Name: Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, metabolik ekstraselüler akış analizörü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin mitokondriyal solunumunu gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu protokol, sağlık ve hastalık koşullarında hücresel enerji üretimini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UConn Health İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Anthony T. Vella ve Dr. Federica Aglianoin'e metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanma konusundaki eğitimleri için ve UConn Health İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Lynn Puddington'a enstrümanlara verdiği destek için teşekkür ederiz. UConn Tıp Fakültesi'nden Dr. Geneva Hargis'e bu makalenin bilimsel yazımı ve düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (R01HL145454), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (R35GM147713 ve P20GM139763), UConn Health'ten bir başlangıç fonu ve Amerikan İmmünologlar Birliği'nden bir Kariyer yeniden giriş bursu ile desteklenmiştir.

Heparinize edilmiş tam kan örnekleri, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak UConn Health Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandığı gibi, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra sağlıklı insan bağışçılarından alınmıştır. Tüm hayvan deneyleri, UConn Sağlık Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerini izledi ve kemirgenlerin kullanımı için onay, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen kriterlere göre UConn Health IACUC'den alındı. Bu çalışmada 6 haftalıkken erkek C57BL/6 fareler kullanıldı.
1. Metabolik hücre dışı akı testi için 96 delikli plakanın hazırlanması
<ol><li>Metabolik hücre dışı akı testi için özel olarak tasarlanmış 96 delikli plakanın üzerine bir sensör kartuşu yerleştirilmiştir. Kartuşu dikkatlice kaldırarak nemlendirin ve alttaki plakanın her bir kuyucuğuna 200 μL/kuyu kalibrasyon ortamı yerleştirin. Kartuşu, nemlendirmek için gece boyunca CO2 olmayan, nemlendirilmiş, 37 ° C'lik bir inkübatörde kalibrantla plakanın üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Hücre tipine bağlı olarak, hücre yapışmasını sağlamak için kültür plakası için özel bir kaplama kullanın. İnsan nötrofilleri için farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücreleri, 96 delikli plakayı, bir gecede 4 °C'de 50 μL 5 μg / mL saflaştırılmış fare anti-insan CD18 antikoru (Klon TS1/18) içeren steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile kaplar. Fare nötrofilleri için, 96 delikli plakayı 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) pH 8,0'da pH 8,0'da 0,1 M NaHCO3'te 25 μL 22,4 μg / mL Hücre Tak ile kaplayın.</li>
	<li>Plakaları 200 μL steril PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Tohumlama sırasında hücre kültürü plakalarında arka plan düzeltmesi için hücre kültürü plakasının köşe kuyucuklarına (A1, A12, H1 ve H12) tam ortam ekleyin (hücreler olmadan). NOT: Kaplama ve kalibrasyon sırasında buharlaşma, kalibrasyon ortamının hacmini ve normalleşmeyi etkileyebilir. Steril suyla ıslatılmış dokuya sahip bir tepsi veya hazne kullanın ve buharlaşmayı önlemek için plakayı üzerinde kalibrant ile yerleştirin.</li>
</ol>2. Hücrelerin hazırlanması ve tohumlanması
<ol><li>Tahlil ortamının hazırlanması<ol><li>Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerine (DMEM) 1 mM piruvat, 10 mM glikoz ve 2 mM glutamin ekleyerek tahlil ortamı hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare nötrofillerinin kemik iliğinden izolasyonu<ol><li>Üreticinin talimatlarına göre, Fare Nötrofil Zenginleştirme Kitini kullanarak fare nötrofillerini kemik iliğinden izole edin.</li>
		<li>Fareleri intraperitoneal (yani ketamin (125 mg / kg) ve ksilazin (12.5 mg / kg) enjeksiyonu ile anestezi altına alın ve daha sonra fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın.</li>
		<li>Daha önce tarif edildiği gibi femurları ve tibiaları hasatedin 27. Kısaca, bacağı kaslarla açığa çıkarmak için cildi kesin. Bacağı vücuttan çıkarmak için kalça eklemini kesin. Ardından, femur ve tibiayı toplamak için kasları çıkarın.</li>
		<li>Femurların ve tibiaların daha küçük uçlarını kesin. Kesik uçları aşağıda tutarak, altta iki adet 25 G şırınga iğnesi delikli delikli 0,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve 0,5 mL'lik tüpü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin (Şekil 1A). Kemik iliği hücrelerinin kurumasını önlemek için 0,5 mL'lik tüpe 50 μL PBS ekleyin.</li>
		<li>1,5 mL tüpün altındaki kemik iliğini toplamak için RT'de 15 saniye boyunca 5.900 × g'da santrifüj. Kemik iliği hücrelerini 1 mL DMEM ile yeniden askıya alın. Kitten 50 μL sıçan serumu ekleyin, pipetleme ile nazikçe karıştırın ve hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir polistiren kültür test tüpüne aktarın.</li>
		<li>Fare Nötrofil Zenginleştirme Kiti'nden 50 μL zenginleştirme kokteyli ekleyin ve RT'de ×15 dakika boyunca inkübe edin. </li>
		<li>Hücreleri 1 mL DMEM ile tekrar askıya alın, kitten 50 μL biyotin seçim kokteyli ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Kitten 150 μL vorteksli manyetik parçacık ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>~ 1,3 mL DMEM ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın, tüpü mıknatısa 3 dakika boyunca yerleştirin ve orijinal tüpü mıknatısla birlikte ters çevirerek saflaştırılmış fare nötrofilleri içeren süpernatantı yeni bir 5 mL polistiren kültür test tüpüne aktarın.</li>
		<li>RT'de 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı vakum aspirasyonu ile çıkardıktan sonra, hücreleri 1 mL tahlil ortamı ile yeniden askıya alın.</li>
		<li>Bir hemositometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın.</li>
		<li>Tahlil ortamı, hazırlanan 96 delikli plakaya (1.2-1.4 adımları) kuyucuk başına 180 μL fare nötrofil süspansiyonunun (2 × 105 hücre) tohumunu ekleyerek hücre yoğunluğunu 1.1 × 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve plakanın altındaki hücrelerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için plakayı RT'de 300 × g'da frensiz 3 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
		<li>Hücreleri tahlil ortamı ile önceden dengelemek için plakayı CO2 olmayan, nemlendirilmiş, 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li></li><li><li></li><li></li><li><li> </li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64971/64971fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64971/64971fig01large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> <ol><li> <ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64971/64971fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64971/64971fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li> </li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak nötrofillerin mitokondriyal solunumunu ölçen standart prosedür, hücre sayısı, hücre büyümesi ve canlılık gibi birçok faktörle sınırlıdır. Her bileşik konsantrasyonu, bu tahlildeki hücrelerin tipi ve kaynağı arasında değişir. Oligomisin ve rotenon / antimisin A, çoğu hücre tipi arasında çoğunlukla benzer konsantrasyonda kullanılır. Bununla birlikte, FCCP kaynaklı maksimum solunum hızı farklı hücreler arasında değiştiğinden, konsantrasyon42'yi optimize...

