Otomatik Multimodal Stimülasyon ve Birden Çok Küçük Organizmadan Eşzamanlı Nöronal Kayıt
March 3rd, 2023
Birçok Caenorhabditis elegans solucanından esnek kimyasal ve multimodal stimülasyon ve eşzamanlı nöral aktivitenin kaydedilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, adaptasyon, zamansal inhibisyon ve uyaran çapraz konuşması gibi nöronal fenomenlerin ölçülmesini sağlamak için mikroakışkanlar, açık kaynaklı donanım ve yazılım ve denetimli otomatik veri analizi kullanır.
Nöral tepkiler beyin aktivitesi hakkında fikir verir, ancak deneyler ve bireyler arasında değişebilir. Bu protokol, stimülasyon kaydını ve analizini otomatikleştirerek ve farklı uyaran türlerinin ve kalıplarının programlanmasını basitleştirerek yardımcı olur. Otomatik teknik, paralel olarak aynı mikroakışkan formatta birden fazla nöron ve organizma için kayıt yapılmasına izin verir.
Bu, kayıtların tekrarlanabilirliğini artırır ve popülasyonlar arasında nöronal değişkenliğin araştırılmasına izin verir. Adaptasyon ve duyusal entegrasyon gibi sinirsel fenomenleri ortaya çıkarmak için farklı stimülasyon modellerine ihtiyaç vardır. Bu yöntem, hücrelerden ve organoidlerden organizmalara ve bitkilere kadar diğer dinamik sinyallere genellenebilir.
Başlamak için, mikroskobu açın, astar şırıngasını kullanarak hava kabarcıklarını rezervuar borusundan doldurun ve çıkarın, ardından çıkış borusunu tamponla doldurun. Mikroakışkan cihazı vakum kurutucudan çıkarın. Cihazı mikroskop üzerine yerleştirin ve çıkış borusunu hızlı bir şekilde yerleştirin.
Bir girişten bir damlacık çıkana kadar cihaza sıvı enjekte etmek için çıkış şırıngasını yavaşça itin. Bu damlacık ortaya çıkan girişte, karşılık gelen akışkan giriş tüpünü yerleştirmek için bir damla-damla bağlantısı kullanın, böylece bir kabarcık oluşmasını önlemek için hem giriş borusunda hem de cihaz portdeliğinde sıvı damlalarının bulunduğundan emin olun. Bir sonraki giriş tüpünü bir sonraki damlacığa bağlayın.
Gerekirse çıkıştan daha fazla sıvı enjekte edin ve tüm girişler dolana kadar tekrarlayın. Kullanılmayan girişlere ve sonsuz yükleme portuna sağlam bir blokaj pimi takın. Akışın istenen yönde gittiğinden emin olmak için ekrandaki akışı kontrol edin.
Valf kontrolöründeki bir valfi çevirin ve mikroakışkan arenaya akan uyaran akışını gözlemleyin. Akış dengesizse, rezervuar yüksekliklerini ayarlayın. Genç yetişkin hayvanları, bir tel ucu toplama kullanarak tohumlanmamış bir nematod büyüme ortamına veya NGM agar plakasına aktarın, ardından plakayı hayvanların yüzebilmesi için yaklaşık beş mililitre bir XS bazal tamponla doldurun.
Bir XS bazal tamponu ile önceden doldurulmuş ekli boruyu kullanarak solucanları bir ila üç mililitrelik yükleme şırıngasına çekin. Bir stereoskop kullanarak, tüpü bir elinizle sıvı yüzeyin altına istediğiniz her hayvana hareket ettirin ve diğer elinizde tutulan şırıngayı kullanarak boruya çekin. Çıkış anahattını kapatın, solucan yükleme pimini çıkarın ve solucan yükleme şırıngasını bir damladan bırakmaya bağlantı kullanarak cihaza bağlayın.
Sonra hayvanları yavaşça arenaya akıtın. Tampon akışı sağlayın ve tetramisol ile immobilizasyon için bir saate kadar bekleyin. Metin düzenleyicisini kullanarak, userdefinedacquisitionsettings adlı bir uyaran tanımı metin dosyası oluşturun.
Otomatik görüntü alma için stimülasyon ayarlarını içeren TXT. Bu dosya, maruz kalma ve uyarma zamanlaması, deneme süresi, aralıklar ve kaydetme dizini gibi mikroskop edinme parametrelerini tanımlar. Ayrıca deneme türünü ve uyarılma zamanlaması ayarlarını da tanımlar.
Tek bir uyaran deneyi için, yalnızca bir tekrarlanan uyarım komutu içeren bir biçim kullanın. Çok desenli bir deney için, uyaran desenlerinin sırasını temsil eden bir basamak dizisi ekleyerek birden çok stimülasyon komutu içeren bir biçim kullanın. Her desen için ayrı bir satıra bir uyarım komutu girin.
Ardından, mikroskop kontrol yazılımını çalıştırın. Tüm akışkan girişlerin açık olduğunu, akışın arena içinde istendiğini ve ilgilenilen nöronların canlı pencerede odaklandığını doğrulayın. Ardından canlı pencereyi kapatın ve multipatternrunscript betiğini çalıştırın.
Yazılım içinde BSH. Verileri analiz etmek için, sırayla eklentilere tıklayarak, ardından NeuroTracker'ı izleyerek ve ardından NeuroTracker'ı çalıştırarak çalıştırın. İzlenecek tiff video dosyalarını içeren klasörü seçin ve işlenecek dosya aralığını seçin.
Ardından, görüntüyü kullanarak ve menüleri ayarlayarak, parlaklık kontrastını ve eşik kontrol pencerelerini açın. Koyu arka planı kontrol edin ve eşik penceresindeki aralığı sıfırlamayın, eşik yöntemini varsayılan ve görselleştirmeyi kırmızı olarak ayarlayın. Ardından, nöron görünürlüğü için parlaklık kontrastı penceresinde otomatik'e tıklayın.
Parlaklık kontrastı penceresinde, nöronlar açıkça ayırt edilebilene kadar minimum ve maksimum kaydırıcıları ayarlayın. Ardından, tüm nöronlar diğer nesnelerden ayrı küçük kırmızı lekeler olarak görünene kadar eşik seviyesini ayarlayın. Nöron hareketini ve yoğunluk değişikliklerini gözlemlemek için çerçeve kaydırıcısını ayarlayın, diğer hayvanlarla örtüşme nedeniyle izleme dışında bırakılacak hayvanları not edin.
İzleme için nöronları belirledikten sonra, gerekirse her hayvan için eşik seviyesini ayarlayın, böylece nöronun üzerindeki kırmızı eşik alanı her karede görülebilir. Konumunu ve eşik seviyesini kaydetmek için nörona tıklayın. Tüm nöronlar seçildiğinde, izlemeye başlamak için boşluk çubuğuna basın.
Her hayvan için izleme sürecini izleyin ve gerekli düzeltmeleri yapın. NeuroTracker duraklarsa, nöronu kaybetti. Eşik seviyesini gerektiği gibi ayarlayın ve nöronu yeniden tıklayın.
Entegrasyon kutusu yakındaki başka bir hayvana veya nöronal olmayan yapıya atlarsa, duraklatmak için boşluk çubuğuna basın. Kaydırıcıyı ilk hatalı kareye geri getirin ve doğru nöron konumuna yeniden tıklayın. neurotrackersummarypdf dosyasını çalıştırın.
m dosyasını MATLAB'da açın ve NeuroTracker veri metin dosyalarını içeren klasörü seçin. İzleme işleminin doğrulanmasına izin veren bir özet PDF'nin oluşturulmasını bekleyin. Hayvanlar, her bir hayvandan ve denemeden gelen sayılar ve sinirsel tepkilerle tanımlanabilir ve popülasyon değişkenliğini değerlendirmek için görüntülenebilir.
DataBrowse işlevini kullanın. m deneme numarasına, hayvan sayısına, stimülasyon modeline veya başka bir kategoriye göre gruplandırılmış nöral verileri keşfetmek için. Zamansal inhibisyon fenomeni, sıfır ila 20 saniye arasında değişen bir aralıkla ayrılmış iki adet bir saniyelik koku verici darbeden oluşan sekiz desen üreten eşleştirilmiş bir nabız deneyinde test edildi.
İlk bir saniyelik koku darbesi, AWA nöronlarını tespit eden diasetilde eşit bir tepki büyüklüğü ortaya çıkardı ve ikinci nabızdaki tepkiler, uyaranlar arası aralıkla değişti. Disinhibisyon, diasetil uyarana adaptasyonun gözlendiği yakalama denemesi deneyi ile değerlendirildi, ancak yeni 2-metilpirazin uyaranının sunumu güçlü bir disinhibisyon etkisi ortaya çıkarmadı. Test edilen multimodal stimülasyon, kimyasal stimülasyonun tek başına adaptasyona neden olduğunu, optik stimülasyonun tek başına olmadığını ortaya koymuştur.
Bununla birlikte, kombine multimodal uyaran paterni, optojenik yanıtların kimyasal olarak indüklenen adaptasyona duyarlı olduğunu göstermiştir. Mikroakışkan tasarımı iki arena içerecek şekilde değiştirerek, genetik veya diğer pertürbasyonları aynı anda eşleşen bir referansla karşılaştırabiliriz. Kurulduktan sonra, sistem birçok şekilde değiştirilebilir.
