Floresan Aktif Çekirdek Ayıklama Kullanarak Yağ Dokuları ile Adiposit-Spesifik ATAC-Seq
17 Mart 2023
Nükleer floresan etiketlemeli transgenik muhabir farelerden izole edilen yağ dokuları ile çekirdek sıralama kullanarak özellikle adipositler üzerinde yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için bir test protokolü sunuyoruz.
ATAC-seq, gen ekspresyon düzenleyici mekanizmalarını anlamak için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, yağ dokusu, büyük lipit içeriği, yüksek mitokondriyal kontaminasyon ve hücresel heterojenite nedeniyle bu tekniği kullanmak zordur. Bu protokolde, adiposit-spesifik ATAC-dizileme, minimal mitokondriyal DNA kontaminasyonu ile yüksek kaliteli veriler üreten floresan ile aktive edilmiş çekirdek sıralama kullanılarak gerçekleştirildi.
Bu yöntem, hücre tipine özgü Cre fare çizgilerinin nükleer etiketleme transgenik muhabir çizgileri ile mevcut olduğu diğer dokularda da kullanılabilir. Çekirdek izolasyonuna, numune başına bir cam Dounce ile cam Dounce homojenizatörlerini buz üzerinde soğutarak başlayın. Ardından, her cam sıçramasına 7 mililitre NPB karışımı ekleyin.
Ardından, cam sıçramasına 50 ila 100 miligram dondurulmuş yağ dokusu yerleştirin ve uzun bir makas çifti kullanarak birkaç küçük parçaya bölün. Tüm örnekler için gevşek bir havaneli ile 10 kez, daha sonra sıkı bir havaneli ile 10 kez inin. Filtrelenmiş homojenatları santrifüjleme için 15 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce içeriği 100 mikrometrelik bir süzgeçten yeni bir 50 mililitrelik tüpe filtreleyin.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet 500 mikrolitre PBS-N'de hafifçe ama tam bir parmak dokunuşuyla tekrar askıya alın. Daha sonra, süspansiyonu 40 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin ve süzgeci 250 mikrolitre PBS-N ile durulayın. Filtrelenmiş nükleer süspansiyonu, bir mikropipet kullanarak floresanla aktive edilmiş bir hücre ayıklamasına veya FACS tüpüne aktarın.
Yeni 1,5 mililitrelik tüpe 500 mikrolitre PBS-N ekleyerek toplama tüpünü hazırlayın ve tüm iç yüzeyleri tamponla ıslatmak için birkaç kez ters çevirin. Sıralamaya kadar buza yerleştirmeden önce tüm sıvıyı aşağı çekmek için tüpleri kısaca döndürün. FACS için, tekliler için FSC-A/FSC-H geçidini ve küçük veya büyük enkaz kaldırma için FSC-A/SSC-A'yı kullanın.
mCherry / GFP-pozitif adiposit çekirdeği popülasyonu için kapı ve daha önce hazırlanan her toplama tüpünde 10.000 çekirdek toplayın. Ayırma sonrası çekirdek hazırlığı için, her toplama tüpüne 500 mikrolitre PBS-N ekleyin ve toplama tüplerini 200 G'de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj etmeden önce tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Supernatan'ı tamamen çıkarın.
25 mikrolitre Tn5 ana karışımı hazırlamak için, 12.5 mikrolitre 2x etiketleme DNA tamponu veya TD tamponu, 1.25 mikrolitre Tn5 transpozaz veya TDE I enzimi ve 11.25 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu karıştırın. Daha sonra, her çekirdek peletine 25 mikrolitre Tn5 ana karışımı ekleyin ve nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Bir termal karıştırıcı kullanarak 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca 600 RPM'de inkübe edin.
Tn5 çekirdek resuspension karışımının 25 mikrolitresine 25 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek son hacmi 50 mikrolitre haline getirin. Ardından, pH 5.2 ile 250 mikrolitre tampon PB ve 5 mikrolitre 3 M sodyum asetat ekleyin. Karışımı referans verilen kit ile birlikte verilen bir sütuna aktardıktan sonra, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 17.900 G'de santrifüjleyin.
Akışı attıktan sonra, aynı toplama tüpüne bir spin sütunu yerleştirin. Tüpe mutlak etanol içeren 750 mikrolitre tampon PE ekleyin. Kolonu santrifüjleyin, akışı atın ve spin sütununu tekrar aynı toplama tüpüne yerleştirin.
Tüpü santrifüj edin ve toplama borusunu akışla birlikte atın. Transpoze DNA parçalarını büyütmek için, benzersiz bir Ad2 eklemeden PCR ana karışımını hazırlayın. n barkodlama astarı.
