Name: Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinin Asimetrik Bölünmesi Sırasında Çentik / Delta Endositozunu İzlemek için Antikor Alım Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Keşfedin zebra balığı embriyonik beyninde radyal glia progenitörlerinde Notch/DeltaD endositozunu görüntülemek için antikor alım testi. Bu yöntem, sinir gelişimindeki hücre kaderi belirlenmesini incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Proje, NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Tohum İnovasyon Ödülü ve Chan Zuckerberg Biohub tarafından desteklendi.

Çalışma için AB vahşi tip çizgisini ve transgenik çizgi Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] kullanılmıştır. Tüm hayvan deneyleri, Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco, ABD'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (Onay Numarası: AN179000).
1. Zebra balığı embriyolarının hazırlanması
<ol><li>Öğleden sonra saat 17:00'den önce, her tankta ayırmak için bölücüler kullanarak bir dişi vahşi tip balık ve bir erkek Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] balığı ile balık geçiş tankları kurun.</li>
	<li>Ertesi sabah saat 11:00'den önce bölücüleri tüm geçiş tanklarından çıkarın. Sessiz olun ve çiftleşirken balıkları rahatsız etmeyin. Yumurtlama tipik olarak bölücüleri çıkardıktan sonra 30 dakika içinde gerçekleşir. Döllenmiş yumurtalar tankın dibinde kalır.<ol><li>Döllenmiş yumurtaları bir ağ filtresi ile tanklardan toplayın. Yumurtaları yumurta suyuyla dolu bir Petri kabına yıkayarak aktarın ve embriyoları diseksiyon mikroskobu altında 10x ila 20x büyütmede inceleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Döllenmiş embriyoları, büyük delikli cam Pasteur pipetlerle yaklaşık 20 mL embriyo ortamı (100 mL 1.000x stok çözeltisi 29.4 g NaCl, 1.27 g KCl, 4.85 g CaCl 2.2H 2 O ve 8.13 g MgSO4.7H 2O içerir) içeren temiz bir Petri kabına aktarın. Embriyoları 28 °C'de tutun. Petri kabı başına 50 döllenmiş embriyoyu, 28.5 ° C'de 30 mL embriyo ortamı ile tutun. NOT: Bir çift balık normalde 100-300 embriyo üretir ve sağlıklı embriyoların döllenme ve hayatta kalma oranı her çiftleşme için% 95'in üzerindedir.</li>
	<li>Ertesi sabah, embriyolar döllenme sonrası ~ 18-20 saatlik (hpf) gelişim aşamasına ulaştığında, embriyoları sabah 8: 00'de inkübatörden çıkarın. Onları ilk başta beyaz ışık kullanarak 20x büyütmede bir epifloresan mikroskobu altında gözlemleyin. O zaman, zebra balığı embriyoları 20 somit aşamasındadır.<ol><li>Bulutlu veya yırtılmış ölü embriyoları mikroskop altında bir cam pipet kullanarak atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan lambayı açın ve mikroskobun RFP filtre ayarını seçin. Ardından, güçlü kırmızı floresansı olan embriyoları seçin ve yumurta suyuyla yeni bir kaba aktarın.<ol><li>Embriyoları beyaz ışık altında iki ince forseps (forseps uçları keskin ve hasarsız olmalıdır) ile manuel olarak dekoryonlayın (Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Koryonu bir çift forseps ile tutun ve diğer forsepslerle koryonda bir yırtılma yapın. Forsepsleri kullanarak gözyaşını dikkatlice açın ve embriyoyu diğer forsepslerin uçlarıyla hafifçe iterek embriyonun geçmesi için yeterince büyütün.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroenjeksiyondan önce hızlı bir durulama için dekoryonlanmış embriyoları taze embriyonik ortama sahip yeni bir Petri kabına aktarın.</li>
</ol>2. Mikroenjeksiyonun hazırlanması
<ol><li>Bir çektirme üzerine ince enjeksiyon iğneleri çekmek için kılcal damarları (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, filamentli) kullanın. Çekme programını el kitabına göre tasarlayın ve optimize edin.</li>
	<li>İğnenin ucunu stereo diseksiyon mikroskobu altında forseps ile açın. Ucun çapını 10 μm civarında ve konik açısını 30° civarında yapın.</li>
	<li>Enjeksiyondan önce fare monoklonal anti-Dld antikorunu anti-Mouse-IgG-Atto647N ile konjuge edin.<ol><li>Her enjeksiyon deneyi için, 5-10 kez pipetleme yaparak 0,5 μL anti-Dld antikoru (0,5 mg/mL) ile 2 μL anti-Mouse-IgG-Atto647N antikoru (1 mg/mL) karıştırın. Ardından, oda sıcaklığında en az 30 dakika (veya 2-3 saat boyunca buz üzerinde) inkübe edin.</li>
