Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

İyon kanalları biyolojik membranlarda statik değildir. Burada, lateral membran difüzyonu ve iyon kanalı fonksiyonu arasındaki bağlantıyı çözmek için tek moleküllü bir optik yaklaşım sunuyoruz. Bu tekniğin diğer yöntemlere göre temel avantajı, yanal hareketlerine ve işlevlerine müdahale edebilecek proteinlerin floresan olarak etiketlenmesinin gerekli olmamasıdır.

Yöntem, serbest veya kısıtlı difüzyonun organizasyon ve fonksiyon için önemli olduğu herhangi bir membran protein kanalına uygulanabilir. Başlamak için, DPhPC stok çözeltisinin 380 mikrolitresini bir cam şişeye aktarın ve lipit oksidasyonunu önlemek için lipit stok çözeltisini argon veya azot gazı ile kaplayın. Lipitlerin çözündüğü organik çözücünün buharlaşmasını veya çözücü spreylerinin şişeden sıçramasını önlemek için mümkün olan en düşük gaz akışını kullanın.

Lipit numunesini bir azot akışı altında kurutun ve kalan organik çözücüyü gece boyunca yağsız bir vakum pompası kullanarak vakum altında lipit numunesinden çıkarın. Bir mililitre pipet kullanarak mililitre başına 9,5 miligramlık nihai lipit konsantrasyonuna eşit miktarda hekzadekan ve silikon yağı ekleyerek lipit filmini bir hekzadekan silikon yağı çözeltisi içinde çözün. Bazı cam kapakları paslanmaz çelik bir kapak tutucusuna yerleştirin ve ultrasonik bir temizleyicide asetonla yaklaşık 10 dakika boyunca bir cam beherde temizleyin.

Kapakları çift deiyonize suyla durulayın ve bir azot akışı altında kurutun. Ayrıca, bir plazma temizleyicideki bir kapağı beş dakika boyunca oksijenle temizleyin ve hidrofilize edin. Bir spin kaplayıcı üzerine plazma ile işlenmiş bir kapak kayması takın ve 30 saniye boyunca 3.000 RPM'de 200 mikrolitrelik bir pipet ile 140 mikrolitre ısıtılmış% 0.75 düşük erime eriyen agaroz yavaşça ekleyerek kapak kaymasını mikrometre altı kalınlıkta bir agaroz filmi ile kaplayın.

Spin kaplı kapak kaymasını, agaroz hidrojelinin ince tabakası ile derhal PMMA odasının alt tarafına takın. Agaroz hidrojelinin yukarı doğru işaret ettiğinden emin olun. Kapak kaymasının kenarlarını şeffaf yapışkan bantla PMMA mikro işlenmiş cihaza sabitleyin ve cihazı 35 santigrat dereceye ısıtılmış bir sıcak plakaya yerleştirin.

Hava kabarcıkları oluşturmadan odanın girişine 200 mikrolitre% 2.5 agaroz çözeltisini dikkatlice dökün. PMMA odasının kuyularında spin kaplı agarozun dehidrasyonunu önlemek için agaroz yağı arayüzünde lipit tek katmanlı oluşumu başlatmak için PMMA odasının kuyularını derhal yaklaşık 60 mikrolitre lipit yağı çözeltisi ile örtün. Cihazı yaklaşık iki saat boyunca 35 santigrat derecede bir sıcak plakaya yerleştirin.

Bir damlacık inkübasyon odasındaki birkaç mikrofabrikasyon kuyucuğun her birine yaklaşık 20 mikrolitre lipid hekzadekan silikon yağı çözeltisi yerleştirin. Dikey veya yatay bir mikropipet çektirici kullanarak uç açma çapı yaklaşık 20 mikrometre olan bir mikrokapiler cam iğne hazırlayın. İğneyi 8.8 milimolar HEPES, yedi mikromolar floresan boya, Fluo-8, 400 mikromolar EDTA, 1.32 molar potasyum klorür ve 30 nanomolar TOM çekirdek kompleksi veya alternatif olarak 20 nanomolar OMPF içeren yaklaşık beş mikrolitre sulu enjeksiyon çözeltisi ile doldurun.

İğneyi piezo tahrikli bir nanoenjektör üzerine sulu enjeksiyon çözeltisi ile monte edin ve nanoenjektör kullanarak lipit hekzadekan silikon yağı çözeltisi ile doldurulmuş damlacık inkübasyon odasındaki kuyucuklara 100 ila 200 nanolitre sulu damlacık enjekte edin. PMMA ve damlacık inkübasyon odalarını 35 santigrat dereceye ısıtılmış bir sıcak plaka üzerinde tutarak damlacık yağı arayüzünde yaklaşık iki saat boyunca bir lipit tek tabakasının oluşumuna izin verin. Tek kullanımlık polipropilen uçlu tek kanallı bir mikrolitre pipet kullanarak damlacık inkübasyon odasının kuyucuklarından PMMA odasının kuyucuklarına tek tek sulu damlacıkları manuel olarak aktarın.

