerleştirin ve kornea ve irisi göz küresinden çıkarmak için delinme bölgesinden başlayarak korneanın çevresini mikro disseksiyon makası ile kesin.Daha sonra ince uçlu forseps kullanarak, arka segmenti oluşturmak için lensi göz küresinden yavaşça çıkarın. Arka segmenti iki mililitre PBS içeren bir tüpe yerleştirin ve kullanıma kadar buzdolabında dört santigrat derecede saklayın. Gözü PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve gösterildiği gibi kornea ve irisi çıkarın.İnce uçlu forsepslerle lensi dışarı çekin. Daha sonra iki ince uçlu forseps kullanarak, nöral retinayı arka segmentten yavaşça ayırın. Arka göz kepçesinden çıkarmak için optik sinir başındaki nöral retinayı dikkatlice kesin.Göz kabini beş mikrolitre PBS içeren iki mililitrelik bir mikro tüpe yerleştirin. Arka göz kaplarını sabitlemek için, dokuya 500 mikrolitre metanol ekleyin ve beş dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Metanol fiksasyonunu iki saat boyunca son inkübasyonla üç kez tekrarlayın.Fiksasyondan sonra, konfokal mikroskopi ile immünofloresan boyama ve görselleştirmeye geçmeden önce dokuyu PBS ile üç kez yıkayın. Dört aylık TMEM 135 TG fareleri, retinal pigmentli epitel veya RPE kalınlığında, optik sinirden 600 ve 900 mikrometre uzaklıkta, yaşa uygun vahşi tip farelere göre anlamlı bir azalma gösterdi. 325 günlük WT ve TMEM 135 TG farelerin mikrovasküolizasyonu, makrovakuolizasyonu ve migrasyonunu içeren RPE patolojilerinin vakaları hesaplandı.RPE mikrovakuolizasyonunun ortalama sıklığı, TMEM 135 TG farelere kıyasla vahşi tipte daha düşüktü. TMEM 135 TG farelerde gözlenen ortalama değerlere kıyasla vahşi tipte RPE makrovakuolizasyonu ve migrasyonu tespit edilmedi. Transmisyon elektron mikroskobunda 24 aylık retinalarda bazal laminer birikintiler gözlenirken, iki aylık retinalarda yoktu.Bazal laminer birikinti yüksekliklerinin kümülatif frekanslarının analizi, 24 aylık farelerde birikintilerde bir artış olduğunu göstererek, iki aylık olana kıyasla, 24 aylık için çizginin sağına doğru bir kayma olduğunu göstermiştir. Bu gözlem, 24 aylık retinalarda daha büyük ortalama yüksekliklerle desteklendi. Dört aylık TMEM 135 TG farelerde RPE dismorfikti.TMEM 135 TG retinalarındaki RPE, yaşa uygun vahşi tip retinalardan daha büyük ve daha az yoğundur. Ayrıca, TG retinalarında kontrollere kıyasla daha fazla çok çekirdekli RPE hücresi gözlendi. Bu protokolü takiben araştırmacılar, farelerde moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak spesifik yolları değerlendirebilir ve bu da bu RP patolojilerinin farelerde nasıl geliştiğini anlamamıza katkıda bulunabilir.Bu protokol, farelerde RP fenotiplemesinin standartlaştırılmasına yardımcı olacak, bu da fare çalışmalarından elde edilen bulguları diğer AMD modellerine çevirecek ve AMD patobiyolojisini anlamamıza yardımcı olacaktır.

a-protocol-to-evaluate-quantify-retinal-pigmented-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Kuyruk ven enjeksiyon yoluyla gerçekleştirilebilir Indocyanine Yeşil Anjiyografi (veya ISYA) fare koroidinde anormallikleri karakterize kaliteli ISYA zaman ders görüntüler sağlar.

Zaman kurs Indocyanine Yeşil Anjiyografi ile Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu Fare Modeli Koroid vaskülatürüne anormallikleri tespit

Burada, ilk olarak Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından 2000'li yılların başında tanımlanan DC-ERGs olarak bilinen bir tekniği kullanarak farelerde retina pigment epitelinin (RPE) ışık uyarılmış elektriksel tepkilerini kaydetmek için bir yöntem saklı tutuyoruz.

Mouse Retinal Pigment Epitelinin Işık Uyarılmış Elektriksel Tepkilerini Kaydetmek için Doğrudan Birleştirilmiş Elektroretinogram (DC-ERG)

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu protokol, farelerin retinal düz montajlarının hazırlanması ve immünofloresan boyanması ve analizi için ayrıntılı bir yöntemi açıklamaktadır. Floresein fundus anjiyografinin (FFA) fare yavruları ve görüntü işleme için kullanımı da ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Oksijene Bağlı Retinopati Fare Modelinde Retina Damarlarının Dinamik Büyümesinin İzlenmesi

Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

Bu makalede, tüm mount retinal preparatları için iyi kurulmuş ve tekrarlanabilir bir lektin lekesi testi ve proliferatif ve proliferatif olmayan retinopatilerde sıklıkla değiştirilen vasküler parametrelerin nicel ölçümü için gerekli protokoller açıklanmaktadır.

Proliferatif Olmayan ve Proliferatif Retinopatilerle Farelerin Tüm Mount Retinalarında Vasküler Parametrelerin Nicelemesi

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

İnsan gözünde retinal pigment epitelini (RPE) retinadan etkin bir şekilde ayırmak ve RPE'nin histolojik ve morfometrik analizleri için tüm RPE / koroid düzlüklerini üretmek için bir yöntem tanımladık.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Tandem birleştirme olayları, birbirinden 12 nükleotidden daha az uzaklıkta meydana gelir. Bu tür ek varyantlarının oranlarının niceliksel olarak belirlenmesi, mutlak bir kantitatif PCR yaklaşımı kullanılarak mümkündür. Bu el yazması, iki birleştirme olayının Serine-701 dahil etme/dışlama ve α/β C-uçları ile sonuçlandığı STAT3 geninin ek varyantlarının nasıl ölçülebileceğini açıklamaktadır.

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Keşfedin, ışık, transmisyon elektron ve konfokal mikroskopi kullanarak fare modellerinde retinal pigmentli epitel patolojilerini değerlendirme ve ölçme yöntemini. Bu protokol, istatistiksel karşılaştırmalar için niceliksel değerlendirmeler sağlar.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Daha fazla video keşfet