Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

TEM tomografisi hücrelerin görüntülenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak numune kalınlığı açısından çok sınırlıdır. FIB SEM ve yumuşak röntgen tomografisi, daha düşük çözünürlükte de olsa daha büyük numuneler için kullanılabilir. STEM tomografi bu boşluğu mükemmel bir şekilde doldurur.

STEM tomografisi, mikron kalınlığındaki örneklere birkaç nanometre çözünürlükte bir bakış sağlar. Kriyojenik preparat ile kombinasyon, biyolojik örneklere ve bölümlere 3D olarak bakmamızı sağlar. Görüntü oluşumunu anlamak ve servis mühendisinin kök ve Lomax kök modlarını iyi hizaladığından ve kalibrasyon adımlarının videodakilere benzediğinden emin olmak için STEM optiklerinin temellerini gözden geçirin.

Başlamak için sütun hizalama dosyasını yükleyin ve sütun değerlerini açın. Yandan girişli bir kriyo tutucu kullanıyorsanız, kriyo kalkanını açın ve TEM modunda başlayın. Işın ekranda görünmelidir.

Kiriş görünmüyorsa büyütmeyi azaltın. Kontrol panelindeki düğmeye basarak mikroskobu ösentrik odağa getirin. Floresan ekranı doğrudan veya dahili kamerayla görselleştirmek için spot boyutunu uygun bir değere ayarlayın.

Mikroskobu STEM moduna ayarlayın ve odağın amaç yerine kondansatörlü lensleri kullandığını doğrulayın. Panelde, ösentrik odağı ayarlayın ve ilk ayarlamalar için kırınım modundan çıkın. Kirişin boş olmadığından emin olun ve ışın ekranda görünene kadar büyütmeyi azaltın.

Kiriş kaymasını merkeze doğru ayarlayın ve kirişi merkezde tutarken büyütmeyi 70.000'e kadar olan adımlarla artırın. Ardından, mikro prob modu için tipik olarak 50 mikrometre olan istenen kondenser açıklığını takın ve diyafram açıklığını merkezleyin. Odak düğmesini ileri geri çevirirken, nokta genişlemeli ve büzülmeli, ancak bir uçak hayali bir dikey kum saatini kesiyormuş gibi yerinde kalmalıdır.

Diyafram açıklığı ortalanmamışsa, aydınlatma kum saati eğilmiş gibi yanal olarak kayacaktır. Işını netlemeye getirin, hizalamalar sekmesinde yoğunluk listesi odağına basın veya ötesentrik netlemeye geri dönün. Işın konumunu merkeze yeniden ayarlayın ve dönüş merkezini ayarlayın.

Şimdi, odak adım tekerleğini minimuma veya bir adım yukarıya çevirin, böylece ışın hafifçe titreşir ve odak yukarı ve aşağı hareket ettikçe sabit kalmasını sağlar. Pivot noktalarını seçin ve iki noktayı X ve Y ayarlamalarıyla bir araya getirin. Kirişi yuvarlak hale getirmek için kondenser damgalayıcılarını ayarlayın.

Optimize etmek için odaklanarak yukarı ve aşağı gidin. Odaktan geçerken bir yönde veya diğerinde uzama eğilimi olmamalıdır. Lensleri normalleştirin, ardından noktayı ortada tutmak için ışın kaydırmayı kullanırken büyütmeyi kademeli olarak yaklaşık 240.000'e yükseltin ve dönüş merkezi ve pivot noktası ayarlamalarını tekrarlayın.

Kırınım moduna dönün. Bu aşamada, ışın floresan ekranda düzgün bir disk olarak görünmelidir. Kamera uzunluğu artık dedektöre olan optik mesafeyi bir x-ışını kristalografisi olarak etkili bir şekilde kontrol ediyor.

Değiştirin ve diskin büzülüp büyüdüğünü, ekran konumu örneğe doğru veya numuneden uzaklaşıyormuş gibi izleyin. Bu koni parlak alan aydınlatmasını temsil eder. STEM modunu yüksek büyütmede kullanmak için, parlak alan kök dedektörü ile başlayın ve istediğiniz kamera uzunluğunu kullanarak ışını ortalamak için kırınım hizalamasını ayarlayın.

Ekrandaki parlak alan işaretini açın, kamera uzunluğunu 330'a düşürün, ekranı kaldırın ve dedektörleri takın. Mikroskop yazılımında bir tarama başlatın. Makalede açıklandığı gibi parlaklık ve kontrast ayarlarını yaparken yardımcı olması için kapsam ekranını kullanın.

