Hücre Dışı Vezikül Aracılı Vasküler Kalsifikasyonun In Vitro ve In Vivo Modeller Kullanılarak Analizi

Bu protokol, kardiyovasküler hastalığın en önemli belirleyicisi olan vasküler kalsifikasyon için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak ve gelecekte değerlendirmek için kullanılabilecek bir yöntem sağlar. EV'leri izole etme yeteneği, vasküler kalsifikasyona yol açan mekanizmaları ve vasküler düz kas hücrelerinin fenotipik değişimini daha fazla incelememizi sağlar. Bu teknik, vasküler düz kas hücresi aracılı kalsifikasyonun erken moleküler mekanizmaları hakkında fikir vermektedir.

Bunu anlamak, anlaşılan mekanizma için terapötik seçeneklerin incelenmesini sağlar. İlgilenilen herhangi bir EV, bu yöntem kullanılarak incelenebilir. Vasküler düz kas hücresine, osteoblastlara veya vasküler kalsifikasyona özgü değildir.

Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, cımbız kullanarak cildi kaldırın ve orta çizgiden aşağı doğru bir kesi yapın. Fazla cildi veya yağları çıkarın. Daha sonra üreme organlarını, mesaneyi ve orta hattın dışındaki yağları çıkarın.

Daha sonra gastrointestinal organları sağ tarafa taşıyın ve orta hattaki bağırsakları takip edin. Bulunduktan sonra, orta hattı kaldırın ve gastrointestinal sistemi mideye kadar tüketin. Böbrekleri orta hattan uzaklaştırarak tüketin.

Böbreğe mümkün olduğunca yakın kesin. Lobları kaldırarak ve orta hattan keserek karaciğeri çıkarın. Daha sonra 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak sağ ventriküle soğuk PBS enjekte ederek kalbi ve aortu perfüze edin.

Akciğerlerin şişmesini ve beyaza dönmesini bekleyin. Akciğerleri ve fazla diyaframı veya göğüs kafesini çıkarın. Kemiği çıkarmak için, bir çift makas genişliğinde açın ve bunları kuyruğun üzerindeki farenin alt bölgesine yerleştirin.

Aşağı doğru kesin, omurgayı deriden kaldırın ve orta hattın yanlarındaki yağı çıkarın. Cilt ayrıldıktan sonra, kalbin hemen üzerinde keserek omurgayı ve sağlam organları çıkarın. Omurgayı ve bozulmamış organları, bir stereoskopa taşınıyorsa, buz kovasındaki bir PBS kabına yerleştirin.

Omurgayı ve organları diseksiyon kabına taşıdıktan sonra, buz gibi PBS ile doldurun ve iğneleri kullanarak omurgayı ve göğüs kafesini sabitleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, cımbız kullanarak kalbi dikkatlice kaldırın ve omurganın üstünde ve aortun altında kesmeye başlayın. Omurganın dibine ulaşana kadar buna devam edin.

Omurgayı diseksiyon kabından çıkarın ve kalbi ve herhangi bir yabancı yağ veya kası sabitleyin. Kalbin hemen altındaki bölgeden başlayarak, yemek borusu, vena kava ve aortu tanımlayın. Aortun net bir görme alanına sahip olmak için yemek borusunu ve vena kavayı çıkarın.

Mikro diseksiyon forseps ve makas kullanarak, yağ dokusunu kaldırmaya ve aort mümkün olduğunca yakın kesmeye başlayın. Tüm aort ve femoral arterler açığa çıkana kadar medial çizgiden devam edin. Kalpte, aort arkındaki üç dalı açığa çıkaran tüm yağ dokusunu çıkarın.

Mikro diseksiyon makasını sol ventriküle sokarak ve aortu çevreleyen kası keserek aort kökünü sol ventrikülden çıkarın. Aort izole edildikten ve temizlendikten sonra, vasküler kalsifikasyonu görselleştirmek için yakın kızılötesi bir tarayıcı kullanarak aortu görüntüleyin. Özel MATLAB betiğini kullanarak, taranan toplam aort alanına normalleştirilmiş kalsiyum izleyicinin toplam sinyalini sayın.

MATLAB'ı, aortların yakın kızılötesi taramasından TIF dosyalarının konumuna yönlendirin, tek tek dosyaları açın ve TIF dosyalarından piksel yoğunluğu değerlerini ayıklayın. Renk eşlemeli görüntüde maksimum ölçek olarak en büyük kireçlenmeye sahip aortu seçin. Pencerede kaç örnek var, komutu göründüğünde, geçerli görüntüdeki aort sayısını girin ve her bir aortu tek tek seçin.