		<li>İnkübasyondan sonra, antikor karışımına 2,5 μL bloke edici tampon (10 mg/mL fare IgG) ve 0,5 μL% 0,5 fenol kırmızısı ekleyin ve karışımda kalan konjuge edilmemiş antikorları bloke etmek için iyice karıştırmak için 10x pipet ekleyin. NOT: Her deneme için, anti-Dld antikoru olmadan ekstra bir karışım hazırlayın ve kontrol olarak kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyo ortamında% 1 düşük erime noktası agarozu hazırlayın. Agaroz içeren karışımı, karışım şeffaflaşana kadar 70 ° C'de ısıtın.<ol><li>2 mL mikrosantrifüj tüplerinde agaroz çözeltisini aliquot. Alikotları ~ 40 ° C'de bir ısı bloğunda tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyoyu% 1 düşük erime noktası agaroz içeren tüpte 3 saniye boyunca durulayın.</li>
	<li>Embriyoyu, Şekil 1'de gösterildiği gibi her embriyoyu ayrı ayrı kapağa monte etmek için ayrı ayrı agaroz damlaları (~ 30-40 μL) ile birlikte ters çevrilmiş plastik bir Petri kabı kapağına yerleştirin. Embriyoları agarozun içine yanal olarak düz bir şekilde yerleştirin ve agaroz oda sıcaklığında katılaşana kadar bu pozisyonu koruyun.</li>
	<li>12 embriyoyu yukarıdaki gibi birer birer üç sıraya monte edin. Agarozdaki tüm monte edilmiş embriyoları yumurta ortamı ile örtün.</li>
</ol>3. Mikroenjeksiyon
<ol><li>Gömülü embriyoları stereomikroskop altına koyun ve agarozu yumurta suyuyla örtün.</li>
	<li>Hava basıncı enjektörünü mikromanipülatörlerle birlikte ayarlayın ve Şekil 1'de gösterildiği gibi mikroskoplara yakın yerleştirin. Hava kaynağı olarak yüksek basınç altında gaz halinde azot (N2) içeren çelik gaz tüpünü kullanın.<ol><li>Gaz valfini ancak embriyolar agaroza monte edildikten sonra açın. Daha sonra, mikroenjektörün ön doldurma modülünü kullanırken, hazırlanan cam iğneyi, Şekil 1'de gösterildiği gibi, mikromanipülatöre 2 μL antikor karışımı ile önden yükleyin.</li>
		<li>Giriş basıncını ~80-90 psi'ye ve enjeksiyon basıncını ~20 psi'ye ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi mikroskop altında bir mikrometre kullanarak enjeksiyon hacmini kalibre edin15. İğne açıklığının boyutuna göre ayar süresini 10 ms ile 120 ms arasında olacak şekilde ayarlayın. Küreğe dokunarak her enjeksiyon darbesini iletin. Her teslimatın enjeksiyon hacmini ~ 4-5 nL'ye ayarlayın.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu arka beynin arka çatı plakasından r0/r1 menteşe noktasına doğru dürtün ve beyin dokusuna çarpmadan yaklaşık 10 nL (iki veya üç darbe) antikor karışımı enjekte edin. Beyin ventrikülündeki kırmızı sıvıların akışını gözlemleyin. NOT: Arka beyin ventrikülü, orta beyin arka beyin sınırının arkasındadır. Enjekte edilen fenol kırmızısı içeren antikor karışımı, beyin omurilik sıvısı ile yayılarak beyin ventrikülünü arka beyinden ön beyne hemen doldurur.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra, mikromanipülatörün düğmesini döndürerek iğnenin ucunu embriyodan hızlı bir şekilde çıkarın. Başarılı bir enjeksiyon için, enjekte edilen karışımın kırmızı boyası, etraftaki agaroza sızmadan beyin ventrikülünde stabil bir şekilde kalır.</li>
	<li>Montaj plakasını mikroskop altında hareket ettirerek başka bir monte edilmiş embriyoyu tekrarlar için uygun bir konumda bulun.<ol><li>Altı ila sekiz embriyo enjekte ettikten sonra, embriyoları gömülü agarozdan serbest bırakmak için agarozu mikrocerrahi bir bıçakla soyun. Mikroenjeksiyonlu embriyoları 30 mL embriyo ortamına sahip taze bir kaba aktarın ve sonraki adımlar için oda sıcaklığına yerleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Montaj ve hızlandırılmış canlı görüntüleme
<ol><li>30 dakika sonra, seçilen embriyoları 10 mL embriyo ortamına aktarın. Embriyoları uyuşturmak için 10 mL embriyo ortamına 420 μL trikain stoğu (4 mg / mL) ekleyin.</li>
	<li>Embriyoları monte etmek için, tüpte aynı konsantrasyonda trikain içeren% 0.8 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Alikotları ~ 40 ° C'de bir ısı bloğunda tutun.</li>
	<li>Enjekte edilen embriyoları 3 s boyunca sıcak agaroza batırmak için bir cam pipet kullanın. Daha sonra, embriyoları hemen aynı cam pipetle agarozdan çıkarın ve embriyoları tüpten bir damla agaroz ile 35 mm cam tabanlı kültür kaplarının ortasına yerleştirin. Camın üzerine damla başına sadece bir embriyo yerleştirin.</li>
	<li>Embriyonik beynin dorsal tarafını cam tabana mümkün olduğunca yakın tutmak için embriyoları bir lif probu veya yükleme ucu ile nazikçe yönlendirin. Agaroz yavaş yavaş katılaştıkça embriyoyu kıvrılmadan uzatmak için embriyo pozisyonunu yavaşça ayarlayın.</li>
