Name: Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin, TIRF mikroskobu ile lipid çift katmanlarında iyon kanallarının yanal mobilitesini ve aktivitesini tek molekül düzeyinde nasıl görüntüleyeceğinizi. Bu yöntem, floresan etiketleme olmadan membran proteinlerinin dinamiklerini incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Beate Nitschke'ye protein hazırlama konusundaki yardımları için ve Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) ve Maximilan Ulbrich'e (Freiburg) anlayışlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma Stuttgart Araştırma Merkezi Sistem Biyolojisi (SRCSB) ve Baden Württemberg Vakfı'ndan (BiofMO-6'dan SN'ye) bir hibe ile desteklenmiştir.

Çıkar çatışması olmadığını beyan ederiz.

Burada sunulan protokol, tek moleküllü TIRF mikroskobu kullanarak lateral iyon kanalı hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi incelemek için DIB membranlarının kullanımına bir giriş sağlar. Mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, mümkün olduğunca çok sayıda iyi ayrılmış kanala sahip kararlı DIB membranlarının hazırlanması, tatmin edici bir şekilde analiz edilebilen bireysel parçacıkların zaman serilerini elde etmek için çok önemlidir.
Optimize edilmesi gereken kritik parametreler arasında lipit seçimi, yağ fazındaki lipit konsantrasyonu ve sulu damlacıklardaki protein ve deterjan konsantrasyonları bulunur. Kullanılan lipitler olağandışıdır, çünkü düşük sıcaklıklarda net bir faz geçişi göstermezler. DPhPC, kararlı membran sistemleri üretmek için yaygın olarak kullanılan bir lipittir40. Prensip olarak, sıvı ortamını düşük sıcaklıklarda tutan herhangi bir lipit bu uygulama için uygun olabilir. Ek olarak, lipit oksidasyona duyarlı olmamalıdır. Membran yırtılmasını önlemek için damlacıklardaki deterjan konsantrasyonu mümkün olduğunca düşük olmalıdır. Kararlı membranlar ve iyi protein birleştirme oranları, membran proteininin çökelmemesi göz önüne alındığında, genellikle kritik misel konsantrasyonunun (cmc) altındaki deterjan konsantrasyonları ile elde edilir.
DIB membranları spesifik deterjanları21,41 tolere etmezse veya proteinler düşük deterjan çözeltisinden DIB membranlarına entegre olmazsa, protein kanalları önce küçük unilamellar lipid veziküllerine (SUV'ler) yeniden oluşturulabilir, bunlar daha sonra E. coli MscL 42 için başarıyla gösterildiği gibi damlacık tarafından DIB membranlarına kaynaştırılır . Bazen, yağ fazındaki lipit konsantrasyonu çok düşük olduğu için DIB membranları oluşmaz. DIB membranlarının patlamasını önlemek için, hidrojel ve damlacık arasındaki ozmotik basıncın, Ca2 + - akısını cis'den transa aşırı derecede etkilemeden tam olarak dengelenmesi gerektiğinin de farkında olunmalıdır. Optimize edilmiş agaroz kalınlığı ve ağ boyutu, membran proteinlerinin difüzyonunu gözlemlemek için çok önemli görünmektedir. Agaroz tabakasının kurumasından kaçınılmalıdır. Kalınlık atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak belirlenebilir17. Spin kaplama sırasında agaroz konsantrasyonunu, hacmini ve dönme hızını değiştirerek, hidrojelin ağ boyutu ve kalınlığı optimize edilebilir. Bununla birlikte, hidrojel tabakası kalınlığının görüntü kontrastını etkilediğini unutmayın. DIB'lerdeki membran proteinlerini yakalamak için, agaroz hidrojeli, bir His-tag17 aracılığıyla onları yakalamak için özel sentezlenmiş, çapraz bağlanmamış, Ni-NTA modifiye edilmiş, düşük erime noktalı agaroz ile değiştirilebilir. Aşırı yüksek floresan arka plan genellikle DIB membranlarının yırtılmasından kaynaklanır. Bu, özellikle çok kuyucuklu odalarda bir sorundur, çünkü Ca2 + 'ya duyarlı boya hidrojelin içine yayılır. Bu durumda, bitişik kuyulardan kaçınılmalıdır. Membranın üzerindeki Ca2 + 'ya duyarlı boyanın floresan ağartılması, TIRF kaçan alanının dışındaki damlacığın kütlesinde (Şekil 3A) uyarılmamış boyalarla değiştirildiği için önemli bir sınırlayıcı faktör olmamalıdır. Protein için lokalizasyon hassasiyeti, lekelerin ve piksel boyutunun sığdırılmasının doğruluğu ile verilir.
