Name: Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, kriyo-STEM tomografi ile mikrometre kalınlığındaki biyolojik örneklerde organelleri nanometre çözünürlüğünde üç boyutlu görüntüleyin. Bu yöntem, hücre biyolojisi araştırmalarında yüksek çözünürlüklü yapısal analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SerialEM yazılım paketinin yazarı ve sürdürücüsü David Mastronade ve Günther Resch'in sürekli ve sürekli desteği için son derece müteşekkiriz. P.K., Avusturya Bilim Fonu (FWF) tarafından Schrödinger Bursu J4449-B aracılığıyla finanse edildi. Açık erişim amacıyla, yazarlar bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale versiyonuna CC-BY kamu telif hakkı lisansı uygulamışlardır. M.E. ve S.G.W., İsrail Bilim Vakfı'ndan, hibe no.1696/18'den ve Avrupa Birliği Horizon 2020 Eşleştirme projesi ImpaCT'den (hibe no.857203) gelen fonları kabul etmektedir. M.E., CryoSTEM projesinde ERC'den gelen finansmanı kabul etmektedir (hibe no. 101055413). M.E., Sam ve Ayala Zacks Profesörlük Kürsüsü'nün görevli ve Irving ve Cherna Moskowitz Nano ve Biyo-Nano Görüntüleme Merkezi'nin başkanıdır. M.E.'nin laboratuvarı, Harold Perlman ailesinin tarihsel cömertliğinden yararlanmıştır. Avrupa Birliği tarafından sağlanan finansmanı da kabul ediyoruz. Bununla birlikte, ifade edilen görüş ve düşünceler yalnızca yazar(lar)a aittir ve Avrupa Birliği veya Avrupa Araştırma Konseyi Yürütme Ajansı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. Ne Avrupa Birliği ne de hibe veren makam bunlardan sorumlu tutulamaz.

<ol><li>Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons+of+cryo-tomography+to+larger+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterizing+cells+using+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterizing cells using tomography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+cryo+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+nucleation+of+hemozoin+at+the+digestive+vacuole+membrane+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+heme+detoxification+in+the+malaria+parasite+by+in+situ+correlative+X-ray+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Sviben, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuole-like+compartment+concentrates+a+disordered+calcium+phase+in+a+key+coccolithophorid+alga%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga.</a> Nature Communications. 7, 11228(2016).</li>
<li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).</li>
<li>Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+visual+proteomics+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards visual proteomics at high resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187(2021).</li>
<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+ferritin+crystallization+revealed+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography.</a> Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).</li>
<li>Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).</li>
<li>Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy%3A+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Imaging+and+Electron+Physics%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy: biological applications.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).</li>
<li>Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSTEM+tomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CryoSTEM tomography in biology.</a> Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition-A+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+theoretical+basis+and+limitations+of+cryo-STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens.</a> Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+remote+data+collection+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63923(2022).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62383(2021).</li>
<li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+electron+tomography+of+cells+using+SerialEM+and+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Imaging%3A+Electron+Tomography+and+Related+Techniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AreTOMO%3A+An+integrated+software+package+for+automated+marker-free%2C+motion-corrected+cryo-electron+tomographic+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction.</a> Journal of Structural Biology. (6), 100068(2022).</li>
<li>Seifer, S., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClusterAlign%3A+A+fiducial+tracking+and+tilt+series+alignment+tool+for+thick+sample+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Imaging%22%5BJournal%5D)">ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography.</a> Biological Imaging. 2, 7(2022).</li>
<li>Waugh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+deconvolution+processing+for+STEM+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).</li>
<li>Kirchenbuechler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-STEM+tomography+of+intact+vitrified+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts.</a> AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lazić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+structures+from+iDPC-STEM+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution.</a> Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).</li>
<li>Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+STEM+with+simultaneous+phase+and+depth+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).</li>
<li>Ophus, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+scanning+transmission+electron+microscopy+%284D-STEM%29%3A+from+scanning+nanodiffraction+to+ptychography+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+phase+retrieval+of+biological+specimens+using+cryo-electron+ptychography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography.</a> Nature Communications. 11 (1), 2773(2020).</li>
<li>Nellist, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principles+of+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">The principles of STEM imaging.</a> Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).</li>
<li>Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+isolated+protein-bound+metal+ions+by+single-particle+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Protokol, geleneksel TEM tomografisi ile erişilemeyen hücre bölgelerindeki hücre içi organellerin 3D görünümünü elde etmek isteyen yaşam bilimleri mikroskopistlerine yardımcı olmalıdır. Aynı protokol, plastik kesitlerin STEM tomografisi için de kullanılabilir ve maruziyet üzerinde rahat kısıtlamalar olabilir. Protokol, bir dizi katı kuraldan ziyade bir başlangıç noktası olarak görülmelidir. Aslında, STEM'in gücü esnekliğidir; onu çalıştırmanın tek bir doğru yolu yoktur.
STEM'in kendi başına yalnızca taranan probu ifade ettiğini ve görüntü oluşumunu tanımlamadığını vurguluyoruz. Kontrast öncelikle dedektörlerin konfigürasyonuna bağlıdır. Daha basit yöntemler, optik eksen üzerinde ortalanmış bir disk veya onu çevreleyen bir anulus olan eksenel simetriye sahip dedektörler kullanır. Genel olarak, aydınlatma doğrudan dedektöre çarptığında, (elektron saçılımı) numunenin karanlık göründüğü bir BF görüntüsü kaydederiz; tersine, dedektör sadece dağınık elektronları topladığında, yoğun numunenin parlak göründüğü bir DF görüntüsü kaydederiz. Uygun donanım mevcut olduğunda, SerialEM bu sinyallerin her ikisini de aynı anda alabilir ve kaydedebilir. Birden fazla segmente sahip dedektörlerden tamamen pikselli kameralara kadar daha gelişmiş konfigürasyonlar mevcuttur. Faz kontrast görüntüleme, örneğin, eksen dışı dedektör elemanları arasındaki farkı değerlendirerek elde edilebilir32,33. Piksel başına tüm 2B saçılma (kırınım) deseninin toplanması, aynı orijinal verilerden birden fazla görüntü kontrastının yeniden oluşturulmasını sağlayan 4D STEM34 olarak bilinen yöntemi tanımlar. Dört boyutlu STEM, faz kontrastı35'i elde etmek için başka bir yol sağlayan elektron ptikografisini mümkün kılar.