	<li>Daha sonra, cam alt kabı ters çevirerek embriyo pozisyonunu kontrol edin. Doğru şekilde monte edilmiş embriyolara sahip tüm dorsal ön beynin mikroskop altında görülebildiğinden emin olun.</li>
	<li>Embriyoyu örtmek için trikain içeren 28.5 °C önceden ısıtılmış embriyonik ortamdan 2-3 mL ekleyin. Çanağı, Şekil 1'de gösterildiği gibi, konfokal mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına düzgün bir şekilde yerleştirin. Görüntüleme odasının sıcaklığını 28,5 °C'de olacak şekilde ayarlayın. Embriyo artık görüntüleme için hazırdır.</li>
	<li>40x suya daldırma hedefini kullanarak sabit bir zaman aralığıyla hızlandırılmış canlı görüntüleme gerçekleştirin.<ol><li>Görüntüleme ve mikroskop kontrol yazılımını kullanın (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.</li>
		<li>Hücredeki MyR-Tdtomato transgenik zebra balığı ve endozomal anti-Dld-Atto647N'nin membran floresansını görüntülemek için 564 nm ve 647 nm görüntüleme kanallarını seçin (Şekil 1).</li>
		<li>Lazer gücünü her iki kanal için de %30'a ayarlayın. Her kanal için z düzlemi başına 200 ms'lik bir pozlama süresi kullanın.</li>
		<li>Takılan her zebra balığı embriyosu için, toplamda 20 z-düzlemi için 1 μm'lik bir tarama z adımı ve 100 zaman diliminde bir tarama döngüsü kullanın.</li>
		<li>Her tarama döngüsü ile tarama modu arasındaki zaman aralığını 20 sn olarak ayarlayın ve kanal, dilim olarak ayarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li>
<li>Chitnis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChitnis%2C+A+%22Developmental+Dynamics%22">Developmental Dynamics</a>. 235 (4), 886-894 (2006).</li>
<li>Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+during+mitosis+and+notch-dependent+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).</li>
<li>Le Borgne, R., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+endocytosis+makes+delta+signal+better%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: endocytosis makes delta signal better.</a> Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).</li>
<li>Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+endocytosis+is+induced+by+ligand+and+is+required+for+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-1+signalling+requires+ligand-induced+proteolytic+release+of+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain.</a> Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).</li>
<li>Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).</li>
<li>Derivery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+by+spindle+asymmetry+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division.</a> Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).</li>
<li>Matsuda, M., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Notch+determines+endocytosis+of+specific+Delta+ligands+in+zebrafish+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue.</a> Development. 136 (2), 197-206 (2009).</li>
<li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li>
<li>Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralineage+directional+Notch+signaling+regulates+self-renewal+and+differentiation+of+asymmetrically+dividing+radial+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia.</a> Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+engage+cytoplasmic+Par-3+that+recruits+dynein+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division.</a> Science Advances. 7 (24), (2021).</li>
<li>Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+analysis+for+cryosectioned+and+immunostained+tissue+samples+with+or+without+label+retention+expansion+microscopy+%28LR-ExM%29+by+JACoP%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP.</a> Bio-Protocol. 12 (5), 4336(2022).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1218(2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+injection+volume+for+microinjection+of+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Zebra balığı radyal glia progenitörlerinde endozomal Notch / Delta kaçakçılığını yüksek verimlilikle etiketlemek ve görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirdik. Drosophila SOP hücreleri 7,8'de etiketli anti-DeltaD antikorunu izlemek için kullanılan önceki yöntemlerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz konjuge antikordaki numunelerin inkübasyonu yerine mikroenjeksiyon kullanmıştır. Floresan konjuge anti-Dld antikorları arka beyin ventrikülüne mikroenjekte e...