Zayıf floresan sinyalleri, kanal boyunca düşük Ca2 + - akıyından kaynaklanabilir. Olası nedenler şunlardır: (i) yanlış TIRF ayarları (örneğin, lazer yoğunluğu), (ii) membran boyunca ozmotik Ca2+ basıncı veya (iii) kanalların içsel Ca2 + geçirgenliği çok düşüktür. İlk sorunla başa çıkmak için lazer yoğunluğu, TIRF açısı ve kamera kazancının optimize edilmesi gerekir. Son iki sorun, membran 2,43 boyunca bir elektrik potansiyelinin uygulanmasıyla aşılabilir. Bununla birlikte, harici voltajların uygulanması sonucu bozabilir, çünkü elektriksel etkiler aslında voltaj kontrollü olmayan ligand kapılı veya mekanosensitif iyon kanallarının kanal açılmasını etkileyebilir. Bu tür kanallara örnek olarak mitokondriyal protein translokazı TOM-CC27 ve kanal oluşturan alt birimi Tom40 26,44,45,46 verilebilir. Son olarak, membran proteinlerinin istenen işlevselliği elde etmek için belirli bir oryantasyonda DIB membranlarına yerleştirilmesinin zor olduğu ve nicel çalışmaların nadir olduğubelirtilmelidir 47,48. Bazı durumlarda, entegre proteinlerin oryantasyonu rastgeledir. Bu, membran proteinlerini incelemek için ciddi bir problemdir, çünkü bazı membran proteinleri membranın sadece bir tarafında aktive edilir.
TIRF mikroskopisi, düzlemsel destekli membranlardaki tek moleküllü olayları ele almak için güçlü bir yöntemdir49. Örnekler arasında α-hemolizin50, perfringolizin O 51 ve OmpG52 gibi kanal proteinlerinin montaj ve katlama yolunun aydınlatılması sayılabilir. Bu çalışmalar ek bir teknik olarak FRET'i içeriyordu. Ek olarak, mekanosensitif iyon kanalı MscL'nin aktivasyonu daha önce mevcut ölçümler kullanılarak desteklenen DIB çift katmanlı42'nin mekanik stimülasyonu ile incelenmiştir. Bu çalışmaya dayanarak, gelecekteki çalışmalar, burada açıklanan platformu, tek moleküllü seviyedeki mekanosensitif kanalları optik bir şekilde ele almak için tek moleküllü FRET deneyleriyle birleştirebilir17. Damlacık içine tampon enjeksiyonu, iç DIB tek katmanının gerilmesi veya bireysel kanalların altta yatan hidrojele hedeflenen bağlanması, sadece MscL ve MscS, iki gözenekli alan K + kanalları, TREK-1 için gösterildiği gibi membran gerginliğine ve / veya eğriliğine yanıt veren mekanik olarak aktive edilmiş kanalların fiziksel mekanizmasını daha fazla incelemek için kullanılabilir. TREK-2, TRAAK ve PIEZO (inceleme için, bkz.53), aynı zamanda dokunmaya duyarlı iyon kanalı NOMPC54,55 için gösterildiği gibi hücresel hücre iskeletine lokal bağlanma.

Bu protokol, polimer destekli damlacık arayüzlü çift katmanlı (DIB) membranlarda membran proteinlerinin membran mobilitesi ile iyon kanalı geçirgenliği arasındaki korelasyonun nasıl çalışılacağını açıklamayı amaçlamaktadır 1,2,3.
Mevcut teknik, tek parçacık izleme 4,5, floresan korelasyon spektroskopisi 6,7 ve yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu 8,9,10 gibi etkileyici bir dizi gelişmiş optik ve yüzey analitik aracını tamamlamaktadır. Bunlar, membran bazlı reaksiyonları etkileyen membranların dinamik bileşimi ve yapısı hakkında değerli bilgiler sağlar11,12,13. Proteinlerin hareketi ve yanal difüzyonu, membrandaki proteinlerin yerel yoğunluğuna bağlı olsa da, bireysel protein molekülleri de lipit sallarında14 ve protein-protein etkileşimleri 15,16 ile tutulabilir. Membrandan hücre dışı ortama veya sitosol'e çıkıntı yapan protein alanlarına bağlı olarak, protein hareketliliği oldukça hareketliden tamamen hareketsizliğe kadar değişebilir. Bununla birlikte, membranın karmaşıklığı ve periferik yapıları nedeniyle, yanal hareketliliğin doğası ile protein fonksiyonu arasındaki etkileşimi deşifre etmek genellikle zordur17.
DIB membranlarının, membran proteinlerinin biyofiziksel tek moleküllü analizleri için etkili bir platform olduğu kanıtlanmıştır 18,19,20,21,22. Bir lipit/yağ fazında sulu damlacıkların hidrojel destekli substratlarla teması yoluyla lipitlerin kendi kendine montajı ile oluşurlar. Yaygın olarak kullanılan desteklenen lipit çift katmanlarına (SLB'ler)1,23,24,25 benzer şekilde, DIB'ler, uygun ligandlarla işlevselleştirildiğinde proteinlerin polimer matrisine geçici veya kalıcı olarak bağlanmasıyla yanal hareketliliğin lokal olarak ayarlanmasına izin verir17. İkincisi, heterojen bir protein dağılımına sahip hücre zarlarındaki biyokimyasal işlemler için bir model sistem olarak hizmet edebilir10.