Organellerin ve bozulmamış hücrelerin veya mikron kalınlığındaki hücre bölümlerinin incelenmesi için en yararlı olduğunu düşündüğümüz belirli STEM modalitesine odaklandık. Bu, özellikle aydınlatmada küçük bir yarı yakınsama açısı ve dedektörde nispeten büyük bir toplama açısı ile BF görüntülemenin kullanılmasını gerektirir. Küçük yakınsama, geniş bir alan derinliği sağlar, böylece tüm numune eğim serisi19 boyunca odakta kalır. Uygulamada, iyi bir mikroskop aşaması ile, edinim sırasında odak ayarlama ihtiyacını da ortadan kaldırabilir. Fiyat, protokolün 3. bölümünde açıklandığı gibi çözümde bir uzlaşmadır. 1 nm piksel aralığıyla 4 μm'lik bir görüş alanına ulaşan ~ 2 nm'lik bir proba sahip 4k görüntüler önerdik. Bununla birlikte, okuyucunun denemeye şiddetle teşvik edilir. İkinci husus dedektörün yan tarafındadır. Aydınlatma diski eksen üstü BF dedektörünü yetersiz doldurduğunda, faz kontrastı bastırılır ve saçılma (genlik) kontrastı hakimdir; Bu duruma tutarsız parlak alan kontrastı36 adı verilmiştir. Soru, hangi fraksiyonun eksik doldurulacağıdır ve cevap örneğe bağlıdır. Çok ince bir numune, dedektör tamamen doluyken en iyi kontrastı gösterecektir (yani, aydınlatmanınkiyle eşleşen toplama açısı), ancak daha kalın bir numune tüm yoğunluğu dağıtacak ve zayıf kontrastlı gürültülü bir sinyal bırakacaktır. Yararlı bir kural, numune ne kadar kalın olursa, BF dedektörünün dış kesme açısınıno kadar büyük olması gerektiğidir. Dedektör boyutu ve konumu elbette sabittir, bu nedenle kırınım diski boyutu, bölüm 1'de açıklandığı gibi kamera uzunluğu kullanılarak ayarlanır. Dedektör amplifikatörü ayarları, sinyalin dinamik aralığı doldurduğu ancak doğrudan aydınlatma altında doymadığı (1.12.3) şekildeyse, makul bir sinyal yoğunluğuna ve kontrastına ulaşılana kadar kamera uzunluğu artırılabilir. Yine, okuyucu denemeye teşvik edilir. Sanat, tabiri caizse, açılardadır.
Protokolde tartışılmayan bir başka parametre de mikroskop ivme voltajıdır. Aydınlatıcı elektronların numune ile etkileşimi daha düşük bir voltajda daha güçlü olacaktır. Diğer her şey eşit olduğunda, daha düşük voltajda daha yüksek kontrast bekleyebiliriz. Öte yandan, kullanılabilir numune kalınlığını sınırlayan numune içinde çoklu saçılmanın başlangıcıdır, bu nedenle daha yüksek bir voltaj daha kalın numunelerin kullanılmasına izin verir. Bununla birlikte, bu etkiler oldukça incedir. 200 kV ve 300 kV ivmelenme ile bugüne kadarki deneyimlerimiz benzerdir.
Çözünürlük açısından STEM'den ne beklenebileceği göz önüne alındığında, bu yine numuneye ve dedektör konfigürasyonuna bağlıdır. Tek bir parçacık analizi yaklaşımı kullanılarak, ferritin üzerindeki metal iyonları, dairesel karanlık alan STEM ile birkaç angstrom37 hassasiyetine kadar lokalize edilebilir. Daha yakın zamanlarda, entegre diferansiyel faz kontrastı (iDPC) STEM32 ve ptikografi35 ile elde edilen görüntüler kullanılarak virüs ve protein örnekleri için nanometre altı çözünürlük elde edilmiştir. Kalın hücresel örneklerdeki benzersiz nesneler için ve burada açıklanan yöntemlerle, bu kadar yüksek çözünürlük gerçekçi değildir. En uygun çözünürlük, açıklandığı gibi yarı yakınsama açısıyla ilgili olan prob çapıdır. Diğer faktörler çözünürlüğü düşürür, özellikle geniş bir görüş alanına ulaşmak için kaba piksel örneklemesi, eğim serisindeki yanlış hizalamalar ve prob ışınının iletimde yayılması. Görüntüler plastik kesitli tomografi ile iyi karşılaştırılır. Burada açıklanan kurulumla, örneğin, mikrotübüllerin içi boş çekirdeğini görmek kolay olmalı, ancak bireysel protofilamentleri görememelidir.
Özetlemek gerekirse, STEM yöntemleri ve donanımlarının her ikisi de geliştirme aşamasındadır. Görüntülemedeki yeniliklerin tomografiyi de etkileyeceğini ve STEM'i diğer tekniklerle erişilemeyen alanlara yönlendireceğini bekleyebiliriz. Modern optik süper çözünürlüklü yöntemlere dayanan korelasyonlu kriyojenik floresan görüntüleme ile yakınsamanın özellikle verimli olacağını umuyoruz. Organellerin ölçeği, 100-1.000 nm, bu yeni ortaya çıkan yöntemler için ideal bir hedeftir.

