Otomatik Multimodal Stimülasyon ve Birden Çok Küçük Organizmadan Eşzamanlı Nöronal Kayıt

Nöral tepkiler beyin aktivitesi hakkında fikir verir, ancak deneyler ve bireyler arasında değişebilir. Bu protokol, stimülasyon kaydını ve analizini otomatikleştirerek ve farklı uyaran türlerinin ve kalıplarının programlanmasını basitleştirerek yardımcı olur. Otomatik teknik, paralel olarak aynı mikroakışkan formatta birden fazla nöron ve organizma için kayıt yapılmasına izin verir.

Bu, kayıtların tekrarlanabilirliğini artırır ve popülasyonlar arasında nöronal değişkenliğin araştırılmasına izin verir. Adaptasyon ve duyusal entegrasyon gibi sinirsel fenomenleri ortaya çıkarmak için farklı stimülasyon modellerine ihtiyaç vardır. Bu yöntem, hücrelerden ve organoidlerden organizmalara ve bitkilere kadar diğer dinamik sinyallere genellenebilir.

Başlamak için, mikroskobu açın, astar şırıngasını kullanarak hava kabarcıklarını rezervuar borusundan doldurun ve çıkarın, ardından çıkış borusunu tamponla doldurun. Mikroakışkan cihazı vakum kurutucudan çıkarın. Cihazı mikroskop üzerine yerleştirin ve çıkış borusunu hızlı bir şekilde yerleştirin.

Bir girişten bir damlacık çıkana kadar cihaza sıvı enjekte etmek için çıkış şırıngasını yavaşça itin. Bu damlacık ortaya çıkan girişte, karşılık gelen akışkan giriş tüpünü yerleştirmek için bir damla-damla bağlantısı kullanın, böylece bir kabarcık oluşmasını önlemek için hem giriş borusunda hem de cihaz portdeliğinde sıvı damlalarının bulunduğundan emin olun. Bir sonraki giriş tüpünü bir sonraki damlacığa bağlayın.

Gerekirse çıkıştan daha fazla sıvı enjekte edin ve tüm girişler dolana kadar tekrarlayın. Kullanılmayan girişlere ve sonsuz yükleme portuna sağlam bir blokaj pimi takın. Akışın istenen yönde gittiğinden emin olmak için ekrandaki akışı kontrol edin.

Valf kontrolöründeki bir valfi çevirin ve mikroakışkan arenaya akan uyaran akışını gözlemleyin. Akış dengesizse, rezervuar yüksekliklerini ayarlayın. Genç yetişkin hayvanları, bir tel ucu toplama kullanarak tohumlanmamış bir nematod büyüme ortamına veya NGM agar plakasına aktarın, ardından plakayı hayvanların yüzebilmesi için yaklaşık beş mililitre bir XS bazal tamponla doldurun.

Bir XS bazal tamponu ile önceden doldurulmuş ekli boruyu kullanarak solucanları bir ila üç mililitrelik yükleme şırıngasına çekin. Bir stereoskop kullanarak, tüpü bir elinizle sıvı yüzeyin altına istediğiniz her hayvana hareket ettirin ve diğer elinizde tutulan şırıngayı kullanarak boruya çekin. Çıkış anahattını kapatın, solucan yükleme pimini çıkarın ve solucan yükleme şırıngasını bir damladan bırakmaya bağlantı kullanarak cihaza bağlayın.

Sonra hayvanları yavaşça arenaya akıtın. Tampon akışı sağlayın ve tetramisol ile immobilizasyon için bir saate kadar bekleyin. Metin düzenleyicisini kullanarak, userdefinedacquisitionsettings adlı bir uyaran tanımı metin dosyası oluşturun.

Otomatik görüntü alma için stimülasyon ayarlarını içeren TXT. Bu dosya, maruz kalma ve uyarma zamanlaması, deneme süresi, aralıklar ve kaydetme dizini gibi mikroskop edinme parametrelerini tanımlar. Ayrıca deneme türünü ve uyarılma zamanlaması ayarlarını da tanımlar.

Tek bir uyaran deneyi için, yalnızca bir tekrarlanan uyarım komutu içeren bir biçim kullanın. Çok desenli bir deney için, uyaran desenlerinin sırasını temsil eden bir basamak dizisi ekleyerek birden çok stimülasyon komutu içeren bir biçim kullanın. Her desen için ayrı bir satıra bir uyarım komutu girin.

Ardından, mikroskop kontrol yazılımını çalıştırın. Tüm akışkan girişlerin açık olduğunu, akışın arena içinde istendiğini ve ilgilenilen nöronların canlı pencerede odaklandığını doğrulayın. Ardından canlı pencereyi kapatın ve multipatternrunscript betiğini çalıştırın.