Burada açıklanan deneysel yaklaşım, TIRF mikroskobu kullanarak membran 2,22'ye yakın bir yerde bireysel kanallardan Ca2+ iyon akısını ölçmek için Ca2+ duyarlı boyaların floresansına dayanır. Bu optik yaklaşım, numunenin aydınlatılmasını, kaçan uyarma ışığının fiziksel özellikleri nedeniyle, floresan arka planın önemli ölçüde azalmasına yol açan membrana yakın bir mesafeyle sınırlar. İkincisi, tek moleküllerin tespiti için yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük gerekiyorsa bir önkoşuldur. Klasik elektrofizyolojik yöntemlerinaksine 26,27, iyon akısını tek tek kanallardan incelemek için membran voltajlarına gerek yoktur. Ayrıca, yöntem, membrandaki kanalların yanal hareketine müdahale edebilecek floresan boyalar veya moleküllerle etiketleme gerektirmez.
Bu yöntem, klasik elektrofizyolojiyi kullanmadan membrana gömülü protein kanallarını tek molekül seviyesinde incelemek için özellikle yararlıdır. Neurospora crassa 28,29,30'dan mitokondriyal protein ileten kanal TOM-CC'yi ve Escherichia coli 17,31'in dış zarı boyunca küçük hidrofilik moleküllerin difüzyonunu destekleyen OmpF'yi kullanarak, iki proteinin membran hareketliliklerinin ve kanal aktivitelerinin nasıl incelenebileceğini ve ilişkilendirilebileceğini gösteriyoruz. Bu yaklaşımın, TOM-CC ve OmpF için optimize edilmiş olmasına rağmen, diğer protein kanallarına kolayca uygulanabileceğini öneriyoruz.

<table><tbody><tr><td>1,2-difitanoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>100x Yağ objektifi Apochromat NA 1.49</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>TIRF mikroskobu&nbsp;</td></tr><tr><td>10x Hoffmann modülasyonu kontrast objektifi NA 0.25&nbsp;</td>DIB membran oluşumunu değerlendirmek için <td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskobu&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>10x objektif NA 0.25</td><td>Nikon</td><td>MRL00102</td><td>TIRF mikroskobu&nbsp;</td></tr><tr>DIB membran oluşumunu değerlendirmek için <td>40x Hoffmann modülasyon kontrast objektifi NA 0.55</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskobu&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>488 nm lazer, 100 mW&nbsp; &nbsp;</td><td>Visitron</td><td></td><td>TIRF mikroskobu&nbsp;</td></tr><tr><td>Yapışkan bant</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ve Auml; kta saf&nbsp; &nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td>Protein saflaştırma sistemi</td></tr><tr><td>Bradford tahlil kiti, Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>Chelax 100 reçine</td><td>Biorad</td><td>143-2832</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MC1024452500</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz kasetleri Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87735</td><td></td></tr><tr><td>DİB odası&nbsp;</td><td>DIB membranları için</td> <td>özel yapım</td><td></td> PMMA odası</tr><tr><td>Dijital güç ölçer ve enerji konsolu</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Lazer güç ölçer ve nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Roth&nbsp;</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>Çift damıtılmış H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100 Hoffmann modülasyonlu kontrast mikroskobu&nbsp;</td>DIB membran oluşumunu değerlendirmek için <td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskobu&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8042.2</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD kamera iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>TIRF mikroskobu&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>Sabit açılı rotor Ti70</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8, CalciFluorTM</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-362561</td><td>Ca2 + duyarlı boya</td></tr><tr><td>Fransız pres hücre bozulması homojenizatör</td><td>Igneus</td><td>Igneus 40000 psi</td><td></td></tr><tr><td>GFP filtresi</td><td>AHF</td><td></td><td>Beyaz ışık kaynağı ile epifloresan ile Dib membranlarının uyarılması için kullanılan filtre sızıntısı&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller 40 mm x 24 mm x 0,13 mm</td><td>Roth</td><td>1870.2</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Roth</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga 10 mL</td><td>Roth</td><td>X033.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga 100 mL</td><td>Roth</td><td>X049.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga 500 mL</td><td>Roth</td><td>EY49.1</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma bloğu&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer konfor</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma plakası</td><td>Minitube&nbsp;</td><td>HT200</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth&nbsp;</td><td>9205.3</td><td></td></tr><tr><td>Hexadcane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296317</td><td></td></tr><tr><td>Tuzağı HP 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>29051021</td><td>Ni-NTA sütunu</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.04716.