PCR'yi çalıştırın. Kantitatif PCR veya qPCR'yi çalıştırın. Amplifikasyon eğrilerini kontrol edin ve maksimumun yaklaşık% 35'ine ulaşan döngü sayısını tahmin ederek ihtiyaç duyulan ek PCR döngülerinin sayısını belirleyin.
PCR reaksiyonunun kalan 45 mikrolitresi için PCR'yi çalıştırmak üzere hesaplamaları kullanın. Daha önceki prosedürleri kullanarak, güçlendirilmiş DNA parçalarını 20 mikrolitre tampon EB ile temizleyin. Salınan DNA'yı yeni bir PCR tüpüne aktarın ve 80 mikrolitre tampon EB ekleyerek hacmi 100 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, 55 mikrolitre SPRI boncuk ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakikalık inkübasyondan sonra, 5 dakika boyunca mini bir manyetik stand üzerinde ayırın.
İşiniz bittiğinde, 150 mikrolitre süpernatantı yeni bir PCR tüpüne aktarın, 95 mikrolitre SPRI boncuğu ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Mini manyetik stand üzerindeki boncukları ayırmadan önce reaksiyonu 5 dakika boyunca inkübe edin. Süpernatantı dikkatlice atın ve boncukları 200 mikrolitre% 70 etanol kullanarak 1 dakika yıkayın.
İki yıkamayı daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, tüpleri 1 dakika boyunca 1000 G'de santrifüj edin. Kalan etanolün pipetini dışarı atın ve peleti kapağı açık bir PCR makinesinde 2 dakika boyunca 37 santigrat derecede kurutun.
Kuruduktan sonra, pipetleme yaparak peleti 20 mikrolitre tampon EB'de tekrar askıya alın ve tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Son kütüphaneyi içeren süpernatantın 18 mikrolitresini yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarmadan önce boncukları mini manyetik standda 5 dakika ayırın. mCherry etiketli ve GFP işaretli adiposit çekirdekleri, bir Adipoq-NuTRAP faresinin yağ dokularından izole edilen diğer hücre tipi çekirdeklerinden ayırt edilebilirdi.
Yağ deposunun tipine bağlı olarak, adiposit fraksiyonlarında eWAT'ta yaklaşık% 50, iWAT'ta% 30 ve BAT'ta% 65 fark gözlenmiştir. 15'ten fazla PCR döngüsü gerektiren numuneler düşük kaliteli numunelere işaret ediyordu. ATAC-seq kütüphanelerinin boyut dağılımı analizi, nükleozomsuz bölgeye veya NFR'ye ve ortalama boyutları yaklaşık 500 ila 800 baz çifti olan mono, di ve çoklu nükleozomlara karşılık gelen çoklu zirveleri göstermiştir.
Düşük kaliteli örnekler tipik olarak çoğunlukla nükleozomal zirveleri olmayan veya az sayıda NFR gösterdi. qRT-PCR analizi ile yapılan kalite kontrol testleri, Adipoq, Fabp4, Plin1 ve Pnpla2 gibi adiposit marker genlerine yakın pozitif genomik elementlerle 10 ila 20 kat zenginleştirme gösterirken, negatif kontrol ile zenginleştirme gösterilmemiştir. Termojenik gen Ucp1 ile zenginleştirme özellikle BAT'de gözlendi.
Mitokondriyal okumalar% 2'den azdı ve piklerin altındaki fraksiyon yaklaşık% 18 ila% 44 idi Tüm yağ depolarından Adipoq, Fabp4 ve Plin1 gibi adiposit belirteç genlerinin yakınında yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip çoklu güçlü pikler ortaya çıkarıldı. BAT örneğindeki kahverengi adiposit markörü Ucp1 lokusunda güçlü ATAC-seq pikleri gözlendi. Bu protokol için en kritik faktör çekirdek kalitesidir.
Yüksek kaliteli doku örnekleri kullanmak ve deney boyunca, özellikle santrifüjleme ve sıralamadan sonra yeniden süspansiyon sırasında çekirdekleri nazikçe işlemek önemlidir. Bu protokolün nükleer etiketlemeli transgenik muhabir farelere dayandığını hatırlamak önemlidir. NuTRAP fareleri burada kullanıldı, ancak benzer herhangi bir sistem kullanılabilir.
FACS verilerimizle, biyolojik ortamlarda gen ekspresyonunu düzenleyen anahtar transkriptomik faktörleri bulmak için hesaplamalı çoklu analiz yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, çekirdek sıralama kullanarak spesifik olarak adipositler üzerinde ATAC-seq gerçekleştirmek için bir protokol sunar. Yöntem, yüksek kaliteli veriler üretmek için nükleer floresan etiketleme ile izole edilmiş transgenik raporör farelerden elde edilen yağ dokusunu kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Genomik
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- ATAC-seq, gen ekspresyonu düzenleyici mekanizmalarını incelemek için kullanılan bir tekniktir.
- Yağ dokusu, lipid içeriği ve hücresel heterojenlik nedeniyle ATAC-seq için zorluklar sunar.
- Floresan-aktive çekirdek sıralama, mitokondriyal DNA kirliliğini en aza indirmeye yardımcı olur.
- Bu yöntem, spesifik Cre fare hatları ile diğer dokular için uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Adipositleri için güvenilir bir ATAC-seq protokolü geliştirmek.
- Kirliliği azaltarak veri kalitesini artırmak.
- Çeşitli dokulara uygulanabilen bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Transgenik raporör farelerden yağ dokusunun izolasyonu.
- Numune hazırlığı için buz üzerinde soğutulmuş cam Dounce homojenizörlerin kullanılması.
- Çekirdek izolasyonu için spesifik bir NPB karışımının kullanılması.
- Yüksek kaliteli çekirdekler elde etmek için floresan-aktive çekirdek sıralama.
Ana Sonuçlar
- Minimal kirlilik ile adipositlerinden çekirdeklerin başarılı bir şekilde izolasyonu.
- Yağ dokularından yüksek kaliteli ATAC-seq verilerinin üretilmesi.
- Nükleer etiketleme ile diğer hücre tipleri için uyarlanabilir protokol.
- Yöntemin adipositlerde gen düzenlemesini incelemede etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş protokol, adipositleri üzerinde etkin ATAC-seq'e olanak tanır.
- Mitokondriyel kirliliğin en aza indirilmesi veri bütünlüğü için kritiktir.
- Bu yöntem diğer dokulara uzanabilir ve araştırmadaki faydasını artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific ATAC-seq in adipose tissue addresses a critical bottleneck in chromatin accessibility profiling for metabolic disease research and target validation. By enabling high-fidelity isolation of adipocyte nuclei, this protocol reduces confounding signals from cellular heterogeneity and mitochondrial contamination, supporting more predictive and actionable genomic insights. The approach enhances confidence in regulatory element mapping, directly impacting early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of chromatin accessibility in adipocytes, clarifying regulatory mechanisms underlying metabolic pathways.
- Reduces biological ambiguity by isolating pure adipocyte nuclei, supporting robust functional target validation.
- Improves predictive confidence in linking regulatory elements to gene expression changes relevant to disease models.
Screening & Assay Development
- Provides validated, cell-type-specific chromatin profiles for downstream assay development and screening workflows.
- Facilitates reproducible and quantitative assessment of chromatin states, supporting assay standardization.
- Minimizes wasted sequencing reads and reagent use, increasing operational efficiency for high-throughput studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin accessibility data with disease-relevant adipocyte biomarkers, supporting translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by providing high-quality, cell-type-resolved epigenomic data.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanistic links between chromatin state and gene regulation in metabolic tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling cell-type-specific chromatin profiling in adipose tissues, supporting both early target validation and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating regulatory elements active in adipocytes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative chromatin accessibility data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high signal-to-noise readouts and quantitative enrichment at marker loci, enabling robust statistical comparisons.
- Translational Research: Connects chromatin state changes to disease-relevant gene expression, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other tissues with nuclear labeling, extending utility across diverse preclinical models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in regulatory genomics.
- Operational Value: Standardizes cell-type-specific ATAC-seq workflows, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in metabolic disease portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic and obesity-related targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclear isolation, FACS, and ATAC-seq library preparation.
- Demands access to transgenic reporter mouse lines with nuclear labeling capability.
- Relies on high-quality tissue samples and gentle handling to preserve nucleus integrity.
- Needs robust analytical infrastructure for sequencing and downstream bioinformatics.
- Adaptation to other cell types depends on availability of suitable nuclear labeling systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Nucleus Isolation
2:15
Nucleus Sorting and Tn5 Tagmentation
4:08
DNA Purification and PCR Amplification
5:32
Real-Time Quantitative PCR (qPCR) Test, Additional PCR Amplification, and Second DNA Purification
6:14
DNA Fragment Size Selection
8:01
Results: Assay for Transposase-Accessible Chromatin with High-Throughput Sequencing
10:19
Conclusion