Mitokondri, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ile adenozin trifosfat (ATP) üreten hücre biyoenerjetik maddelerinde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, mitokondrinin rolü, reaktif oksijen türlerinin üretilmesi ve detoksifikasyonuna, sitoplazmik ve mitokondriyal matriks kalsiyum regülasyonuna, hücresel senteze, katabolizmaya ve metabolitlerin hücre1 içinde taşınmasına kadar uzanır. Mitokondriyal solunum tüm hücrelerde esastır, çünkü işlev bozuklukları kardiyovasküler hastalıklar3 dahil olmak üzere metabolik sorunlara2 ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu4, Parkinson ve Alzheimer hastalıkları5 ve Charcot-Marie-Tooth hastalığı 2 A (CMT2A)6 gibi çok çeşitli nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir.
Nötrofiller üzerinde yapılan elektron mikroskobik çalışmaları, nispeten az sayıda mitokondri7 olduğunu ve mitokondriyal solunum hızları çok düşük olduğu için enerji üretimi için glikolize büyük ölçüde güvendiklerini ortaya koymuştur8. Bununla birlikte, mitokondri, kemotaksis9 ve apoptoz10,11,12 gibi nötrofil fonksiyonları için çok önemlidir. Önceki bir çalışma, yüksek membran potansiyeline sahip insan nötrofillerinde karmaşık bir mitokondriyal ağ ortaya koymuştur. Mitokondriyal membran potansiyel kaybı, nötrofil apoptozunun erken bir göstergesidir10. Mitokondriyal uncoupler karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) ile tedavi, mitokondriyal morfolojide bir değişiklik ile birlikte kemotaksiste önemli inhibisyon göstermiştir 9,10.
Nötrofiller için birincil enerji kaynağı glikoliz olmasına rağmen, mitokondri, Ca2 + sinyallemesini artıran, mitokondriyal ATP üretimini artıran ve nötrofil fonksiyonel yanıtlarını başlatan pürinerjik sinyallemenin ilk aşamasını besleyerek nötrofil aktivasyonunu başlatan ATP'yi sağlar13. Mitokondriyal solunum zincirinin disfonksiyonu, toksik reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretimine neden olur ve patojenik hasarlara yol açar14,15,16. Nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturma süreci olan NETosis, nötrofillerin patojenlere karşı savaşmalarına yardımcı olan kritik bir özelliktir17 ve kanser, tromboz ve otoimmün bozukluklar18 dahil olmak üzere birçok patolojik duruma katkıda bulunur. Mitokondriyal kaynaklı ROS, NETosis19'a katkıda bulunur, mitokondriyal DNA, NETs18'in bir bileşeni olabilir ve değiştirilmiş mitokondriyal homeostaz, NETosis 20,21,22,23,24'ü bozar. Ayrıca, normal farklılaşma veya olgunlaşma sırasında, nötrofil metabolik yeniden programlama, glikolitik aktiviteyi sınırlayarak tersine döner ve mitokondriyal solunuma katılır ve hücre içi lipitleri harekete geçirir25,26.
Metabolik hücre dışı akı analizörü, canlı hücre mitokondriyal solunumu ve glikolizi sürekli olarak izleyebilir ve ölçebilir. Analizör, oksijen (O2) konsantrasyonunu ve pH değişikliklerini ölçmek için 96 delikli plaka formatlı bir sensör kartuşu ve iki florofor kullanır. Sensör kartuşu, tahlil sırasında hücre tek katmanının üzerindedir ve ~ 200 nm yüksekliğinde bir mikro oda oluşturur. Analizördeki optik fiber demetleri, floroforları uyarmak ve floresan yoğunluğu değişikliklerini tespit etmek için kullanılır. O2 konsantrasyonu ve pH'daki gerçek zamanlı değişiklikler otomatik olarak hesaplanır ve oksijen tüketim oranı (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) olarak gösterilir. Sensör kartuşunda, tahlil ölçümleri sırasında her bir kuyucuğa dört adede kadar bileşiğin yüklenmesine izin veren dört bağlantı noktası vardır. Bu protokol, metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin mitokondriyal solunumunun yanı sıra nötrofil benzeri HL60 hücrelerinin ölçülmesine odaklanır.