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>10314243</td><td></td></tr><tr><td>KLM spin kaplayıcı&nbsp;</td><td>Schaefer Tec</td><td>SCV-10</td><td></td></tr><tr><td>Listesi tıbbi L/M-3P-A dikey pipet çektirme</td><td>Artisan Technology Group</td><td>57761-1</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>M8 Stereomikroskop</td><td>Vahşi</td><td></td><td>Stereomikrosop&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab&nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>R2022a</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil pipet uçları</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>N2 gaz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Nanolitre 2010 enjektör ve nbsp;</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>Nanolitre 2010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>n-dodesil-BD-maltosit</td><td>Glison Biyokimyasalları</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaroz, çapraz bağlı olmayan</td><td>Küp Biyoteknoloji</td><td>124115393</td><td>Özel yapım</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR yazılımı</td><td>Nikon</td><td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td><td>Görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>n-oktil-polioksietilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40530</td><td></td></tr><tr><td>O2</alt> gazı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür</td><td>Roth&nbsp;</td><td>6367.3</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiyot sensörü&nbsp; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td><td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>Lazer güç ölçer için sensör&nbsp;</td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Diener Electronics</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Preparative ultrasantrifüj Optima</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dört bantlı TIRF filtresi 446/523/600/677 HC</td><td>AHF</td><td></td><td>Filtre ayarı 488 nm lazer ile DIB membranlarının uyarılması için kullanılır.</td></tr><tr><td>Kaynak Q 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17117701</td><td>Anyon değişim sütunu</td></tr><tr><td>Silikon yağı AR 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Super LoLux kamera</td><td>JVC</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>Gerhardt</td><td>THL 500/1</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E Floresan mikroskobu&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Roth</td><td>8952.2</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik banyo&nbsp;</td><td>Bandelin Sonorex</td><td>RK 100</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>Vacuubrand</td><td>MD 4C NT</td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan aydınlatma için beyaz ışık kaynağı (100 W)</td><td>Nikon</td><td>MBF72655</td><td>TIRF mikroskobu&nbsp;</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Roth</td><td>2363.2</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

toplam İç yansıma floresan (tirf) mikroskobu kullanılarak lipid Çift katmanlarında yanal mobilite ve İyon kanalı aktivitesinin tek moleküllü görüntülenmesi

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri, birçok iyon kanalının statik olmadığını, ancak gözenek oluşturan ve yardımcı alt birimlerin geçici ilişkisi, yanal difüzyon ve diğer proteinlerle kümelenme dahil olmak üzere oldukça dinamik süreçlere tabi olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, lateral difüzyon ve fonksiyon arasındaki ilişki tam olarak anlaşılamamıştır. Bu soruna yaklaşmak için, desteklenen lipid membranlarındaki bireysel kanalların lateral hareketliliğinin ve aktivitesinin, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak nasıl izlenebileceğini ve ilişkilendirilebileceğini açıklıyoruz. Membranlar, damlacık arayüzü çift katmanlı (DIB) tekniği kullanılarak ultra ince bir hidrojel substrat üzerinde üretilir. Diğer model membran tipleriyle karşılaştırıldığında, bu membranlar mekanik olarak sağlam ve son derece hassas analitik teknikler için uygun olma avantajına sahiptir. Bu protokol, membrana yakın bir yerde Ca 2 + 'ya duyarlı bir boyanın floresan emisyonunu gözlemleyerek tek kanallardan Ca2 + iyon akışını ölçer. Klasik tek moleküllü izleme yaklaşımlarının aksine, membrandaki yanal harekete ve fonksiyona müdahale edebilecek floresan füzyon proteinleri veya etiketleri gerekli değildir. Proteinin konformasyonel değişiklikleri ile ilişkili iyon akısındaki olası değişiklikler sadece membrandaki protein yanal hareketinden kaynaklanmaktadır. Temsili sonuçlar, mitokondriyal protein translokasyon kanalı TOM-CC ve bakteri kanalı OmpF kullanılarak gösterilmiştir. OmpF'nin aksine, TOM-CC'nin kapısı moleküler hapsedilmeye ve lateral difüzyonun doğasına karşı çok hassastır. Bu nedenle, desteklenen damlacık arayüzü çift katmanları, yanal difüzyon ile iyon kanallarının işlevi arasındaki bağlantıyı karakterize etmek için güçlü bir araçtır.