Damlacıkların, damlacıklar ve agaroz hidrojeli arasında bir lipit çift katmanı oluşturmak için hidrojel-yağ arayüzlerindeki lipit monokatmanlarına batmasına izin verin. PMMA odasını, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobunun numune tutucusuna damlacık arayüzü çift katmanlı veya DIB membranları ile monte edin ve 10x Hoffman modülasyon kontrast hedefi kullanarak membran oluşumunu değerlendirin. DIB membranları oluşmuşsa, PMMA odasını, epifloresan aydınlatması için geleneksel bir ışık kaynağı, 488 nanometre lazer ve yaklaşık 0.16 mikrometrelik bir piksel boyutu elde etmek için arkadan aydınlatmalı elektron çarpan CCD kamera ile donatılmış bir TIRF mikroskobunun numune tutucusuna monte edin.

GFP filtre seti kullanarak yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağı ile epifloresan aydınlatma altında 10x büyütme hedefine sahip bir DIB membranının kenarına odaklanın. DIB membranının aynı kenarını 100x NA 1.49 apokromatik yağ TIRF hedefi ile yüksek büyütmede, yine GFP filtre seti kullanarak yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağı ile epifloresan aydınlatma altında ince odaklayın. Filtre ayarını GFP'den dört bantlı TIRF filtre setine değiştirin, 488 nanometre lazeri açın ve lazerin yoğunluğunu objektif lenste ayarlayın.

Tek iyon kanallarını görselleştirmek için TIRF açısını ve EM CCD kamera kazancını, DIB membranındaki açık iyon kanallarının koyu bir arka plan üzerinde yüksek kontrastlı floresan lekeler olarak görünmesi ve sinyal-arka plan oranının maksimuma ulaşması için ayarlayın. Tek iyon kanallarından kalsiyum iyon akışına karşılık gelen noktaların odakta kalmasını ve merkezde yüksek yoğunluklu yuvarlak bir şekle sahip olmasını ve çevreye doğru kademeli olarak azalmasını sağlayın. İyon kanallarının DIB membranlarına yeniden oluştuğundan ve membran düzleminde yanal olarak hareket ettiğinden emin olmak için floresan noktaların odakta olup olmadığını kontrol edin.

Son olarak, konumun düzgün bir şekilde izlenmesini ve bireysel iyon kanallarının açık-kapalı durumunun izlenmesini sağlayan bir dizi membran görüntüsü kaydedin. Yanal hareketliliğin tipini ve kanal aktivitesinin durumunu belirlemek için, yeterince uzun ve iyi örneklenmiş yörüngeler elde edin. Burada Neurospora crassa TOM-CC'nin kriyo EM yapısı gösterilmiştir.

6-His etiketli bir TOM 22 içeren bir N.crassa boyasından mitokondri, DDM'de çözündü ve nikel NTA afinite kromatografisine ve anyon değişim kromatografisine tabi tutuldu. Burada karşılaştırma için kullanılan izole TOM-CC kristal yapısının SDS-PAGE ve saflaştırılmış E.coli OMPF'nin SDS-PAGE gösterilmiştir. TOM-CC'nin karşılık gelen yörüngesindeki floresan genlik izi, TOM-CC'nin açık-kapalı kanal aktivitesinin kompleksin yanal membran hareketliliği ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

Genlik izi üç geçirgenlik durumu görüntüler: hareketli kanallara karşılık gelen tamamen açık durum, ara geçirgenlik durumu ve hareket etmeyen kanallara karşılık gelen kapalı kanal durumu. Ara durumdaki TOM-CC, ortalama konumunun etrafında yaklaşık artı / eksi 60 nanometre sallanır. OMPF'nin karşılık gelen yörüngesindeki floresan genlik izi burada gösterilmiştir.

OMPF, hareket halinde veya sıkışmış olmasına bakılmaksızın TOM-CC'ye kıyasla yalnızca bir yoğunluk seviyesi ortaya çıkarır. Sıkışmış moleküllerin zaman periyotlarına karşılık gelen yörünge segmentleri gri renkle işaretlenmiştir. Dikkat edilmesi gereken önemli bir nokta, bu yöntemin bozulmamış bir membran ortamında tek membran proteinlerini analiz etmesidir.

Membran proteinlerinin dinamikleri, öngörülebilir gelecekte bilimsel çalışmalar için bir ufuk olmaya devam edecektir. Yöntemimizin bu alana önemli katkılar sağlamasını bekliyoruz.