Çentik sinyalizasyonu, metazoalarda1 gelişim sırasında hücre kaderi kararını ve modellemesini kontrol eder ve son çalışmalar, kök hücre bölünmesinde Çentik sinyallemesinin esas olarak endositik kaçakçılığa bağlı olduğunu göstermiştir 2,3. Endositozlu Çentik / Delta, çekirdekteki Çentik sinyallemesini aktive edebilir ve Çentik hedef genlerinin transkripsiyonunu artırabilir 4,5,6. Yönlü Çentik/Delta endozomal kaçakçılığı ilk olarak asimetrik hücre bölünmesi (ACD) sırasında Drosophila duyu organı öncüsü (SOP) hücrelerinde gözlendi ve pIIa'da pIIb 7,8'den daha yüksek bir Notch sinyal aktivitesi ile sonuçlandı. Mitotik SOP hücrelerinde endositik süreci izlemek için anti-Delta ve anti-Notch antikorları ile antikor alım testleri uygulanmıştır. Çentik/DeltaD endozomları, sitokinez sırasında bir kinesin motor proteini ile birlikte merkezi iş miline doğru hareket eder ve hücre bölünmesi 3,8'in son anında asimetrik merkezi milin antiparalel dizisi nedeniyle asimetrik olarak pIIa hücresine translokasyona uğrar. Bu çalışmalar, Drosophila SOP hücrelerinde asimetrik bölünmeyi düzenleyen moleküler mekanizmalara ışık tutmuştur, ancak omurgalı radyal glia progenitörlerinde (RGP'ler) benzer endositik süreçlerin meydana gelip gelmediği belirsizdir.
Ayrıca, omurgalı RGP bölünmesi sırasında asimetrik Çentik / DeltaD sinyallemesini düzenleyen moleküler mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. Zebra balıklarında, Çentik ve Delta'nın etkileşiminin DeltaD ligand9'un endositozunu kolaylaştırdığı bildirilmiştir. DeltaD endositozunun gelişmekte olan omurgalı beynindeki yavru hücrelerin hücre kaderi seçimini etkileyip etkilemediği bilinmemektedir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, floresan olarak konjuge edilmiş anti-DeltaD antikorlarının nöral tüpe enjekte edilmesinin, Sara endozomlarını spesifik olarak nöroepitel hücrelerinde etiketleyebileceğini ve Sara endozomları içeren anti-DeltaD'nin tercihen çoğalan yavru hücrelere ayrıldığını göstermektedir10. Endozomlardan gelen Notch sinyallerinin yavru hücre kaderini düzenleyebileceği öne sürülmüştür. Önceki sonuçlar, gelişmekte olan ön beyindeki zebra balığı RGP hücrelerinin çoğunun ACD'ye maruz kaldığını ve yavru hücre kaderinin belirlenmesinin intralineage Notch / DeltaD sinyallemesine bağlı olduğunu göstermiştir11. Zebra balığı RGP'lerinde soy içi Çentik / DeltaD sinyallemesinin doğasını aydınlatmak için, zebra balığı gelişmekte olan beyinde anti-DeltaD antikor alım testini geliştirdik. Bu protokolü kullanarak, mitotik RGP'lerde DeltaD endositik kaçakçılığının canlı etiketlemesini ve görüntülemesini başarıyla gerçekleştirdik.
Floresan olarak etiketlenmiş anti-DeltaD-antikoru, ön beyin ventrikülü boyunca RGP'lere etkili bir şekilde içselleştirilir. Asimetrik olarak bölünen RGP'ler12,13'te DeltaD endozomlarının yönlü kaçakçılığının keşfedilmesini büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Drosophila notum kültürleri ve zebra balığı omuriliği 10 için geliştirilen önceki antikor alım protokolleriyle karşılaştırıldığında, bu protokol beyin ventrikül hücre tabakasında, özellikle10 nL'den az mikroenjeksiyonlu antikor karışımı ile uzun ömürlü ve yüksek etkili anti-DeltaD etiketlemesi sağlamıştır. Arka beyin ventrikül enjeksiyonu, gelişmekte olan beyinde antikor alım testini uygulamak için çok uygundur, çünkü arka beyin ventrikülü zebra balığı embriyolarında iyi genişlemiş ve erken gelişim aşamasında beyin omurilik sıvısı ile doldurulmuştur14. Antikor karışımını herhangi bir önemli gelişmekte olan dokuya zarar vermeden arka beyin ventrikülüne enjekte ederek, protokol ön beyindeki görüntüleme bölgesine olası hasarı mümkün olduğunca en aza indirmiştir. Enjekte edilen primer antikorun azaltılmış dozu, endojen Delta-Notch sinyallemesine in vivo müdahale etmenin potansiyel yan etkilerinden de kaçınmıştır. Bu protokol, diğer farmakolojik veya genetik bozulmalarla kolayca birleştirilebilir, farklı gelişim aşamalarında kullanılabilir ve muhtemelen yetişkin beynine ve insan pluripotent kök hücre kaynaklı 2D / 3D beyin organoidlerine uyarlanabilir. Birlikte ele alındığında, protokol ACD sırasında Notch sinyal asimetrisinin nasıl ve ne zaman kurulduğunu anlamayı mümkün kılmıştır. Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanmasındaki temel zorluk, spesifik deneysel koşullara dayanarak uygun antikor konsantrasyonlarının hassas bir şekilde verilmesini sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>35mm cam alt kültür kabı&nbsp;</td><td>MatTek şirketi</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>hava basıncı enjektörü&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare-IgG-Atto647N&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal Damarlar, 1,2 mm Dış Çap, 0,9 mm İç Çap, filamentli</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 İplik Diski/Yüksek Hızlı Geniş Alan</td><td>Nikin</td><td>N/A</td><td>Nikon&nbsp; CSU-W1 geniş görüş alanına sahip Ti ters floresan mikroskobu konfokal.</td></tr><tr><td>Dumont Tıbbi Cımbız Stil 5</td><td>Thomas Scientific</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>Alevli-Kahverengi P897 çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>N/A</td><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore 529552</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipülatörler</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>WPI M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-Dld&nbsp;</td><td>Zenon</td><td>Thermofisher</td> Scientific Z25008 NaCl Sigma-Aldrich S3014 Fenol kırmızı Sigma-Aldrich P0290 Stemi 2000'den Abcam AB_1268496 <td></td></tr><tr><td>Fare IgG engelleme tamponu</td><td></td><td></td>;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>UltraPureTM düşük erime noktalı agaroz&nbsp;</td><td>Canlandırıcı</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı radyal glia progenitörlerinin asimetrik bölünmesi sırasında Çentik / delta endositozunu İzlemek için antikor alım testi

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

Farklı kaderlere sahip iki yavru hücre üreten asimetrik hücre bölünmesi (ACD), hücresel çeşitlilik oluşturmak için temeldir. Hem omurgasızların hem de omurgalıların gelişmekte olan organlarında, asimetrik olarak bölünen progenitörler, bir Notchhi kendini yenileyen ve bir Notchlo farklılaştırıcı kızı üretir. Embriyonik zebra balığı beyninde, radyal glia progenitörleri (RGP'ler) - başlıca omurgalı nöral kök hücreleri - çoğunlukla bir RGP ve bir farklılaştırıcı nöron doğurmak için ACD'ye maruz kalırlar. Zebra balığı embriyolarının optik netliği ve kolay erişilebilirliği, ACD sırasında Çentik sinyalizasyonunun asimetrisinin nasıl ve ne zaman kurulduğunu doğrudan görselleştirmek için in vivo hızlandırılmış görüntüleme için idealdir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Notch ligand DeltaD'nin dinamik endositozunun ACD sırasında hücre kaderinin belirlenmesinde çok önemli bir rol oynadığını ve sürecin evrimsel olarak korunmuş polarite düzenleyicisi Par-3 (Pard3 olarak da bilinir) ve dinein motor kompleksi tarafından düzenlendiğini göstermiştir. Mitotik RGP'lerde Notch sinyal endozomlarının in vivo kaçakçılık paternlerini görselleştirmek için, bu antikor alım testini geliştirdik. Tahlil kullanarak, RGP bölünmesi sırasında DeltaD içeren endozomların dinamiğini ortaya çıkardık.

Şekil 2A'da, birincil antikora bağlanmadan Atto647N ile enjekte edilen embriyolar, beyin ventrikülünde arka plan floresansı gösterdi. Hücrelerde çok az yutulmuş floresan partikülü gözlenebilir. Anti-Dld-Atto647N enjekte edilen zebra balığı embriyoları, gelişmekte olan ön beynin çoğu hücresinde büyük miktarlarda içselleştirilmiş floresan parçacıkları gösterdi (Şekil 2A, sağ panel). Mitotik RGP'lere odaklanmak için yakınlaştırdıktan sonra, Şek...

Bu çalışma, embriyonik zebra balığı beyninin radyal glia progenitörlerinin bölünmesinde soy içi Notch / DeltaD sinyalini görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirmektedir.

Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinin Asimetrik Bölünmesi Sırasında Çentik / Delta Endositozunu İzlemek için Antikor Alım Testi