Gerçek zamanlı elektrotsuz optik tek kanallı kayıt, yanal protein hareketi ile DIB membranlarındaki bireysel iyon kanallarının işlevi arasındaki etkileşimi ortaya çıkarır. Mitokondriyal TOM çekirdek kompleksinin (Şekil 1A) bir DIB membranına (Şekil 4D) yeniden yapılandırılması, yanal hareketlilik ile iyon geçirgenliği arasında güçlü bir zamansal korelasyon olduğunu göstermektedir (Şekil 5A). TOM-CC geçidi, yanal hareket moduna duyarlı görünmektedir17. Hareketli kanallar, gözeneklerinden ve yüksek floresan noktası yoğunluklarından Ca2+ akı gösterir. Sıkışmış, hareket etmeyen moleküller düşük ve orta floresan yoğunlukları gösterir. Mitokondri TOM-CC'nin genel protein ithalat gözenekleri için, bu tek moleküllü yaklaşım, yanal hareketlilik ile iyon geçirgenliği arasında güçlü bir zamansal korelasyon ortaya koymuştur, bu da TOM-CC kanalının mekanosensitif özelliklere sahip olduğunu düşündürmektedir17. Serbestçe hareket eden TOM-CC moleküllerinin yanal olarak durmasına, TOM-CC kanalının kısmen veya tamamen kapanması eşlik eder. Membranın içine neredeyse tamamen gömülü olan OmpF (Şekil 1E ve Şekil 4F) ile DIB membranlarının görüntülenmesi dur-kalk etkisi göstermez (Şekil 5B). OmpF'nin rastgele duraklamaları, yoğunluktaki bir değişiklikle ve dolayısıyla gözeneklerinin kapanmasıyla ilişkili değildir. Floresan sinyalleri 38'e dayanarak, bireysel kanalların konumsal doğruluğu 5 ila 10 nm arasında tahmin edilebilir. Bununla birlikte, örneğin kök ortalama deplasmanı 120 nm olan bir ara durumdaki TOM-CC molekülleri için gösterildiği gibi, agaroz hidrojeli ile mobil ankraj nedeniyle kanallar hafifçe sallanırsa, bu doğruluğun elde edilemeyeceğine dikkat edilmelidir (Şekil 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Resim 1: TOM-CC izolasyonu. (A) N. crassa TOM-CC30,39'un kriyo EM yapısı. 6xHis etiketli bir Tom22 içeren bir N. crassa suşundan mitokondri, DDM'de çözündü ve Ni-NTA afinite kromatografisine (B) ve anyon değişim kromatografisine (C) tabi tutuldu. (D) İzole edilmiş TOM-CC'nin SDS-PAGE'i. (E) Saflaştırılmış E. coli OmpF'nin kristal yapısı (PDB, 1OPF) ve (F) SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Resim 2: PMMA oda tertibatının akış şeması. Adım 1: Bir cam kapak, bir agaroz hidrojeli ile spin kaplanır. Adım 2: Spin kaplı kapak kayması, özel yapım bir PMMA mikroskopi odasına monte edilir. Adım 3: PMMA odasının giriş portuna 35 ° C'lik bir sıcak plaka üzerinde ilave düşük erimeli agaroz eklenir. Adım 4: Lipid monokatmanları, bir tampon / yağ arayüzünde (solda) ve agaroz hidrojel / yağ arayüzünde (sağda) sulu damlacıkların etrafında oluşur. Adım 5: Tek tek sulu damlacıklar, iki lipit tek katmanının teması üzerine bir lipit çift katmanı oluşturmak için PMMA odasının kuyucuklarına pipetlenir. Adım 6: DIB membranlarının oluşumu Hofmann modülasyon kontrast mikroskobu ile doğrulanır. Adım 7: Yerleştirilen iyon kanalları ile DİB membranlarının seçilmiş bölgelerinin görüntüleri TIRF mikroskobu ile elde edilir. Yeşil:% 0.75 agaroz; sarı: Ca2+ iyonları içeren% 2.5 agaroz; macenta: lipit/yağ fazı; koyu mavi: Ca2 + duyarlı boya ve protein içeren sulu damlacık tamponu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Şekil 3: Deney düzeneği. (A) Bir PMMA kuyusundaki bir DIB membranının şematik gösterimi. Çift katmanlı, transta Ca2 + duyarlı floresan boya (Fluo-8) kullanılarak zaman içinde bir iyon kanalından Ca2 + -akısının TIRF görüntülemesine izin vermek için% 0.75'lik ultra ince% 0.75'lik bir agaroz filmine dayanır. (B) Ca2 + -akısı, yalnızca cis'den trans'a ozmotik basınç ile kontrol edilir. Bu, hem membrandaki pozisyonun belirlenmesine hem de kanalın açık-kapalı durumuna izin verir. Burada gösterilen kanal, N. crassa mitokondri30'un