<table><tbody><tr><td>37 & derece; C olmayan CO2&nbsp; kuluçka makinesi</td><td>Hassas</td><td>Ekonomi Modeli 2EG</td><td>Enstrüman</td></tr><tr><td>Biorender</td><td></td><td></td><td>Yazılımı Uygulama</td></tr><tr><td>Santrifüjü</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td>Enstrüman</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Cell-Tak Hücre ve Doku Yapıştırıcısı</td><td>Corning</td><td>102416-100</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>EasySep Mıknatıs</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td>Mıknatıs</td></tr><tr><td>EasySepMouse Nötrofil Zenginleştirme kiti</td><td>STEMCELL</td><td>19762A</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 9</td><td></td><td></td><td>Yazılım Uygulaması</td></tr><tr><td>İnsan Serumu Albümin Çözeltisi (%25)</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Ketamin (VetaKet)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-114-10</td><td>Anestezik</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Plaka kovaları</td><td>Eppendorf</td><td>UL155</td><td>Aksesuar</td></tr><tr><td>PolymorphPrep</td><td>PROGEN</td><td>1895 (önceki 1114683)</td> <td>polisakkarit çözeltisi</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış fare anti-insan CD18 antikoru</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td>Klonu TS1/18</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Denizatı metabolik hücre dışı akı analizörü</td><td>Agilent</td><td>XFe96</td><td>Enstrüman Denizatı</td></tr><tr><td>XF Hücre Mito Stres Test Kiti</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>mitokondriyal stres testi Kiti</td></tr><tr><td>Salıncak kovalı rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Vakum Tuzağı 2 Vakum Tuzağı</td><td>Tilki Yaşam Bilimleri</td><td>3052101-FLS</td><td>Enstrüman</td></tr><tr><td>Dalgası</td><td></td><td></td><td>Yazılım Uygulaması</td></tr><tr><td>XF 1.0 M Glikoz Çözeltisi</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>XF 100 mM Piruvat Çözeltisi</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>XF 200 mM Glutamin Çözeltisi</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>XF DMEM ortamı</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>Malzeme</td></tr><tr><td>Ksilazin (AnaSed Enjeksiyonu)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Anestezik</td></tr></tbody></table>

nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Nötrofiller ilk savunma hattıdır ve insanlarda en bol bulunan lökositlerdir. Bu efektör hücreler fagositoz ve oksidatif patlama gibi işlevleri yerine getirir ve mikrobiyal klirens için nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) oluşturur. Nötrofillerin metabolik aktivitelerine ilişkin yeni anlayışlar, öncelikle glikolize dayandıkları erken kavramına meydan okuyor. Metabolik aktivitelerin hassas ölçümü, fizyolojik koşullar altında ve hastalık durumlarında trikarboksilik asit (TCA) döngüsü (Krebs döngüsü olarak da bilinir), oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), pentoz fosfat yolu (PPP) ve yağ asidi oksidasyonu (FAO) dahil olmak üzere nötrofillerin farklı metabolik gereksinimlerini ortaya çıkarabilir. Bu yazıda, fare kemik iliği kaynaklı nötrofiller, insan kanından türetilmiş nötrofiller ve nötrofil benzeri HL60 hücre hattı üzerindeki mitokondriyal solunumun bir göstergesi olarak oksijen tüketim hızını (OCR) ölçmek için adım adım bir protokol ve ön gereksinimler, metabolik bir hücre dışı akı analizörü üzerinde metabolik akı analizi kullanılarak açıklanmaktadır. Bu yöntem, normal ve hastalık koşulları altında nötrofillerin mitokondriyal fonksiyonlarını ölçmek için kullanılabilir.

Fare nötrofillerinin oligomisin, FCCP ve rotenon / antimisin A karışımına (Şekil 3A), insan nötrofillerine (Şekil 3B) ve farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücrelerine (Şekil 3C) yanıt olarak mitokondriyal solunum değişikliklerini gösteren temsili OCR dinamikleri gösterilmiştir. Tüm hücrelerde, oligomisin tedavisi, ATP sentazın proton kanalını inhibe ederek OCR değerini düşürür; FCCP tedavisi, membran potansiyelini korumak ve maksi...