Yazılım içinde BSH. Verileri analiz etmek için, sırayla eklentilere tıklayarak, ardından NeuroTracker'ı izleyerek ve ardından NeuroTracker'ı çalıştırarak çalıştırın. İzlenecek tiff video dosyalarını içeren klasörü seçin ve işlenecek dosya aralığını seçin.

Ardından, görüntüyü kullanarak ve menüleri ayarlayarak, parlaklık kontrastını ve eşik kontrol pencerelerini açın. Koyu arka planı kontrol edin ve eşik penceresindeki aralığı sıfırlamayın, eşik yöntemini varsayılan ve görselleştirmeyi kırmızı olarak ayarlayın. Ardından, nöron görünürlüğü için parlaklık kontrastı penceresinde otomatik'e tıklayın.

Parlaklık kontrastı penceresinde, nöronlar açıkça ayırt edilebilene kadar minimum ve maksimum kaydırıcıları ayarlayın. Ardından, tüm nöronlar diğer nesnelerden ayrı küçük kırmızı lekeler olarak görünene kadar eşik seviyesini ayarlayın. Nöron hareketini ve yoğunluk değişikliklerini gözlemlemek için çerçeve kaydırıcısını ayarlayın, diğer hayvanlarla örtüşme nedeniyle izleme dışında bırakılacak hayvanları not edin.

İzleme için nöronları belirledikten sonra, gerekirse her hayvan için eşik seviyesini ayarlayın, böylece nöronun üzerindeki kırmızı eşik alanı her karede görülebilir. Konumunu ve eşik seviyesini kaydetmek için nörona tıklayın. Tüm nöronlar seçildiğinde, izlemeye başlamak için boşluk çubuğuna basın.

Her hayvan için izleme sürecini izleyin ve gerekli düzeltmeleri yapın. NeuroTracker duraklarsa, nöronu kaybetti. Eşik seviyesini gerektiği gibi ayarlayın ve nöronu yeniden tıklayın.

Entegrasyon kutusu yakındaki başka bir hayvana veya nöronal olmayan yapıya atlarsa, duraklatmak için boşluk çubuğuna basın. Kaydırıcıyı ilk hatalı kareye geri getirin ve doğru nöron konumuna yeniden tıklayın. neurotrackersummarypdf dosyasını çalıştırın.

m dosyasını MATLAB'da açın ve NeuroTracker veri metin dosyalarını içeren klasörü seçin. İzleme işleminin doğrulanmasına izin veren bir özet PDF'nin oluşturulmasını bekleyin. Hayvanlar, her bir hayvandan ve denemeden gelen sayılar ve sinirsel tepkilerle tanımlanabilir ve popülasyon değişkenliğini değerlendirmek için görüntülenebilir.

DataBrowse işlevini kullanın. m deneme numarasına, hayvan sayısına, stimülasyon modeline veya başka bir kategoriye göre gruplandırılmış nöral verileri keşfetmek için. Zamansal inhibisyon fenomeni, sıfır ila 20 saniye arasında değişen bir aralıkla ayrılmış iki adet bir saniyelik koku verici darbeden oluşan sekiz desen üreten eşleştirilmiş bir nabız deneyinde test edildi.

İlk bir saniyelik koku darbesi, AWA nöronlarını tespit eden diasetilde eşit bir tepki büyüklüğü ortaya çıkardı ve ikinci nabızdaki tepkiler, uyaranlar arası aralıkla değişti. Disinhibisyon, diasetil uyarana adaptasyonun gözlendiği yakalama denemesi deneyi ile değerlendirildi, ancak yeni 2-metilpirazin uyaranının sunumu güçlü bir disinhibisyon etkisi ortaya çıkarmadı. Test edilen multimodal stimülasyon, kimyasal stimülasyonun tek başına adaptasyona neden olduğunu, optik stimülasyonun tek başına olmadığını ortaya koymuştur.

Bununla birlikte, kombine multimodal uyaran paterni, optojenik yanıtların kimyasal olarak indüklenen adaptasyona duyarlı olduğunu göstermiştir. Mikroakışkan tasarımı iki arena içerecek şekilde değiştirerek, genetik veya diğer pertürbasyonları aynı anda eşleşen bir referansla karşılaştırabiliriz. Kurulduktan sonra, sistem birçok şekilde değiştirilebilir.

Örneğin, kimyasal doz tepkilerini ve uyku ile uyanıklık durumları arasındaki gibi sinirsel aktivitedeki duruma bağlı değişiklikleri otomatik olarak ölçtük.