protein ileten kanalı TOM-CC'dir. (C) Tek bir TOM-CC kanalının yörüngesi. Yeşil: hareketli kanal; sarı: hareket etmeyen kanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Şekil 4: DIB membranlarında TOM-CC ve OmpF'nin görüntülenmesi. (A) Hoffmann modülasyon kontrast mikroskobu ile hidrojel ve damlacık arasındaki çift katmanlı temas alanını gösteren DIB membranı. (B) (A)'daki gibi görüntülenen kırık DIB membranı. Ok, PMMA odasının kenarı. (C) Protein kanalları olmadan TIRF mikroskobu ile görüntülenen DIB membranı. (D) TIRF mikroskobu ile görüntülenen, yeniden yapılandırılmış TOM-CC'li DIB membranı. Beyaz kareler yüksek (SH), orta (SI) ve düşük (SL) yoğunluktaki noktaları işaretler. (E) (A) ile işaretlenmiş üç noktanın floresan yoğunluk profilinin iki boyutlu Gauss fonksiyonlarına takılması, tek tek TOM-CC'lerin ve kanal boyunca Ca2+ akısının konumunu ortaya çıkarır. (F) Yeniden yapılandırılmış OmpF'li DIB membranı. (G) (F) ile işaretlenmiş floresan noktanın Gauss uyumu. İki gözenekli β varilli protein kompleksi TOM-CC'nin aksine, üç gözenekli β namlulu OmpF sadece bir geçirgenlik durumu ortaya çıkarır. Piksel boyutu, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Şekil 5: Kanal aktivitesi TOM-CC'nin yanal hareketliliği ile ilişkilidir. (A) TOM-CC'nin floresan genlik izi (üstte) ve buna karşılık gelen yörüngesi (alt), TOM-CC'nin açık-kapalı kanal aktivitesinin kompleksin yanal membran hareketliliği ile ilişkili olduğunu gösterir. Yörünge üç geçirgenlik durumu gösterir. Yeşil: tamamen açık durum; sarı: ara geçirgenlik durumu; kırmızı: kapalı kanal durumu; kırmızı yıldız: Orta seviyedeki TOM-CC, ortalama konumunun etrafında yaklaşık ±60 nm sallanır. Tamamen açık ve ara durumlardaki floresan sinyallerine dayanan konumsal doğruluklar37, 5 nm ile 10 nm arasında değişmektedir. (B) OmpF'nin floresan genlik izi (üstte) ve buna karşılık gelen yörüngesi (altta). OmpF, hareket halinde veya sıkışmış olmasına bakılmaksızın yalnızca bir yoğunluk seviyesini ortaya çıkarır. Sıkışmış moleküllerin zaman periyotlarına karşılık gelen yörünge segmentleri gri renkle işaretlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Arabellek </td>
			<td colspan="3">Reaktif konsantrasyonları</td>
			<td>Hacim</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, % 0,1 (w/v) n-dodesil-β-D-maltosid (DDM), (v/v) gliserol, 300 mM NaCl ve 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, %0,1 (w/v) DDM, (v/v) gliserol, 1 M Imidazol ve 1 mM PMSF</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, %0,1 (w/v) DDM, %2 (v/v) dimetil sülfoksit (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, %0,1 (w/v) DDM, 1 M KCl, %2 (v/v) dimetil sülfoksit (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Gazdan arındırın ve kullanmadan önce 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: TOM-CC yalıtımı için tampon çözeltileri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Arabellek </td>
			<td colspan="3">Reaktif konsantrasyonları</td>
			<td>Hacim</td>
		</tr><tr><td>LB*</td>
			<td colspan="3">%1 (w/v) tripton, %1 (w/v) NaCl ve %0,5 (w/v) maya ekstraktı</td>
			<td>1100 mL</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2 ve ~ 750 birim DNAse ve 50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">%4 (w/v) sodyum dodesil sülfat (SDS), 2 mM β-merkaptoetanol ve 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">%2 (w/v) SDS, 500 mM NaCl ve 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">%0,5 (w/v) oktil polioksietilen (oktil POE), 1 mM EDTA ve 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Kullanmadan önce sterilize ediniz.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: OmpF izolasyonu için tampon çözeltileri.