Organellerin üç boyutlu (3D) görselleştirilmesi, modern hücre biyolojisinde çok önemli bir görevdir. Salgı vezikülleri için onlarca nanometreden hücre çekirdeği için birçok mikrona kadar değişen ölçekler göz önüne alındığında, tüm uygulamalara uyacak tek bir mikroskopi tekniği bulmak zordur. Modern floresan mikroskopisi çözünürlük açısından aralığın çoğunu kapsayabilirken, yalnızca etiketli moleküller görünür. Hücresel tiyatro, elektron mikroskobunun alanı olmaya devam ediyor. Geleneksel kimyasal fiksasyon, plastik gömme ve ağır metallerle boyama yöntemleri güçlü bir şekilde invazivdir, bu nedenle sonuçlar numune hazırlamanın ayrıntılarına bağlı olabilir. Öte yandan Cryo-EM, sulu ortamı vitrifiye etme ihtiyacı ile sınırlıdır; Oluşan buz kristalleri, elektron aydınlatmasını kırar ve ilgilenilen organik malzemeden daha yüksek kontrastlı kontrast eserlere neden olur.
Son on yılda, hücresel çalışmalar için geliştirilen veya uyarlanan EM görüntüleme tekniklerinin çoğaldığı görülmüştür1. Yinelemeli odaklanmış iyon demeti (FIB) frezeleme ve taramalı elektron mikroskobu (yani FIB-SEM) kullanılarak seri yüzey görüntüleme ile birlikte yüksek basınçlı dondurma şu anda büyük numuneler için tercih edilen yöntemdir2. Kriyojenik yumuşak X-ışını tomografisi (cryo-SXT), sudaki yumuşak X-ışınlarının karakteristik absorpsiyon uzunluğu 3,4,5 ile sınırlı olan birkaç mikron boyutundaki numuneler için uygundur. Bu ölçek birçok bozulmamış hücre tipini içerir ve X-ışını absorpsiyon kontrastının nicel doğası, konsantrasyon ölçümü6 veya spektroskopi7'nin bir yönünü ekler. Subtomogram ortalaması ile kombine edildiğinde, faz kontrast iletim elektron mikroskobuna (TEM) dayanan kriyo-iletim elektron tomografisi (kriyo-ET), makromoleküller veya kompleksler için en yüksek çözünürlüğü sunar 8,9,10. Bununla birlikte, bozulmamış organellerin o kadar düzenli olması nadirdir ki, bütün olarak ortalamaları alınabilir. Dahası, geniş alan TEM'in geleneksel modu, numunedeki elastik olmayan saçılma (enerji kaybını içeren) ve manyetik objektif lens11,12'deki renk sapması kombinasyonu ile numune kalınlığı için birkaç yüz nanometre ile sınırlıdır. Büyük enerji yayılımı, ortaya çıkan odak dışı bulanıklığı gidermek için bir enerji filtresinin kullanılmasını belirler, ancak görüntü sinyali artan kalınlıkla katlanarak zayıflarken, hassas örnek hala radyasyon hasarına maruz kalır.
Alternatif görüntüleme modu olan tarama iletimi EM (STEM), enerji filtreleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve şu anda TEM tomografisinden daha düşük bir çözünürlükte olmasına rağmen, görüntü oluşumu için elastik olmayan şekilde dağılmış elektronları korur (Şekil 1). Aslında, gerçek bir görüntü oluşmaz. Bunun yerine, bir tarama EM'sinde olduğu gibi, ölçümler noktadan noktaya yapılır ve görüntü bilgisayar tarafından monte edilir. Büyütme, lens akımlarını değiştirmeden yalnızca tarama adımlarının boyutuna göre belirlenir. Düzgün bir şekilde yapılandırıldığında, kriyo-STEM tomografisi (CSTET) için faydalı numune kalınlığı aralığı 1,5 veya hatta 2 μm'ye ulaşabilir, ancak yararlı sinyal yoğunluğunun aydınlatmanın önemli bir kısmı olarak kaldığı konfor bölgesi yaklaşık 600-900 nm11,13'tür. Bu, sitoplazmanın büyük bir bölümünü ve bazen hücre çekirdeğinin bir kenarını görmek için yeterlidir. Uygulamada, standart kriyojenik sıvıya daldırma yöntemiyle vitrifikasyonun, kalınlık üzerinde STEM görüntülemeden daha ciddi bir kısıtlama getirdiğini görüyoruz. Bu video makalenin amacı, CSTET'in araştırma laboratuvarlarında ve mikroskopi tesislerinde hücre ve organel görüntüleme için alet sandığına dahil edilmesini kolaylaştırmaktır.
İlk zorluk, CSTET'teki mikroskop operasyonlarının kriyo-TEM tomografisinde olduğu gibi yaşam bilimleri uygulamaları için henüz standartlaştırılmamış olmasıdır. STEM donanımı nadiren (eğer varsa) cryo-EM pazarına hedeflenmiştir. Bununla birlikte, bu en yeni nesil mikroskoplarla değişiyor ve mevcut birçok araç güçlendirilebilir. Bir teknik olarak STEM, kriyojenik ve düşük dozlu yöntemlere de ilgi duyan malzeme bilimlerinde kalkmış ve büyük ölçüde devralınmıştır14,15. Malzeme bilimi literatürü, karışıklığa katkıda bulunan BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, vb. Kısaltmalarla doludur. Burada, Weizmann Bilim Enstitüsü'ndeki kolektif deneyimimizde, parlak alan (BF) STEM görüntüleme16'ya dayanan yararlı sonuçlar için en genel protokolü sağlayan önerilen bir başlangıç noktası sunuyoruz. Hiçbir şekilde olasılık yelpazesini tüketmez veya hatta keşfetmez, ancak daha fazla iyileştirme için bir temel oluşturacaktır. Kriyo-STEM'i vurgulamamıza rağmen, protokolün çoğu plastik gömülü bölümlerin oda sıcaklığında STEM tomografisi için eşit derecede önemlidir.
STEM'in özü, numuneyi odaklanmış bir elektron probu (Şekil 1), aydınlatma konisi ile taramak ve iletimdeki kırınım (saçılma) düzleminden gelen sinyalleri piksel piksel kaydetmek, 2D görüntüler üretmektir17,18. Çoğu hücresel materyal de dahil olmak üzere amorf örnekler, iletimde dağınık bir saçılma paterni üretecektir. En basit pratik STEM konfigürasyonu, merkezi diski (yani, bir numune olmadan iletilecek prob aydınlatmasını) kaydetmek için dairesel bir dedektör yerleştirmektir. Örnek, elektronları bu aydınlatma konisinden sinyalin azaldığı ölçüde uzağa saçar. Bu bir BF görüntüsü üretir - örnek parlak bir arka plan üzerinde karanlık görünür. Dairesel bir dedektör, aydınlatma konisinin dışındaki numuneden saçılımı tespit etmek için de (veya bunun yerine) kullanılabilir. Örnek çıkarıldığında sinyal yoktur. Bir örnek yerleştirildiğinde, nesneler karanlık alan (DF) görüntüsünde koyu bir arka plan üzerinde parlak görünür. STEM için isimlendirme (BF, dairesel karanlık alan [ADF], yüksek açılı dairesel karanlık alan [HAADF], vb.) esas olarak dedektörler için toplama açılarının aralıklarını ifade eder.
Aydınlatmanın yakınsama açısı, STEM'in hücresel tomografiye önemli bir adaptasyonunu temsil eder. En yüksek öncelik yüksek çözünürlük olduğunda, yakınsama açısı mümkün olduğunca büyük olmalıdır. (Bu, konfokal lazer tarama mikroskobuna benzer; çözünürlük, dalga boyunun sayısal açıklığa bölünmesiyle ölçeklenen prob çapı tarafından belirlenir. EM için yarım açı veya yarı yakınsama açısına atıfta bulunduğumuzu unutmayın.) Öte yandan, öncelik alan derinliği olduğunda, çözünürlükteki bir uzlaşma büyük bir avantaj sağlar, çünkü odaklanmış ışın, yarı açılı kareye bölünmüş dalga boyunun iki katına eşit bir mesafe için kabaca paralel kalır. İdeal olarak, tüm hücre hacmi odakta kalır19. Örneğin, 300 keV'de, elektron deBroglie dalga boyu 0.002 nm'dir, bu nedenle 1 mrad'lık bir yakınsama 2 nm'lik bir çözünürlük ve 4 mikronluk bir alan derinliği verir. Bu koşullar altında tomografi, veri toplama sürecinde odaklanmadan bile yapılabilmekle birlikte, edinimin başlangıcında sadece bir kez yapılabilir. Geleneksel tomografi özellikli bir STEM, 7 veya 8 mrad'lık bir yarı yakınsama açısına ulaşabilir; Bu nedenle, prensip olarak, 0.25 nm sırasına göre, ancak daha sonra sadece 62 nm'lik bir odak derinliği ile bir çözünürlüğe ulaşabiliriz. Bu açıkça hücresel görüntüleme için çok incedir. Üç kondansatörlü lensli daha gelişmiş mikroskoplar, yarı yakınsama açısının önemli bir aralıkta sürekli olarak ayarlanmasını sağlar. Daha geleneksel iki kondenser konfigürasyonu ile yakınsama, kondenser (C2) açıklığı tarafından ayrı ayrı sabitlenir.
Sağlam, plastiğe gömülü numuneler için, her eğimde bir odak serisi kaydedilebilir ve bunları yüksek çözünürlüklü20 için birleştirebilir, ancak kriyojenik numuneler için radyasyon bütçesi çok ciddi şekilde kısıtlanır. Son olarak, BF veya DF görüntülemenin avantajlarını tartırken, kalın numuneler için, numunedeki çoklu elastik saçılmanın etkileri göz önünde bulundurulmalıdır. BF sinyali çoklu saçılma ile daha az bozulur ve kalın örnekler için daha yüksek çözünürlük gösterir16,21.
Yararlı bir kural, toplama açılarını yakınsamadan birkaç kat daha büyük ayarlamak olmuştur. Örnek ne kadar kalın olursa, toplama diski o kadar büyük olmalıdır. Çok küçük bir disk düşük sinyal yoğunluğu sağlayacaktır; Çok büyük bir disk, yalnızca en yüksek açılı saçılma katkıda bulunacağından, zayıf görüntü kontrastına neden olur. Toplama açıları belirli bir numune için optimize edilmelidir. Kamera uzunluğunun (kırınım) bir fonksiyonu olarak dedektör açıları bağımsız olarak kalibre edilmelidir. Mikroskop yazılımı tarafından rahatça görüntülenebilirler. Uygulamada, toplama işleminin aydınlatma yarı açılarına, sırasıyla θ ila α oranında iki ila beş faktörlük bir faktör (Şekil 1), hücresel örneklerin CSTET'i için önerilen bir başlangıç noktasıdır.
Aşağıdaki protokol, mikroskop kontrolü için popüler SerialEM yazılımı22,23 kullanılarak yapılan STEM tomografi operasyonunu açıklamaktadır. SerialEM belirli bir üreticiye bağlı değildir ve TEM tomografisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Tomografi hazırlama işlemlerinin çoğu doğrudan TEM'den gerçekleştirilebilir. SerialEM stratejisi, tarama sistemini bir kamera olarak modellemektir. Bu, TEM'den STEM'e basit geçişi mümkün kılar. Bununla birlikte, büyütme ve ciltleme gibi parametrelerin tamamen yapay olduğu akılda tutulmalıdır. Önemli parametreler mikron cinsinden görüş alanı, görüş alanındaki piksel sayısı ve pozlama süresidir. Piksel aralığı veya örnekleme, piksel sayısına bölünen doğrusal alandır, bekleme süresi ise pozlama süresine bölünen piksel sayısıdır.
STEM ve CSTET için minimum konfigürasyon mikroskopta üç özellik içerir: bir tarama jeneratörü, bir STEM dedektörü ve tomografi kontrol yazılımı. Protokol, FEI / Thermo Fisher Scientific'in (TFS) isimlendirilmesini ifade eder, ancak kavramlar geneldir. TFS'nin özel mülk yazılımı TEM24 için JoVE'de açıklanmıştır ve STEM işlemi çok benzerdir.
Mikroskobun servis ekibi veya deneyimli personel tarafından önceden hizalandığını ve bir dosya yüklenerek bir sütun hizalamasının çağrılabileceğini varsayıyoruz. Küçük ayarlamalara doğrudan hizalama denir ve FEG yazmaçları (TFS mikroskopları) olarak adlandırılan yerlerde saklanabilir. Doğrudan hizalamalar arasında dönme merkezi, pivot noktaları, kırınım hizalaması ve kondenser astigmatizmasının telafisi bulunur. Ayarlamalar yinelemeli olarak yapılmalıdır. TFS mikroskoplarının farklı nanoprob (nP) ve mikroprob (μP) modları uyguladığını unutmayın; Belirli bir kondenser açıklığı için, bunlar sırasıyla TEM'de paralel aydınlatma ve STEM'de az ya da çok yakınsak (sıkıca odaklanmış) elektron ışını ile nispeten dar veya geniş bir görüş alanı sağlar. Diğer üreticiler, yakınsama açılarının aralığını kapsayacak şekilde farklı şemalar kullanır.
Başlamadan önce, incelenen örneğe bağlı olarak, görüş alanı, L ve örnekleme (piksel genişliği), l seçilmelidir. Örneğin, l = 1 nm/piksel için, 4 μm2'lik bir görüş alanını kaplayacak 4.000 x 4.000 piksellik bir görüntü seçilmelidir. Çözünürlük, en iyi ihtimalle, uzamsal örneklemenin iki katı olacaktır, bu nedenle 2 nm ve prob çapı, d, bununla eşleşmelidir. Prob açısının kalibrasyonu bu protokolün kapsamı dışındadır, bu nedenle bir tablo veya ekran okumasının mevcut olduğunu varsayıyoruz. Prob çapı yaklaşık olarak elektron dalga boyunun yarı yakınsama açısına (radyan cinsinden) bölünmesiyle elde edilir: d = λ/θ. Dalga boyu, λ, 300 keV için 0.002 nm ve 200 keV elektron için 0.0025 nm'dir, bu nedenle 1 mrad'lık θ, sırasıyla 2 veya 2.5 nm'lik bir nokta çapı sağlayacaktır.
Protokol, artan karmaşıklığın ilerleyişinde sunulmaktadır. İlk görev, mikroskop üreticisinin yazılımına bağlı bir STEM görüntüsü ve ardından SerialEM kullandığımız bir eğim serisi üretmektir. Birçok okuyucu şüphesiz SerialEM'e aşina olacak, bu yüzden daha karmaşık görevler doğal olarak gelecek. Prosedürleri sıkı bir şekilde takip etmeye gerek yoktur. Otomasyonla ilgili gelişmeler doğrudan STEM için uygulanabileceği gibi TEM için de uygulanabilir. Deneyimli kullanıcılar muhtemelen floresan haritalarının korelasyon kaydından başlayarak ve toplu tomografi kurmaya devam ederek protokolü tersine çevirecektir. Daha fazla ayrıntı, otomasyon25'teki en son gelişmeler hakkında yakın tarihli bir JoVE makalesi de dahil olmak üzere SerialEM'in kendisi için kapsamlı belgelerde ve öğretici kütüphanelerde bulunabilir.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; SerialEM</td><td>Colorado Üniversitesi</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEM, mikroskop kontrolü ve veri toplama için ücretsiz bir yazılım platformudur.</td></tr><tr><td>STEM özellikli transmisyon elektron mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Protokol, Thermo Fisher Scientific'in çeşitli mikroskopları ile edinilen deneyime dayanarak yazılmıştır: Titan Krios, Talos Arctica ve Tecnai T20-F. Prensip olarak, diğer üreticiler için de geçerli olmalıdır.</td></tr></tbody></table>

kriyo-stem tomografi ile organellerin in situ görüntülenmesi

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Kriyojenik elektron mikroskobu (cryo-EM), doğal sulu ortamlarına gömülü biyolojik veya organik örneklerin görüntülenmesine dayanır; Su, kristalleşmeden bir bardağa (yani vitrifiye) katılaşır. Kriyo-EM yöntemi, biyolojik makromoleküllerin yapısını son zamanlarda atoma yakın bir çözünürlükte belirlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, tomografi kullanılarak organellerin ve hücrelerin incelenmesine genişletilmiştir, ancak geniş alan iletim EM görüntülemenin geleneksel modu numune kalınlığında ciddi bir sınırlama yaşamaktadır. Bu, odaklanmış bir iyon demeti kullanarak ince lamellerin frezelenmesi uygulamasına yol açmıştır; Rekonstrüksiyonlardan elde edilen subtomogram ortalaması ile yüksek çözünürlük elde edilir, ancak kalan katmanın dışındaki üç boyutlu ilişkiler kaybolur. Kalınlık sınırlaması, tarama EM veya konfokal lazer tarama mikroskobuna benzer şekilde taranmış prob görüntüleme ile aşılabilir. Malzeme biliminde taramalı iletim elektron mikroskobu (STEM) tek görüntülerde atomik çözünürlük sağlarken, kriyojenik biyolojik örneklerin elektron ışınlamasına duyarlılığı özel hususlar gerektirir. Bu protokol, STEM kullanarak kriyo-tomografi için bir kurulum sunar. Mikroskobun temel topikal konfigürasyonu hem iki hem de üç kondenser sistemleri için tanımlanırken, otomasyon ticari olmayan SerialEM yazılımı tarafından sağlanmaktadır. Toplu iş alımı ve daha önce edinilmiş floresan haritalarına korelasyon hizalaması için geliştirmeler de açıklanmaktadır. Örnek olarak, iç ve dış zarı ve kalsiyum fosfat granüllerini, ayrıca çevredeki mikrotübülleri, aktin filamentlerini ve ribozomları işaret ederek bir mitokondrinin rekonstrüksiyonunu gösteriyoruz. Kriyo-STEM tomografisi, sitoplazmadaki organellerin tiyatrosunu ve hatta bazı durumlarda kültürdeki yapışkan hücrelerin nükleer çevresini ortaya çıkarmada mükemmeldir.