Ayarlamayı birkaç kez yineleyin. Düşük büyütme moduna girmeden mikroskobu yüksek büyütme kaydında nispeten düşük bir büyütmeye geri döndürün. Floresan ekranı takın ve referans için ekran akımını not edin.

TEM'de olduğu gibi, akım silah lensi ve spot boyutu ayarları ile azaltılmış akıma karşılık gelen artan sayılarla değiştirilebilir. Bu noktada, standart değerlere dönüşü kolaylaştırmak için bir FEG kaydı kaydedin. Örneği görmek için LMTEM moduna gidin.

Örneği yerleştirin. Numuneyi ösentrik yüksekliğe getirin. Bunu yapmak için birkaç yöntem vardır.

Örneğin, görüntü yanal olarak kaymayı durdurana kadar numune yüksekliğini Z ekseni boyunca hareket ettirirken ızgarayı eğmek için sahne alanı yalpalayıcısını kullanın. Alternatif olarak, görüntüleme ekranındaki bazı özellikleri işaretleyin ve sahne alanını 10 ila 30 dereceye eğin. Özellik yanal olarak hareket edecektir.

Orijinal konumuna geri getirmek için numune yüksekliğini ayarlayın. Eğimi hassaslaştırmak ve sıfır dereceye döndürmek için büyütme veya sahne alanı eğimini artırın. Şimdi STEM moduna dönün ve STEM dedektörünü takın.

LM taramasını etkinleştir seçeneğinin işaretli olmadığından emin olun. En düşük yüksek büyütme moduna gidin. Kondenser astigmatizmasını yöntemle ayarlayın.

Işın ince bir numune alanı üzerindeyken, iletilen ışının her iki taraftaki numunenin gölge görüntüleri arasında patladığı noktaya odaklanın. Ardından, merkezi diski yuvarlak hale getirmek için kondenser ayarını ayarlayın. Bu, özellikle kriyojenik numuneler için biraz pratik gerektirir.

50 mikrometre diyafram açıklığına geri dönün ve FEG kaydını güncelleyin. LMSTEM moduna gidin ve ilginç bir alan bulmak için taramaya devam edin. Gerekirse, dedektör parlaklığı ve kontrast ayarlarını kabaca bu noktada yeniden yapın.

Ösentrik odağa basın, büyütmeyi artırın ve mikroskop tarafından sağlanan odak döngüsünü kullanarak tarama yaparken odağı hassaslaştırın ve altın boncuklar üzerindeki astigmatizmayı kontrol edin. Şimdiye kadar, her şey nano prob modunda gerçekleştirilir. Daha küçük bir kondenser açıklığı eklemenin, kalın numuneler için yararlı olan yarı yakınsama açısını azalttığına dikkat edin.

TFS araçlarıyla alternatif bir yaklaşım, mikro prob moduna geçmektir, bu da azaltılmış bir yarı yakınsama açısına yol açar. Ardından, toplama açısının yakınsama açısından üç kat daha büyük olması için kamera uzunluğunu ayarlayın; yani, ekrandaki BF dedektör alanı işaretleri ışından yaklaşık üç kat daha büyüktür.

Bir denklem kullanarak kayıt dozunu tahmin edin. Genel bir kural olarak, tüm tomografi için kare mürekkepstrom başına 100 ila 150 elektron hedefleyin. Sahne alanını bir bütün haline getirin ve istediğiniz ekran akımına ulaşmak için spot boyutu ve/veya tabanca lensi ayarlarını kullanarak ışın akımını ayarlayın.

STEM modunda kaydedilen tam düşük büyütmeli ızgara haritası, ilgilenilen hücrelerin bulunduğu alanları gösterir. Hücreler, HAADF dedektörüne doğru dağılmış elektronlarla kısmen parlak görünür. STEM modunda kaydedilen orta çözünürlüklü harita, iki orta çözünürlüklü çapa haritası görüntüledi.

Bir gövde eğim serisinin sıfır derece eğimi, bir mitokondrinin kalsiyum fosfat birikintilerinin, krista ve altın fiducial belirteçlerinin görselleştirilmesine izin verdi. 60 nanometre ve 40 nanometre kalınlığındaki kesitlerin hacim gösterimi gösterilmiştir. Kriyo kök tomografi veya CSTET, yapısal biyoloji ve hücre biyolojisi arasında bir köprü ve süper çözünürlüklü floresan için bir bağlam sağlar.

Kesitleme veya lamel hazırlığına gerek kalmadan, tüm hücresel tiyatroyu yakın bir doğal durumda görebiliriz.