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

İyon kanalları biyolojik membranlarda statik değildir. Burada, lateral membran difüzyonu ve iyon kanalı fonksiyonu arasındaki bağlantıyı çözmek için tek moleküllü bir optik yaklaşım sunuyoruz. Bu tekniğin diğer yöntemlere göre temel avantajı, yanal hareketlerine ve işlevlerine müdahale edebilecek proteinlerin floresan olarak etiketlenmesinin gerekli olmamasıdır.Yöntem, serbest veya kısıtlı difüzyonun organizasyon ve fonksiyon için önemli olduğu herhangi bir membran protein kanalına uygulanabilir. Başlamak için, DPhPC stok çözeltisinin 380 mikrolitresini bir cam şişeye aktarın ve lipit oksidasyonunu önlemek için lipit stok çözeltisini argon veya azot gazı ile kaplayın. Lipitlerin çözündüğü organik çözücünün buharlaşmasını veya çözücü spreylerinin şişeden sıçramasını önlemek için mümkün olan en düşük gaz akışını kullanın.Lipit numunesini bir azot akışı altında kurutun ve kalan organik çözücüyü gece boyunca yağsız bir vakum pompası kullanarak vakum altında lipit numunesinden çıkarın. Bir mililitre pipet kullanarak mililitre başına 9,5 miligramlık nihai lipit konsantrasyonuna eşit miktarda hekzadekan ve silikon yağı ekleyerek lipit filmini bir hekzadekan silikon yağı çözeltisi içinde çözün. Bazı cam kapakları paslanmaz çelik bir kapak tutucusuna yerleştirin ve ultrasonik bir temizleyicide asetonla yaklaşık 10 dakika boyunca bir cam beherde temizleyin.Kapakları çift deiyonize suyla durulayın ve bir azot akışı altında kurutun. Ayrıca, bir plazma temizleyicideki bir kapağı beş dakika boyunca oksijenle temizleyin ve hidrofilize edin. Bir spin kaplayıcı üzerine plazma ile işlenmiş bir kapak kayması takın ve 30 saniye boyunca 3.000 RPM'de 200 mikrolitrelik bir pipet ile 140 mikrolitre ısıtılmış% 0.75 düşük erime eriyen agaroz yavaşça ekleyerek kapak kaymasını mikrometre altı kalınlıkta bir agaroz filmi ile kaplayın.Spin kaplı kapak kaymasını, agaroz hidrojelinin ince tabakası ile derhal PMMA odasının alt tarafına takın. Agaroz hidrojelinin yukarı doğru işaret ettiğinden emin olun. Kapak kaymasının kenarlarını şeffaf yapışkan bantla PMMA mikro işlenmiş cihaza sabitleyin ve cihazı 35 santigrat dereceye ısıtılmış bir sıcak plakaya yerleştirin.Hava kabarcıkları oluşturmadan odanın girişine 200 mikrolitre% 2.5 agaroz çözeltisini dikkatlice dökün. PMMA odasının kuyularında spin kaplı agarozun dehidrasyonunu önlemek için agaroz yağı arayüzünde lipit tek katmanlı oluşumu başlatmak için PMMA odasının kuyularını derhal yaklaşık 60 mikrolitre lipit yağı çözeltisi ile örtün. Cihazı yaklaşık iki saat boyunca 35 santigrat derecede bir sıcak plakaya yerleştirin.Bir damlacık inkübasyon odasındaki birkaç mikrofabrikasyon kuyucuğun her birine yaklaşık 20 mikrolitre lipid hekzadekan silikon yağı çözeltisi yerleştirin. Dikey veya yatay bir mikropipet çektirici kullanarak uç açma çapı yaklaşık 20 mikrometre olan bir mikrokapiler cam iğne hazırlayın. İğneyi 8.8 milimolar HEPES, yedi mikromolar floresan boya, Fluo-8, 400 mikromolar EDTA, 1.32 molar potasyum klorür ve 30 nanomolar TOM çekirdek kompleksi veya alternatif olarak 20 nanomolar OMPF içeren yaklaşık beş mikrolitre sulu enjeksiyon çözeltisi ile doldurun.İğneyi piezo tahrikli bir nanoenjektör üzerine sulu enjeksiyon çözeltisi ile monte edin ve nanoenjektör kullanarak lipit hekzadekan silikon yağı çözeltisi ile doldurulmuş damlacık inkübasyon odasındaki kuyucuklara 100 ila 200 nanolitre sulu damlacık enjekte edin. PMMA ve damlacık inkübasyon odalarını 35 santigrat dereceye ısıtılmış bir sıcak plaka üzerinde tutarak damlacık yağı arayüzünde yaklaşık iki saat boyunca bir lipit tek tabakasının oluşumuna izin verin. Tek kullanımlık polipropilen uçlu tek kanallı bir mikrolitre pipet kullanarak damlacık inkübasyon odasının kuyucuklarından PMMA odasının kuyucuklarına tek tek sulu damlacıkları manuel olarak aktarın.Damlacıkların, damlacıklar ve agaroz hidrojeli arasında bir lipit çift katmanı oluşturmak için hidrojel-yağ arayüzlerindeki lipit monokatmanlarına batmasına izin verin. PMMA odasını, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobunun numune tutucusuna damlacık arayüzü çift katmanlı veya DIB membranları ile monte edin ve 10x Hoffman modülasyon kontrast hedefi kullanarak membran oluşumunu değerlendirin. DIB membranları oluşmuşsa, PMMA odasını, epifloresan aydınlatması için geleneksel bir