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Bu protokol, fare ve insan nötrofillerinin mitokondriyal solunumunun yanı sıra metabolik hücre dışı akı analizörü kullanılarak nötrofil benzeri HL60 hücrelerinin ölçülmesine odaklanmaktadır. Bu yöntem, normal ve hastalık koşulları altında nötrofillerdeki mitokondriyal fonksiyonu ölçmemizi sağlar. Bu, ilaçlara veya herhangi bir hastalık durumuna yanıt olarak hücrelerin mitokondriyal fonksiyonu hakkında fikir verebilen basit bir tekniktir.Farklı hücreler farklı mitokondriyal solunum verimliliğine sahip olduklarından, yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için hücre tohumlama yoğunluğunun ve reaktif konsantrasyonunun optimizasyonu doğru bir şekilde yapılmalıdır. Metabolik hücre dışı akı testine başlamak için, özel olarak tasarlanmış 96 delikli bir plaka üzerinde paketlenmiş bir sensör kartuşu alın ve altta yatan plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre kalibrasyon ortamı aktarın. Kartuşu ve plakayı calibrant ile dikkatlice kaldırın ve hidrasyon için gece boyunca karbondioksit nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.Daha sonra, hücre tipine bağlı olarak, hücre yapışmasını sağlamak için 96 delikli plakayı belirli bir kaplama ile kaplayın. Daha sonra, plakaları iki kez 200 mikrolitre steril PBS ile yıkayın. DMEM'deki tahlil ortamını bir milimolar piruvat, 10 milimolar glikoz ve iki milimolar glutamin ile hazırlayın.Fare ve insan nötrofil hücrelerini metin el yazmasında açıklandığı gibi tedarik edin. Fareden temin edilen nötrofiller için, tahlil ortamı ekleyerek hücre yoğunluğunu mililitre başına altıncı hücrelere 1.1 kat 10 olarak ayarlayın. Daha sonra hazırlanan 96 delikli plakaya kuyu başına 180 mikrolitre fare nötrofil süspansiyonu tohumlayın.Benzer şekilde, insan nötrofil hücre yoğunluğunu, tahlil ortamını kullanarak mililitre başına altıncı hücrelere 2.2 kat 10'a ayarlayın. Tahlil gününde, hemositometreyi kullanarak nötrofil benzeri HL60 hücrelerini manuel olarak sayın. Daha sonra farklılaşmış veya farklılaşmamış HL60 hücrelerini oda sıcaklığında 300G'de beş dakika boyunca santrifüj edin.Hücreleri DMEM ile bir kez yıkayın ve mililitre başına 1.39 kat 10 ila altıncı hücreler arasında bir hücre yoğunluğu elde etmek için tahlil ortamında tekrar askıya alın. Daha sonra, fare ve insan nötrofil örneklerini içeren önceden hazırlanmış 96 delikli plakaya 180 mikrolitre farklılaştırılmış veya farklılaşmamış HL60 hücresi tohumlayın. Son olarak, tohumlama sırasında arka plan düzeltmesi için hücrelerden yoksun hücre kültürü plakasının köşe kuyucuklarına tam bir ortam ekleyin.Plakanın altındaki hücrelerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında 300G'de üç dakika boyunca ara vermeden santrifüj edin. Son olarak, hücreleri tahlil ortamıyla önceden dengelemek için plakayı bir saat boyunca inkübe edin. Mitokondriyal stres test kitini açın ve reaktifleri üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.Daha sonra, kartuşu, hazırlanan oligomisin ile başlayarak A portuna, FCCP B portuna ve rotenon / antimisin A karışımını enjeksiyonlar için Port C'ye reaktiflerle yükleyin. Kullanılmayan portları 20 mikrolitre tahlil ortamı ile doldurun. Wave yazılımını açıp Isıtıcı Açık sekmesine tıklayarak tahlilden en az beş saat önce tahlil sistemini 37 santigrat derecede dengeleyin.Sıcaklığa ulaştıktan sonra Wave yazılımının sol alt köşesi hazır görünüyor. Yazılımda mitokondriyal stres testi kiti için bir şablon açın. Sol taraftaki enjeksiyon stratejilerini seçin, ardından Ekle'ye tıklayın ve enjeksiyon durumunu insan nötrofilleri veya fare nötrofilleri veya HL60 olarak adlandırın.Her birine tıklayarak A'dan D'ye bağlantı noktasını seçin ve Bileşik Ekle'ye tıklayın ve ilgili konsantrasyonlarla oligomisin veya FCCP veya rotenon / antimisin A'yı girin. Sol taraftaki Ön İşlem'i seçin, ardından Ekle'ye tıklayın ve bunları CD18 ve Hücre Tak'ı ayrı ayrı adlandırın. Sol taraftaki Hücre Türü'nü seçin.Ardından Ekle'ye tıklayın ve bunları insan nötrofilleri, fare nötrofilleri ve HL60 veya DHL60 olarak uygun bir besleme yoğunluğuyla adlandırın. Grup Ekle'ye tıklayarak grupları tanımlayın. Ardından altı çizili tanıma tıklayın.Sol tarafta tanımları olan tüm grupları ve sağda plaka haritasını gözlemlemek için üst menüdeki Plaka Haritası'na tıklayın. Dört köşe kuyucuğunu arka plan olarak korurken her bir kuyucuğu gruba eklemek için sürükleyip bırakın. Protokolü ayarlamak için, üst menüdeki Protokol sekmesini seçin ve karıştırma süresini üç dakika, dinlenme süresini sıfır dakika ve ölçüm süresini yedi dakika olarak ayarlayarak üç döngü taban çizgisi, oligomisin, FCCP, rotenon ve antimisin A karışımı tanımlayın.Testi Çalıştır sayfasına gidin, başvuru için proje özet bilgilerini sağlayın ve Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Dosyaların kaydedileceği konumu verin, böylece tüm sonuçlar tahlilin tamamlanmasından sonra kaydedilir. Ardından tekrar Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın.Tahlilin otomatik olarak yüklenmesinden sonra, sensör kartuşunu ve plakayı 200 mikrolitre calibrant ile yerleştirmek için tepsinin açılmasını bekleyin. Kartuş barkod yönünü sağa bakacak şekilde ayarlayın. Hazırım'ı tıklatarak kalibrasyonu çalıştırın, bu işlem yaklaşık 20 dakika sürer.Kalibrasyondan sonra, Tepsiyi Aç'a tıklayın, plakayı hücre tohumlu plaka ile değiştirin ve tahlile devam etmek için Hazırım'a tıklayın. Testi tamamladıktan sonra, veriler otomatik olarak kaydedilir. Sonuçları bir elektronik tabloya veya başka bir analiz yazılımı dosyasına aktarın.Grafiği çizin ve verileri analiz edin. Oksijen tüketim hızının veya OCR'nin temsili dinamikleri, fare ve insan nötrofillerinde mitokondriyal solunumdaki değişikliklerin yanı sıra, oligomisin, FCCP ve rotenon ve antimisin karışımına yanıt olarak farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücrelerinde değişiklikler olduğunu göstermiştir. FCCP tedavisi, OCR değerini geri kazanmak ve maksimum solunum elde etmek için elektron akışını ve oksijen tüketimini arttırdı.Rotenon ve antimisin A karışımı, elektron taşıma zincirinin 1 ve 3 komplekslerini bloke ederek mitokondriyal solunumun ortadan kaldırılmasına yol açar. Nötrofil yönelimli farklılaşmadan sonra HL60 hücrelerinde azalmış mitokondriyal solunum gözlendi. Diferansiye HL60 hücrelerinin bazal mitokondriyal solunum, proton sızıntısına bağlı solunum, ATP'ye bağlı solunum ve mitokondriyal olmayan solunum ile anlamlı derecede düşük olduğu bulundu.Diferansiye HL60 hücrelerinin maksimal solunumundaki artış önemli değildi, yedek solunum kapasitesi ise önemli ölçüde artmıştı. OCR değerini okurken sensör kartuşunun yüzen hücreler nedeniyle herhangi bir engeli olmaması gerektiğinden, hücrelerin plakanın altında olduğundan emin olun. Bu teknik, araştırmacıların nötrofil ile ilişkili çalışmalarda ilaçların veya mitokondriyal disfonksiyonun etkisini incelemelerine yardımcı olacaktır.