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

Çentik sinyali, metazoanlarda gelişim sırasında sülfat kararını ve desenini kontrol eder. Çentik ligand delta-D'yi etiketlemek ve gelişmekte olan zebra balığı ön beynindeki radyal glia progenitörlerinde endositik trafiğini görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirdik. Zebra balığı gizli beyin ventrikül enjeksiyonu, gelişmekte olan beyin ventriküllerini kaplayan miyototik radyal glia progenitörleri tarafından yüksek verimlilik ve uzun süreli etkilerle seçici Anti-Dld-Atto-647N alımını sağlar.Bu protokol, farklı gelişim aşamalarında kullanılan diğer farmakolojik veya genetik pertürbasyonlarla kolayca birleştirilebilir ve muhtemelen yetişkin beynine ve insan pluripotent kök hücresinden türetilmiş 2D veya 3D beyin organoidlerine uyarlanabilir. Döllenmiş embriyoları ürettikten ve 18 ila 20 saat boyunca inkübe ettikten sonra, inkübatörden çıkarın. Onları bir epifloresan mikroskobu altında, önce beyaz ışık kullanarak 20 kat büyütmede gözlemleyin.Cam pipet kullanarak mikroskop altında bulutlu veya yırtılmış görünen ölü embriyoları atın. Ardından floresan lambayı açın ve mikroskobun RFP filtre ayarını seçin. Güçlü kırmızı floresansı olan embriyoları seçin ve yumurta suyu ile yeni bir kaba aktarın.Şimdi embriyoları beyaz ışık altında iki ince forseps ile manuel olarak dekoryonlayın. Koryonu bir çift forseps ile tutun ve diğer forsepslerle koryonda bir yırtılma yapın. Forsepsleri kullanarak gözyaşını dikkatlice açın ve embriyoyu diğer forsepslerin uçlarıyla hafifçe iterek embriyonun geçmesi için yeterince büyütün.Mikroenjeksiyondan önce hızlı bir durulama için dekoryonlanmış embriyoları taze embriyonik ortama sahip yeni bir Petri kabına aktarın. Bir çektirici üzerine ince enjeksiyon iğneleri çektikten sonra, iğnenin ucunu stereo diseksiyon mikroskobu altında forseps ile açın. Ucun çapını 10 mikrometre civarında ve konik açısını 30 derece civarında yapın.Şimdi 0.5 mikrolitre anti-Dld antikorunu, iki mikrolitre anti fare L G Atto-647N antikoru ile karıştırın, konjuge etmek için beş ila 10 kez pipetleyin ve oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, antikor karışımına 2.5 mikrolitre bloke edici tampon ve 0.5 mikrolitre% 0.5 fenol kırmızısı ekleyin ve karışımda kalan konjuge edilmemiş antikorları bloke etmek için pipetleme ile karıştırılır. Daha sonra, embriyo ortamında% 1 düşük erime noktası agarozu hazırlayın.Agaroz içeren karışımı, karışım şeffaflaşana kadar 70 santigrat derecede ısıtın. Agaroz çözeltisini alıntıladıktan sonra, onları 40 santigrat derecede bir ısı bloğunda tutun. Embriyoyu% 1 düşük erime noktası agaroz içeren tüpte üç saniye boyunca durulayın.Her embriyoyu ayrı ayrı monte etmek için embriyoyu ters çevrilmiş plastik Petri kabı kapağına ayrı ayrı agaroz damlalarıyla yerleştirin. Embriyoları agarozun içine yanal olarak düz bir şekilde yerleştirin ve agaroz oda sıcaklığında katılaşana kadar bu pozisyonu koruyun. Agarozdaki tüm monte edilmiş embriyoları yumurta ortamı ile örtün.Gömülü embriyoları stereo mikroskop altına koyun ve agarozu yumurta suyuyla örtün. Hava basıncı enjektörünü mikro manipülatörlerle ayarlayın ve mikroskoplara yakın yerleştirin. Hava kaynağı olarak yüksek basınç altında gaz halinde azot içeren çelik gaz tüpünü kullanın.Embriyolar agaroza monte edildikten sonra, gaz valfini açın. Mikro enjektörün ön doldurma modülünü kullanırken, hazırlanan cam iğneyi mikro manipülatöre iki mikrolitre antikor karışımı ile önden yükleyin. Şimdi giriş basıncını inç kare başına 80 ila 90 pound ve enjeksiyon basıncını inç kare başına 20 pound olarak ayarlayın.Mikroskop altında bir mikrometre kullanarak enjeksiyon hacmini kalibre edin. Ayar süresi süresini, iğne açıklığının boyutuna göre 10 ila 120 milisaniye arasında ayarlayın. Her enjeksiyon darbesini iletmek için rakete dokunun ve her teslimatın enjeksiyon hacmini dört ila beş nanolitreye ayarlayın.Daha sonra mikro enjeksiyon iğnesinin ucunu arka beynin dorsal çatı plakasından, rondimer sıfır-bir menteşe noktasının arkasından geçirin ve beyin dokusuna çarpmadan yaklaşık 10 nanolitre antikor karışımı enjekte edin. Beyin ventrikülünde kırmızı sıvıların akışı gözlendi. Enjeksiyondan sonra, mikro manipülatörün düğmesini döndürerek iğne ucunu embriyodan hızlı bir şekilde çıkarın.Başarılı bir enjeksiyon için, enjekte edilen karışımın kırmızı boyası, etraftaki agaroza sızmadan beyin ventrikülünde stabil bir şekilde kalır. Montaj plakasını mikroskop altında hareket ettirerek başka bir monte edilmiş embriyoyu tekrarlar için uygun bir konumda bulun. Altı ila sekiz embriyo enjekte ettikten sonra, embriyoları gömülü agarozdan serbest bırakmak için agarozu mikrocerrahi bir bıçakla soyun.Mikro enjekte edilen embriyoları 30 mililitre embriyo ortamına sahip taze bir kaba aktarın ve sonraki adımlar için oda sıcaklığına yerleştirin. 30 dakika sonra, seçilen embriyoları 10 mililitre embriyo ortamına aktarın. Embriyoları monte etmek için, tüpte aynı konsantrasyonda trikan içeren% 0.8 düşük erime noktası agarozu hazırlayın.Enjekte edilen embriyoları üç saniye boyunca sıcak agaroza batırmak için bir cam pipet kullanın. Daha sonra embriyoları hemen aynı cam pipetle agarozdan çıkarın ve embriyoları tüpten bir damla agaroz ile 35 milimetre cam tabanlı kültür kaplarının ortasına yerleştirin. Embriyonik beynin dorsal tarafını cam tabana mümkün olduğunca yakın tutmak için embriyoları bir lif probu veya yükleme ucu ile nazikçe yönlendirin.Agaroz yavaş yavaş katılaştıkça embriyoyu kıvrılmadan uzatmak için embriyo pozisyonunu yavaşça çevirin. Daha sonra, cam alt kabı ters çevirerek embriyo pozisyonunu kontrol edin. Doğru şekilde monte edilmiş embriyolara sahip tüm dorsal ön beynin mikroskop altında görülebildiğinden emin olun.Embriyoyu örtmek için trikan içeren iki ila üç mililitre 28.5 santigrat derece önceden ısıtılmış embriyonik ortam ekleyin. Çanağı konfokal mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına uygun şekilde yerleştirin ve görüntüleme odasının sıcaklığını 28.5 santigrat dereceye ayarlayın. Embriyo artık görüntüleme için hazırdır.Atto-647N enjekte edilen embriyolar beyin ventrikülünde arka plan floresansı gösterdi. Anti-Dld-Atto-647N enjekte edilen zebra balığı embriyoları, gelişmekte olan ön beynin çoğu hücresinde büyük miktarlarda içselleştirilmiş floresan parçacıkları gösterdi. Zaman atlamalı görüntüleme, hücre bölünmesi sırasında hücre içi Anti-Dld-Atto-647N endozomlarının hareketini gösterdi.Çoğu mitotik radyal glia progenitörleri, anti-Dld-Atto-647N endozomlarının iki yavru hücreye anterior veya posterior asimetrik ayrışmasını gösterdi. Asimetri, anafazın sonuna doğru stabilize oldu ve daha sonra kızı hücreler tarafından çentik sinyal endozomlarının asimetrik kalıtımına neden oldu. İğnenin doğru yerde gizli marka ventriküle yerleştirildiğinden emin olun ve mikroenjeksiyon sonrası herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.Çentik delta sinyalizasyonunun etiketlenmesine ek olarak, protokol, hücre dışı alana iyi bir antikor mevcutsa, benzer stratejiler kullanarak diğer membran proteinlerini veya hücre dışı proteinleri etiketlemek için de geçerlidir.