ışık kaynağı, 488 nanometre lazer ve yaklaşık 0.16 mikrometrelik bir piksel boyutu elde etmek için arkadan aydınlatmalı elektron çarpan CCD kamera ile donatılmış bir TIRF mikroskobunun numune tutucusuna monte edin.GFP filtre seti kullanarak yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağı ile epifloresan aydınlatma altında 10x büyütme hedefine sahip bir DIB membranının kenarına odaklanın. DIB membranının aynı kenarını 100x NA 1.49 apokromatik yağ TIRF hedefi ile yüksek büyütmede, yine GFP filtre seti kullanarak yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağı ile epifloresan aydınlatma altında ince odaklayın. Filtre ayarını GFP'den dört bantlı TIRF filtre setine değiştirin, 488 nanometre lazeri açın ve lazerin yoğunluğunu objektif lenste ayarlayın.Tek iyon kanallarını görselleştirmek için TIRF açısını ve EM CCD kamera kazancını, DIB membranındaki açık iyon kanallarının koyu bir arka plan üzerinde yüksek kontrastlı floresan lekeler olarak görünmesi ve sinyal-arka plan oranının maksimuma ulaşması için ayarlayın. Tek iyon kanallarından kalsiyum iyon akışına karşılık gelen noktaların odakta kalmasını ve merkezde yüksek yoğunluklu yuvarlak bir şekle sahip olmasını ve çevreye doğru kademeli olarak azalmasını sağlayın. İyon kanallarının DIB membranlarına yeniden oluştuğundan ve membran düzleminde yanal olarak hareket ettiğinden emin olmak için floresan noktaların odakta olup olmadığını kontrol edin.Son olarak, konumun düzgün bir şekilde izlenmesini ve bireysel iyon kanallarının açık-kapalı durumunun izlenmesini sağlayan bir dizi membran görüntüsü kaydedin. Yanal hareketliliğin tipini ve kanal aktivitesinin durumunu belirlemek için, yeterince uzun ve iyi örneklenmiş yörüngeler elde edin. Burada Neurospora crassa TOM-CC'nin kriyo EM yapısı gösterilmiştir.6-His etiketli bir TOM 22 içeren bir N.crassa boyasından mitokondri, DDM'de çözündü ve nikel NTA afinite kromatografisine ve anyon değişim kromatografisine tabi tutuldu. Burada karşılaştırma için kullanılan izole TOM-CC kristal yapısının SDS-PAGE ve saflaştırılmış E.coli OMPF'nin SDS-PAGE gösterilmiştir. TOM-CC'nin karşılık gelen yörüngesindeki floresan genlik izi, TOM-CC'nin açık-kapalı kanal aktivitesinin kompleksin yanal membran hareketliliği ile ilişkili olduğunu göstermektedir.Genlik izi üç geçirgenlik durumu görüntüler: hareketli kanallara karşılık gelen tamamen açık durum, ara geçirgenlik durumu ve hareket etmeyen kanallara karşılık gelen kapalı kanal durumu. Ara durumdaki TOM-CC, ortalama konumunun etrafında yaklaşık artı / eksi 60 nanometre sallanır. OMPF'nin karşılık gelen yörüngesindeki floresan genlik izi burada gösterilmiştir.OMPF, hareket halinde veya sıkışmış olmasına bakılmaksızın TOM-CC'ye kıyasla yalnızca bir yoğunluk seviyesi ortaya çıkarır. Sıkışmış moleküllerin zaman periyotlarına karşılık gelen yörünge segmentleri gri renkle işaretlenmiştir. Dikkat edilmesi gereken önemli bir nokta, bu yöntemin bozulmamış bir membran ortamında tek membran proteinlerini analiz etmesidir.Membran proteinlerinin dinamikleri, öngörülebilir gelecekte bilimsel çalışmalar için bir ufuk olmaya devam edecektir. Yöntemimizin bu alana önemli katkılar sağlamasını bekliyoruz.

single-molecule-imaging-lateral-mobility-ion-channel-activity-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) mikroskopi yakın yüksek kontrast ve zamansal çözünürlükte hücre yüzeyine yapıları gözlemlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Biz TIRF hücre duvarı kapalı bakteriyel ve mantar hücreleri kortekste protein dinamiklerini incelemek için istihdam edilebilir göstermek.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Polarizasyon tabanlı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (pTIRFM) hücre zarı dinamiklerinin gerçek zamanlı algılama sağlar. Bu makalede, düzenlenmiş Ekzositoz sırasında zar yeniden çalışma için pTIRFM uygulanmasını tarif etmektedir. Teknik doğrudan veya dolaylı membran şekil değişiklikleri içeren hücre biyolojisi diğer işlemler için genellenebilir.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin, TIRF mikroskobu ile lipid çift katmanlarında iyon kanallarının yanal mobilitesini ve aktivitesini tek molekül düzeyinde nasıl görüntüleyeceğinizi. Bu yöntem, floresan etiketleme olmadan membran proteinlerinin dinamiklerini incelemenizi sağlar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet