Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

Lakrimal bez organoidleri ile, bazı genlerin lakrimal bez homeostazını nasıl kontrol ettiğine bakılabilir. Ek olarak, organoidler rejeneratif tıp için kullanılabilir. Yetişkin kök hücre kaynaklı lakrimal bez organoid teknolojisinin temel avantajı, sağlıklı ve dönüşmemiş lakrimal bez epitel hücrelerinin büyümesine ve çalışmasına izin vermesidir.

Bu organoidler sonunda kuru göz hastalığı olan hastaları tedavi etmek için kullanılabilir. Deney için gerekli ortamı ve malzemeyi hazırlayarak başlayın, ardından deneyden önce sindirim ortamının tüm bileşenlerini birleştirin. Doku parçalarının yapışmasını önlemek için neşterleri bu ortamda önceden ıslatın.

Fare lakrimal bez dokusunu ortamdan alın, Petri kabına yerleştirin ve önceden ıslatılmış neşterler kullanarak kıyın. Doku parçaları 0,5 milimetreküpten az olduğunda, onları Petri kabından neşterle kazıyın ve sindirim ortamını içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Çok küçük bir insan biyopsisi için, kıyma yapmadan doğrudan sindirim ortamına yerleştirin.

Doku parçalarına sahip 15 mililitrelik tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 15 dakikaya kadar inkübe edin. Bu arada, bir Pasteur pipet ucunu alev içinde daraltın ve taban ortamında önceden ıslatın. Ayrışma işlemini kolaylaştırmak için, kıyılmış karışımı önceden ıslatılmış ve daraltılmış Pasteur pipet ile her beş dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin.

Mikroskop altında birçok tek hücre ve küçük kümeler göründüğünde, baz ortamın 10 mililitresini ekleyerek ayrışmayı durdurun. Beş dakika boyunca 400g'de döndükten sonra, süpernatanı çıkarın ve yıkamayı tekrarlamak ve pelet hücreleri aşağı indirmek için peleti baz ortamın 10 mililitresinde tekrar askıya alın. Büyük, sindirilmemiş doku parçalarını ve kalan kollajen liflerini, kıyılmış karışımı 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirerek çıkarın.

Elüatı beş dakika boyunca 400g'de döndürün. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini tek bir fare lakrimal bezi için 100 mikrolitre soğuk hücre dışı matris veya ECM'de ve kabarcıkları oluşturmadan insan biyopsisi için 50 mikrolitre soğuk ECM'de yeniden askıya alın. Kuyuda yaklaşık 20 mikrolitrelik damlacıklar yapmak için bir P200 kullanarak 12 delikli bir süspansiyon plakasının kuyusu başına 100 mikrolitreye kadar hücre tohumlayın.

ECM katılaşmasına izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre 20 ila 30 dakika boyunca baş aşağı yerleştirin. ECM katılaştıktan sonra, 12 delikli bir plakanın kuyucuğu başına yaklaşık bir mililitre oda sıcaklığında fare genleşme ortamı ekleyin. Taze olarak, lakrimal bez organoidleri tarafından salgılanmayı indükleyen bireysel bileşenler içeren bir mililitre insan farklılaşma ortamı hazırlayın.

Otomatik bir parlak alan hızlandırılmış mikroskopta, plakada görüntülenecek konumları, beş dakikalık zaman aralığını ve dört saatlik süreyi ayarlayın. ECM damlacığının tamamının her konumda görünür olduğundan emin olun. Görüntülemeye başlamadan önce, plakayı mikroskoptan hareket ettirmeden görüntülenecek kuyucuklardan kültür ortamını çıkarın ve forskolin ve noradrenalin de dahil olmak üzere bileşikler içeren taze hazırlanmış, iyi askıya alınmış insan farklılaşma ortamı ile değiştirin.

Negatif bir kontrol olarak, yenilenmiş farklılaşma ortamına sahip bir kuyu ekleyin. Mikroskoptaki çalıştır düğmesine tıklayın ve dört saat sonra sonuçları analiz edin. Organoidleri metinde belirtildiği gibi ayırdıktan sonra, süpernatanı atın.

Hücreleri elektroporasyon tamponunun 80 mikrolitresinde yeniden askıya alın. 1.5 mililitrelik bir tüpte, deney için gerekli plazmidleri hazırlayın. Plazmidleri hücrelere ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.

Elektroporatörü gözenek darbesi ve transfer darbesi parametreleri ile ayarlayın. Hücreleri plazmidlerle birlikte bir elektroporasyon küvetine yerleştirin. 0.3 amper ile 0.55 amper arasında olması gereken direnci hemen ölçün ve hemen elektroporat.

Tamamlandığında, hücreleri 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir Rho-kinaz inhibitörü ile desteklenmiş 400 mikrolitre elektroporasyon tamponu ekleyin. Hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 500g'de pelet yapın.

Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 200 mikrolitre ECM'de plakalayın. Katılaştıktan sonra, fare genişletme ortamını ekleyin. Organoid preparatı için, insan lakrimal bezi organoidlerini nakil gününden yaklaşık üç gün önce bölün.

Organoidleri ECM'den çıkarmak için, mililitre başına 0.125 birimlik nihai bir konsantrasyona ulaşmak için kültür ortamına dispaz ekleyin ve ECM damlacıklarını bir P1000 kullanarak bozmak için iyice askıya alın. Plakayı 30 dakika boyunca 37 derecelik santigrat derece inkübatöre geri yerleştirin. Enzimi yıkamak için organoidleri 10 mililitre baz ortamda tekrar askıya alın.

Hücreleri beş dakika boyunca 400g'de peletledikten sonra,% 5 ECM ile desteklenmiş 50 mikrolitre soğuk insan genleşme ortamında tekrar askıya alın. Organoid süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin. Farelerde ortotopik transplantasyon için, organoid süspansiyonu bir insülin iğnesinde aspire edin.

Fare uyurken, ana lakrimal bezin erişebileceği şekilde hızlı bir şekilde yan tarafına yerleştirin. Organoid süspansiyonun beş mikrolitresini doğrudan deriden lakrimal beze enjekte edin. Farenin iyileşmesine izin verin ve özellikle gözde, günlük olarak transplantasyonla ilgili herhangi bir rahatsızlığın varlığını değerlendirin.

Fare lakrimal bezinin diseksiyonunu takiben, enzimatik ve mekanik sindirim, acini ve kanallar da dahil olmak üzere küçük doku parçaları üretti. Başarılı fare lakrimal bezi organoid türevinde, yedi gün sonra yaklaşık 500 mikrometre çapında kistik organoidler bulundu. İnsan lakrimal bezi organoidleri üç ila dört gün içinde kist olarak büyüdü ve doku izolasyonundan 10 ila 14 gün sonra tam olarak büyümüş bir boyuta ulaştı.

Sırasıyla beş gün ve yedi gün sonra, farklılaşma ortamında, fare ve insan lakrimal bezi organoidleri daha yoğun hale geldi. Siklik AMP aktivatörü forskolin veya nörotransmitter norepinefrin uygulanması, üç saatten kısa sürede organoid şişmesine neden oldu. Başarılı elektroporasyonda, higromisine dirençli organoidler büyüdü.

300 mikrometreden daha büyük büyüyen organoid klonlar, farklılaşmadan önce toplandı. Kılavuz RNA tarafından hedeflenen Pax6 lokusunun PCR amplifikasyonu, seçilen tüm klonlar için 367 baz çifti bandı verdi. Sıralanan altı kişiden bir homozigot nakavt fare lakrimal bezi klonu, Pax6'yı hedefleyen kılavuz RNA kullanılarak elde edildi.

Bazı klonlar iyi büyüdü, ancak bazı organoid klonlar toplandıktan sonra kayboldu veya farklılaşmaya başladı. Seçilen 10 organoid klondan yedisi iyi büyüdü. Organoid engraftman, organoidlerin fare lakrimal bezine enjekte edilmesinden bir ay sonra, insana özgü bir belirteç olan insan nükleolar antijeni için boyanarak doğrulandı.

Dikkat edilmesi gereken bir şey, dokuyu veya organoidleri aşırı sindirmemektir. Aksi takdirde, hücreler ölebilir ve bu organoid kuruluş oranını düşürür. Lakrimal bez organoidleri histoloji ile analiz edilebilir.

Bunu yaparak, hücresel bileşimleri hakkında fikir edinilebilir.