STEM'de hazırlanan tam ızgara montajı, ilgilenilen hücrelerin bulunduğu alanları göstermektedir (Şekil 4). Görüntünün karanlık alanda olduğunu, bu nedenle boş deliklerin karanlık göründüğünü unutmayın. Hücreler, elektronların HAADF dedektörüne doğru dağıldığı kısmen parlak görünür. En kalın kısımlarda, tipik olarak merkezlerde veya ızgara çubuklarının yakınında, kontrast tekrar kararır. Bunun nedeni, elektronların dedektör tarafından yakalanmayan açılara ulaştığı çoklu saçılmadır. Uygulamada, bu alanlar tomografi için çok kalın olacaktır.
Bir sonraki aşama ara büyütme haritalarını içerir (Şekil 10). Bunlara genellikle orta montaj haritaları veya şekil yerine ızgara karelerine atıfta bulunan kare haritalar denir. En düşük mikroprob STEM modunda bile, montaj görüntüleri olarak da elde edilecektir. Gezgin penceresindeki öğeye tıklandığında, harita görüntüsü ana pencereye yüklenir. Bu alanda tomogram elde etmek için belirli noktalar seçilir. Kayıt büyütmede alanı bulmak için Önizleme modunu kullanın. Tarama hızlarına bağlı olarak Önizleme ve Kayıt arasında yanal bir geçiş olabileceğini unutmayın. Burada tek bir eğme serisi kaydedilebilir. Örneğin mitokondri, genellikle Önizleme ve Kayıt görüntüsünde tanımlanabilir (Şekil 12).
Toplu tomografi için, sahne ızgaranın etrafında hareket eder ve tam olarak aynı yere geri dönmeyebilir. Bağlantı haritaları, sahne alanı hareketi değişmiş olsa bile, Önizleme görüntüsünü daha düşük bir büyütme Görünümüyle eşleştirerek istenen Kayıt alanlarının güvenilir bir şekilde yeniden tanımlanmasını sağlamak için kullanılır. PyEM23,24, kesinlikle tavsiye edilen, ancak henüz standart kurulumun bir parçası olmayan daha hızlı bir alternatif sunar.
CLEM yaklaşımında, tomografi için ilgi alanlarını belirlemek için bir floresan haritası kullanılabilir. Floresan harici olarak elde edilir ve tam ızgara montajına kaydedilmelidir. Izgara çubuklarının ve deliklerinin görünür olması yararlıdır, bu nedenle içe aktarmadan önce, örneğin GIMP (https://www.gimp.org) veya ImageJ31 yazılımında birleştirilmiş bir floresan + parlak alan kompoziti hazırlanabilir (ImageJ'nin dikey ekseni tersine çevirmesine dikkat edin). Floresanın dinamik aralığı büyük olduğunda, doygunluk olmadan böyle bir birleşme oluşturmak zor olabilir. Bu durumda, iki harita ayrı ayrı içe aktarılabilir ve daha sonra açıklandığı gibi birlikte kaydedilebilir (Şekil 13). Bu şekilde, Navigator penceresindeki floresan haritasındaki bir nokta ve ardından "Go To XY", sahne alanını TEM'e monte edildiği gibi ızgara üzerinde karşılık gelen konuma getirir. Montajın (veya eğer bir montaj ise, floresan haritasının) oluşturulmasındaki küçük tutarsızlıkların küçük yer değiştirmelere yol açmasına dikkat edin; Bu nedenle, optimum hassasiyet için, floresan özellikle kare haritaya yeniden kaydedilmelidir. Bu kaydın gözle, destek filmindeki deliklere veya parlak alan ışığı görüntüsüyle paylaşılan özelliklere dayanarak yapılması genellikle yeterlidir.
Eğim serisinin yeniden yapılandırılması 3B hacimle sonuçlanır (Şekil 14). Bu örnekte 2,042 nm piksel boyutu vardır ve bu da ~4 μm'lik bir görüş alanıyla sonuçlanır. Kalsiyum fosfat birikintileri (turuncu ok uçları), çevreye kıyasla daha yüksek atom numarası nedeniyle göze çarpmaktadır. Mikrotübüller (kırmızı ok uçları) tüm görüş alanı boyunca izlenebilir. Ayrıca, iç ve dış mitokondriyal membranlar (yeşil ok uçları) açıkça görülebilir. Aktin, demetler veya bireysel filamentler olarak gözlemlenebilir. Daha izotropik bir çözünürlük elde etmek için, rekonstrüksiyon dekonvolüsyon ile işlenebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg"> Şekil 1: TEM ile STEM'in karşılaştırılması. TEM'de, görüş alanı paralele yakın bir ışınla aydınlatılır ve objektif lens kamera üzerinde büyütülmüş bir görüntü oluşturur. Kriyo-TEM için, objektif açıklık, dağınık elektron dalgalarını (kesikli kırmızı çizgi) geçmek için açılır, bu da defokus ile, dağılmamış (yeşil) dalgalarla etkileşime girerek faz kontrastı üretir. Öte yandan STEM, numune boyunca odaklanmış bir ışın rastlar ve dağınık elektronları piksel piksel bir şekilde toplar. Birden fazla dedektör, farklı açılara dağılmış elektronları toplayabilir. Bu rakam30'dan değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg"> Şekil 2: Yüksek tarama hızı nedeniyle sol taraftaki görüntü bozulması örneği. Sarı ok uçlarıyla işaretlenmiş bozulmanın yanı sıra Quantifoil'deki çarpık oval şekilli deliklere dikkat edin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg"> Şekil 3: Tüm ızgara montajı için montaj kurulum diyaloğu . X ve Y'deki büyütmeyi ve parça sayısını seçin, böylece ızgaranın çoğu için bir harita elde etmek üzere toplam alan yaklaşık 2.000 μm'ye ulaşır. Ayrıca görüntüyü kaydırmak yerine Sahne alanını taşı ve Kayıt parametrelerini değil Montaj Eşlemesini Kullan'ı seçin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg"> Şekil 4: STEM modunda kaydedilen tam düşük büyütmeli GridMap. Kırık alanlar karanlık alan görüntüsünde tamamen siyah görünür. Koyu gri alanlar muhtemelen çok kalın ve zayıf vitrifiye edilmiştir. Bu taramada tomografi için iyi aday alanlar beyaz veya açık gridir. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg"> Şekil 5: İşaretleyici işlemine geçiş. Tanınabilir bir nesne, düşük çözünürlüklü haritada Nokta Ekle (bu resimde 38) ile işaretlenir. Düşük çözünürlüklü harita (yeşil daire) ile orta çözünürlüklü harita (turuncu daire) arasındaki geçişe dikkat edin. Ardından, nesne işaretçiyle (yeşil çarpı, kırmızı daire) işaretlenir ve İşaretçiye Kaydır iletişim kutusu başlatılır. Seçilen seçenek, tüm haritaları 245x'te aynı miktarda taşır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg"> Şekil 6: Bir STEM eğme serisi için eğme serisi kurulum iletişim kutusu. Doz-simetrik şema, 2 ° 'lik adımlarla -60 ° ila + 60 ° arasında kullanılır. Düşük yakınsama açısı kullanılırken yüksek netleme derinliği nedeniyle otomatik netleme atlanır. Bu daha önce yapıldığı gibi ösantrikliği rafine etmeye gerek yok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg"> Şekil 7: Orta çözünürlüklü eşlemeler için dosya özellikleri iletişim kutusu. MRC yığın dosyası olarak kaydedin, tamsayıları seçin ve ek bilgileri bir .mdoc meta veri dosyasına kaydedin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg"> Şekil 8: Orta çözünürlüklü haritaları kaydetmek için montaj kurulum iletişim kutusu. 90 μm genişliğinde 200 örgü ızgara üzerindeki bir kare için, en az 90 μm x 90 μm toplam alan önerilir. Görüntüyü kaydırmak yerine Sahneyi taşı ve Düşük Doz modunda Görünüm parametrelerini kullan'ı seçin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg"> Şekil 9: Orta çözünürlüklü haritayı kaydetme. Orta çözünürlüklü haritaları kaydetmek için Öğeler iletişim kutusundan edinin. Eşleme'yi seçin, Görüntü veya montaj alın ve kaydedin ve Gezgin haritası yap'ı işaretleyin. Birincil'den önceki veya sonraki görevler'de Kaba ve İnce Ösantriklik'i seçin. Yardımsız olduğunda, isteğe bağlı olarak Hata oluştuğunda mesaj kutusu yok ve sonunda sütun valflerini kapat'ı seçin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg"> Şekil 10: Orta çözünürlüklü haritanın görüntüsü. STEM modunda 3 x 3 montajla kaydedilen orta çözünürlüklü harita (Kare Harita). Veri toplama için iki orta çözünürlüklü Bağlantı Haritası mavi karelerle gösterilir. Ölçek çubuğu = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg"> Şekil 11: Toplu eğme serisi verileri. Toplu eğme serilerini toplamak için Öğeler iletişim kutusundan edinin. Eğme serisi veri toplama için Son Verileri ve Eğme serisini al'ı seçin. Birincil'den önceki veya sonraki görevler'de Dewars/Vacuum'u Yönet (Ayarlar menüsünde uygun ayarları seçin), Öğeye Yeniden Hizala, İnce Ösantriklik ve Komut Dosyasını Eylemden Önce Çalıştır'ı işaretleyin. Genel seçeneklerde, Hata oluştuğunda mesaj yok kutusunu ve sonunda sütun valflerini kapat'ı işaretleyin (bkz. 5.14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg"> Şekil 12: Bir mitokondrinin STEM eğim serisinin 0° eğimi. Turuncu ok uçları kalsiyum fosfat birikintilerine (matris granülleri), yeşil ok uçları cristae'ye ve kırmızı ok uçları 15 nm altın referans belirteçlerine işaret eder. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg"> Şekil 13: Kayıtlı kriyo-CLEM haritaları. (A) Orta çözünürlüklü STEM haritası (Kare harita, 26-A), (B) düşük çözünürlüklü STEM Haritasına, (C) BF kanalı kriyo-FM Haritasına ve (D) GFP kanal kriyo-FM haritasına kayıtlıdır. Dokuz kayıt noktası (etiketler 4-21) (E) Gezgini'nde gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg"> Şekil 14: Toplu işleme. Farklı derinliklerde SIRT benzeri (30 döngü) filtrelenmiş bir tomogram aracılığıyla (A) 60 nm ve (B) 40 nm kalınlığında kesitlerin hacim oluşturması. Piksel boyutu 2,048 nm'dir ve bu da yaklaşık 4 μm'lik bir görüş alanına neden olur. Lütfen Şekil 12'ye kıyasla ters çevrilmiş yoğunluğa dikkat edin, bu da yüksek yoğunluklu özelliklerin parlak olduğu anlamına gelir. Turuncu, beyaz, kırmızı, yeşil ve açık mavi ok uçları sırasıyla kalsiyum fosfat birikintilerine, ribozomlara, mikrotübüllere, iç ve dış mitokondriyal membrana ve aktin filamentlerine işaret eder. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