real-time-measurement-mitochondrial-bioenergetic-profile

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon profil için bir yöntem bir açıklaması sağlanmaktadır. Bazal solunum hızı, solunum ATP bağlantılı, proton kaçak ve rezerv kapasitesi: mitokondriyal Profil üretilen bir deneyde ölçülebilir dört parametre mitokondriyal fonksiyon sağlar.

C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

Bu video, hücre dışı akı analizörü kullanarak aktive edilmiş insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasını analiz etme yöntemini göstermektedir. Elektron taşıma zinciri komplekslerinin farklı inhibitörleri, oksijen tüketim oranı veya OCR ile ölçülen ATP sentezini etkiler ve hücresel metabolizma ve biyoenerjetik hakkında bilgi sağlar.

Hücre dışı akı analizörü kullanılarak insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Amacımız mitokondrial disfonksiyon kanser hastalarında yorgunluk ile ilişkili değerlendirmek için pratik bir protokol geliştirmekti. Bu yenilikçi protokol döneminde klinik kullanımı içeren yalnızca standart flebotomi ve Temel Laboratuvar işlemleri için optimize edilmiştir.

Kanserle ilgili yorgunluk mitokondriyal işlev rolünün değerlendirilmesi

Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Metabolik adaptasyon, farklılaşmayı, kalıcılığı ve sitotoksisiteyi belirlediği için T hücreleri için temeldir. Burada, ex vivo sitokin farklılaşmış insan primer T hücrelerinde mitokondriyal solunumu izlemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Sitokin Diferansiye İnsan Primer T Hücrelerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Mitokondriyal ağ son derece karmaşıktır ve analiz edilmesini çok zorlaştırır. Yeni bir MATLAB aracı, hızlandırılmış görüntülerde canlı konfokal görüntülenen mitokondriyi analiz eder, ancak bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmine neden olur. Bu sorunu çözmek için, hızlı dosya analizine olanak tanıyan rutin bir optimizasyon geliştirildi.

İzoforma Özgü Retinoik Asit Reseptörleri ile Canlı Nöronal Mitokondri Homeostaz Modülasyonunun Optimize Edilmiş Otomatik Analizi

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Bağışıklık hücrelerinde fizyolojik olarak ilgili substrat konsantrasyonları altında mitokondriyal biyoenerjetik çalışma yöntemleri sınırlıdır. İnsan T hücrelerinde, monositlerde ve periferik mononükleer hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin enerji talebine tepkisindeki değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri kullanan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan bağışıklık hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyelindeki dinamik değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri

Öğrenin, metabolik ekstraselüler akış analizörü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin mitokondriyal solunumunu gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu protokol, sağlık ve hastalık koşullarında hücresel enerji üretimini değerlendirmeye yardımcı olur.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Daha fazla video keşfet