Örneğin, kimyasal doz tepkilerini ve uyku ile uyanıklık durumları arasındaki gibi sinirsel aktivitedeki duruma bağlı değişiklikleri otomatik olarak ölçtük.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, Caenorhabditis elegans'ta kimyasal ve multimodal stimülasyon ve nöral aktivitenin kaydedilmesi için mikroakışkan ve otomatik veri analizi kullanan bir yöntem sunmaktadır. Yaklaşım, birden fazla organizmanın sinyal tepkilerini eşzamanlı olarak ölçerek adaptasyon ve geçici inhibisyon gibi nöronal fenomenlerin incelenmesini sağlar.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Mikroakışkan
- Davranış Analizi
Arka Plan
- Nöral tepkiler beyin aktivitesi hakkında içgörüler sağlar ancak bireyler ve deneyler arasında değişebilir.
- Nöronal kayıtların tekrarlanabilirliğini artıran otomatik yöntemlere ihtiyaç vardır.
- Bu çalışma, stimülasyon programlamasının ve nöronal tepkilerin analizini basitleştirmeye odaklanmaktadır.
- Yöntem, mikroakışkan bir çerçevede çok nöron kaydını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- C. elegans'ta nöral aktivitenin stimülasyonunu, kaydını ve analizinin otomasyonunu sağlamak.
- Popülasyonlar arasındaki nöronal değişkenliği keşfetmek ve veri tekrarlanabilirliğini artırmak.
- Çeşitli stimülasyon paternleri aracılığıyla kritik nöronal fenomenleri ortaya çıkarmak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma, eşzamanlı stimülasyon ve kaydetme için bir mikroakışkan platformu kullanır.
- Nöral mekanizmaları araştırmak için C. elegans'ı biyolojik model olarak kullanır.
- Otomatik teknikler, veri analiz sürecini hızlandırır ve veri bütünlüğünü artırır.
- Kritik adımlar mikroakışkan cihazın hazırlanmasını ve stimülasyon parametrelerinin tanımlanmasını içerir.
- Analiz, nöronal aktiviteyi izlemek ve özetlemek için tasarlanmış yazılım ile gerçekleştirilir.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, çeşitli stimülasyon paternlerine karşı nöronal tepkileri değerlendirmek için güvenilir bir araç sağlar.
- Bulgular, geçici inhibisyonun nöronal aktivitede nasıl tezahür ettiğini göstererek bu işlevselliği destekler.
- Veri analizi, bireysel nöronların ve bu nöronların denemeler arasındaki tepkilerinin izlenmesini sağlar.
- Yaklaşım, duyusal entegrasyon ve adaptasyonun nöronal düzeyde anlaşılmasını artırır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, basit organizmalarda nöral mekanizmaları araştırmak için çok yönlü bir araç oluşturur.
- Otomatik yöntem, popülasyon dinamiklerinin ve nöronal tepkilerin verimli analizini sağlar.
- Bu, stimülasyona yanıt olarak nöronal plastisite ve davranış anlayışı geliştirme açısından önemli çıkarımlarda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Automated multimodal stimulation and parallel neuronal recording in small organisms addresses the challenge of biological variability and throughput in early discovery neuroscience. This platform enables high-content, quantitative assessment of neural function across populations, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking at the target validation stage. Its scalability and flexibility position it as a reusable capability for portfolio-wide interrogation of neural dynamics and adaptation phenomena.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of neural adaptation, inhibition, and sensory integration across multiple individuals.
- Supports functional target validation by quantifying neural responses to diverse, programmable stimuli.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing population-level variability and state-dependent neural dynamics.
- Provides a platform for comparative studies of genetic or pharmacological perturbations in parallel arenas.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, repeatable stimulation protocols for robust assay development.
- Generates quantitative, population-wide neural activity readouts suitable for downstream screening workflows.
- Enables rapid evaluation of compound or genetic effects on neural excitability and adaptation.
- Supports scalable, automated data acquisition and analysis for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Allows exploration of state-dependent neural responses relevant to disease modeling and biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-condition and cross-genotype comparisons.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying functional neural endpoints in relevant biosystems.
Pipeline & Workflow Integration
This automated platform integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of neural circuits and adaptation mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative neural activity assays for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers population-level and single-neuron quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of neural response phenotypes with disease-relevant or state-dependent endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to diverse small biosystems and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes stimulation and recording workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, parallelized data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neural targets and mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence imaging, and neural data analysis.
- Depends on instrumentation for automated microscopy and programmable stimulus delivery.
- Needs cross-team standardization of data acquisition and analysis protocols.
- Adaptable to various small organisms, cells, or organoids with appropriate genetic indicators.
- Manual oversight may be needed for data quality control and tracking adjustments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Microfluidic Device Preparation
2:04
Animal Loading
3:02
Automated Stimulation and Neuronal Recording
4:15
Data Analysis Using NeuroTracker
6:08
Data Exploration and Visualization
6:47
Results: Assessment of Temporal Inhibition, Disinhibition, and Multimodal Stimulation
7:51
Conclusion