Bir aort seçildikten sonra, MATLAB toplam alanın ve aortun kalsifiye alanının maskesiyle ikili görüntüler oluşturacaktır. Bu maskelenmiş görüntülerden elde edilen değerler daha sonra toplam kalsifiye alanı, aortun toplam alanını, kalsifikasyon için pozitif olan yüzde alanını ve kalsifiye alanın ortalama yoğunluğunu belirlemek için kullanılır. Aortları taradıktan hemen sonra, yeterli protein konsantrasyonu elde etmek için iki ila üç aort toplayın.

İki ila üç havuzlanmış aortu 1.5 mililitre sindirim çözeltisinde 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin. Çözeltiyi toplayın ve hücre kalıntılarını çıkarmak için 15 dakika boyunca 1.000 g'da santrifüj yapın. Daha sonra, mikro-parçacıkları çıkarmak için, süpernatantı 33.000 g'da 30 dakika boyunca tekrar santrifüj edin.

Kalsifikasyon potansiyeli için süpernatantı toplayın ve değerlendirin. Hücre kalıntılarını santrifüjleme ile şartlandırılmış toplanan ortamdan çıkardıktan sonra, toplanan süpernatantı 30 dakika boyunca 33.000 g'da döndürün. Süpernatantı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.

Daha sonra hücre dışı vezikül örneklerine 300 milimolar sodyum dihidrojen fosfatın% 1'ini ekleyin ve çözeltiyi pipetleme ile karıştırın. Karışım çözeltisinin 200 mikrolitresini 96 delikli bir plakaya aktarın ve 96 delikli plakayı mikroplaka okuyucuda 37 santigrat derecede inkübe edin. Plaka okuyucuyu, absorbansı her bir dakikada bir 340 nanometre dalga boyunda kaydedecek şekilde ayarlayın.

Sekiz delikli bir hazneli camın her bir kuyucuğuna 300 mikrolitre kollajen çözeltisi pipet yerleştirin ve 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kuyucuklara kontrol olarak 300 mikrolitre DMEM ekleyin. Daha önce toplanan hücre dışı vezikül orta örneklerinden 300 mikrolitreyi kalan kuyucuklara ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi altı gün boyunca inkübe edin.

10. günde, OsteoSense ve DMEM'in 2.5 mikrolitrelik pipeti, her bir kuyucuğa karışır ve 24 saat boyunca inkübe edilir. Kuluçkanın sonunda, hidrojelleri OsteoSense floresan filtreli filtrelerle, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak bir kapak camı odasının altından veya uzun bir çalışma mesafesi hedefiyle üstten görüntüleyin. ImageJ'de bulunan parçacık analizi seçeneklerini kullanarak kireçlenme sayısını, kireçlenme boyutunu ve toplanan görüntüleri değerlendirin.

Ardından Görüntü'ye gidin, Ayarla'yı seçin ve görüntüleri yalnızca OsteoSense sinyali beyaz görünecek şekilde ikili hale getirmek için Eşik'i tıklatın. Ardından Analiz Et'i kullanın ve görüntüdeki her kireçlenme için bilgi edinmek üzere Parçacıkları Analiz Et komutunu tıklatın. Analiz edilen her görüntünün tutarlılığı için aynı eşik parametrelerini kullanın.

Diseke edilmiş aortların yakın kızılötesi optik tarayıcı görüntülemesi, kronik böbrek hastalığı olan bir farenin aortu boyunca, kontrol farelerinden gelen iki aorttan daha yüksek bir OsteoSense sinyali gösterdi. Pro-kalsifik bir ortamda kültürlenmiş vasküler düz kas hücrelerinden elde edilen şartlandırılmış ortam, kontrol ortamından 340 nanometrede daha yüksek bir absorbans göstermiştir. Absorbans artışı, pro-kalsifik numunede bir kontrol numunesine kıyasla 1,5 kat daha hızlı gerçekleşti.

Pro-kalsifik koşullarda kültürlenen hücrelerden elde edilen şartlandırılmış ortam, mineral birikintileri içeriyordu. Aortu mikro diseke ederken, aortu çevreleyen yağın dikkatlice kesilmesi önemlidir. Aortun mümkün olduğunca çoğunu analiz etmek istersiniz, ancak bu oldukça sıkıcı olabilir.

EV'ler izole edildikten sonra, alkali fosfataz aktivite testi veya immün cisim gibi ek testler tamamlanabilir. Bu testler ayrıca EV'lerde bulunan mekanizmaları ve proteinleri gösterecektir.