antibody-uptake-assay-for-tracking-notchdelta-endocytosis-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Bu video, zebra balığı radyal glia progenitörlerinde Notch/DeltaD sinyalini görüntülemek için bir antikor alım testini göstermektedir. Agaroza gömülü dekoryonlu zebra balığı embriyolarının monte edilmesini, RGP'ler üzerinde DeltaD ligandlarını hedefleyen bir boya çözeltisinin enjekte edilmesini ve Notch / DeltaD sinyal aktivasyonunu doğrulayan asimetrik hücre bölünmesi için bir floresan mikroskobu altında görüntülemeyi içerir.

Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinde Çentik/DeltaD Sinyalini Görüntülemek için Bir Antikor Alım Testi

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Zebra balığı embriyolarında bulunan düşük bolluktaki endojen reseptörlerin tespiti için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Buna AFLIP adını verdik çünkü reseptörün immünopresipitasyona bağlı ligandı tarafından afinite etiketlemesinden oluşuyor.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Immunolabeling yöntemleri mikrotübüller gelişmekte olan Zebra balığı beyinde farklı nüfus analiz etmek için burada, genel olarak diğer dokulara geçerlidir açıklanmıştır. İlk protokol immunolabeling istikrarlı ve dinamik mikrotübüller için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi özetliyor. İkinci Protokolü görüntü ve doğmakta olan mikrotübüller özellikle ölçmek için bir yöntem sağlar.

Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı

Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Reaktif elektrofilleri ve oksidanları (Z-REX) hedefleyen zebra balığı, reaktif küçük moleküllü sinyalizasyonun araştırılması için kimyasal biyoloji tabanlı bir yöntemdir. Bu teknik, farklı gelişim aşamalarındaki canlı balıklara uygulanabilir. Burada, zebra balığındaki standart tahlilleri sinyal yolu analizi için Z-REX ile birleştiriyoruz.

Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Keşfedin zebra balığı embriyonik beyninde radyal glia progenitörlerinde Notch/DeltaD endositozunu görüntülemek için antikor alım testi. Bu yöntem, sinir gelişimindeki hücre kaderi belirlenmesini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinin Asimetrik Bölünmesi Sırasında Çentik / Delta Endositozunu İzlemek için Antikor Alım Testi (Video) | JoVE Journal

Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinin Asimetrik Bölünmesi Sırasında Çentik / Delta Endositozunu İzlemek için Antikor Alım Testi

Daha fazla video keşfet