TEM tomografisi hücrelerin görüntülenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak numune kalınlığı açısından çok sınırlıdır. FIB SEM ve yumuşak röntgen tomografisi, daha düşük çözünürlükte de olsa daha büyük numuneler için kullanılabilir. STEM tomografi bu boşluğu mükemmel bir şekilde doldurur.STEM tomografisi, mikron kalınlığındaki örneklere birkaç nanometre çözünürlükte bir bakış sağlar. Kriyojenik preparat ile kombinasyon, biyolojik örneklere ve bölümlere 3D olarak bakmamızı sağlar. Görüntü oluşumunu anlamak ve servis mühendisinin kök ve Lomax kök modlarını iyi hizaladığından ve kalibrasyon adımlarının videodakilere benzediğinden emin olmak için STEM optiklerinin temellerini gözden geçirin.Başlamak için sütun hizalama dosyasını yükleyin ve sütun değerlerini açın. Yandan girişli bir kriyo tutucu kullanıyorsanız, kriyo kalkanını açın ve TEM modunda başlayın. Işın ekranda görünmelidir.Kiriş görünmüyorsa büyütmeyi azaltın. Kontrol panelindeki düğmeye basarak mikroskobu ösentrik odağa getirin. Floresan ekranı doğrudan veya dahili kamerayla görselleştirmek için spot boyutunu uygun bir değere ayarlayın.Mikroskobu STEM moduna ayarlayın ve odağın amaç yerine kondansatörlü lensleri kullandığını doğrulayın. Panelde, ösentrik odağı ayarlayın ve ilk ayarlamalar için kırınım modundan çıkın. Kirişin boş olmadığından emin olun ve ışın ekranda görünene kadar büyütmeyi azaltın.Kiriş kaymasını merkeze doğru ayarlayın ve kirişi merkezde tutarken büyütmeyi 70.000'e kadar olan adımlarla artırın. Ardından, mikro prob modu için tipik olarak 50 mikrometre olan istenen kondenser açıklığını takın ve diyafram açıklığını merkezleyin. Odak düğmesini ileri geri çevirirken, nokta genişlemeli ve büzülmeli, ancak bir uçak hayali bir dikey kum saatini kesiyormuş gibi yerinde kalmalıdır.Diyafram açıklığı ortalanmamışsa, aydınlatma kum saati eğilmiş gibi yanal olarak kayacaktır. Işını netlemeye getirin, hizalamalar sekmesinde yoğunluk listesi odağına basın veya ötesentrik netlemeye geri dönün. Işın konumunu merkeze yeniden ayarlayın ve dönüş merkezini ayarlayın.Şimdi, odak adım tekerleğini minimuma veya bir adım yukarıya çevirin, böylece ışın hafifçe titreşir ve odak yukarı ve aşağı hareket ettikçe sabit kalmasını sağlar. Pivot noktalarını seçin ve iki noktayı X ve Y ayarlamalarıyla bir araya getirin. Kirişi yuvarlak hale getirmek için kondenser damgalayıcılarını ayarlayın.Optimize etmek için odaklanarak yukarı ve aşağı gidin. Odaktan geçerken bir yönde veya diğerinde uzama eğilimi olmamalıdır. Lensleri normalleştirin, ardından noktayı ortada tutmak için ışın kaydırmayı kullanırken büyütmeyi kademeli olarak yaklaşık 240.000'e yükseltin ve dönüş merkezi ve pivot noktası ayarlamalarını tekrarlayın.Kırınım moduna dönün. Bu aşamada, ışın floresan ekranda düzgün bir disk olarak görünmelidir. Kamera uzunluğu artık dedektöre olan optik mesafeyi bir x-ışını kristalografisi olarak etkili bir şekilde kontrol ediyor.Değiştirin ve diskin büzülüp büyüdüğünü, ekran konumu örneğe doğru veya numuneden uzaklaşıyormuş gibi izleyin. Bu koni parlak alan aydınlatmasını temsil eder. STEM modunu yüksek büyütmede kullanmak için, parlak alan kök dedektörü ile başlayın ve istediğiniz kamera uzunluğunu kullanarak ışını ortalamak için kırınım hizalamasını ayarlayın.Ekrandaki parlak alan işaretini açın, kamera uzunluğunu 330'a düşürün, ekranı kaldırın ve dedektörleri takın. Mikroskop yazılımında bir tarama başlatın. Makalede açıklandığı gibi parlaklık ve kontrast ayarlarını yaparken yardımcı olması için kapsam ekranını kullanın.Ayarlamayı birkaç kez yineleyin. Düşük büyütme moduna girmeden mikroskobu yüksek büyütme kaydında nispeten düşük bir büyütmeye geri döndürün. Floresan ekranı takın ve referans için ekran akımını not edin.TEM'de olduğu gibi, akım silah lensi ve spot boyutu ayarları ile azaltılmış akıma karşılık gelen artan sayılarla değiştirilebilir. Bu noktada, standart değerlere dönüşü kolaylaştırmak için bir FEG kaydı kaydedin. Örneği görmek için LMTEM moduna gidin.Örneği yerleştirin. Numuneyi ösentrik yüksekliğe getirin. Bunu yapmak için birkaç yöntem vardır.Örneğin, görüntü yanal olarak kaymayı durdurana kadar numune yüksekliğini Z ekseni boyunca hareket ettirirken ızgarayı eğmek için sahne alanı yalpalayıcısını kullanın. Alternatif olarak, görüntüleme ekranındaki bazı özellikleri işaretleyin ve sahne alanını 10 ila 30 dereceye eğin. Özellik yanal olarak hareket edecektir.Orijinal konumuna geri getirmek için numune yüksekliğini ayarlayın. Eğimi hassaslaştırmak ve sıfır dereceye döndürmek için büyütme veya sahne alanı eğimini artırın. Şimdi STEM moduna dönün ve STEM dedektörünü takın.LM taramasını etkinleştir seçeneğinin işaretli olmadığından emin olun. En düşük yüksek büyütme moduna gidin. Kondenser astigmatizmasını yöntemle ayarlayın.Işın ince bir numune alanı üzerindeyken, iletilen ışının her iki taraftaki numunenin gölge görüntüleri arasında patladığı noktaya odaklanın. Ardından, merkezi diski yuvarlak hale getirmek için kondenser ayarını ayarlayın. Bu, özellikle kriyojenik numuneler için biraz pratik gerektirir.50 mikrometre diyafram açıklığına geri dönün ve FEG kaydını güncelleyin. LMSTEM moduna gidin ve ilginç bir alan bulmak için taramaya devam edin. Gerekirse, dedektör parlaklığı ve kontrast ayarlarını kabaca bu noktada yeniden yapın.Ösentrik odağa basın, büyütmeyi artırın ve mikroskop tarafından sağlanan odak döngüsünü kullanarak tarama yaparken odağı hassaslaştırın ve altın boncuklar üzerindeki astigmatizmayı kontrol edin. Şimdiye kadar, her şey nano prob modunda gerçekleştirilir. Daha küçük bir kondenser açıklığı eklemenin, kalın numuneler için yararlı olan yarı yakınsama açısını azalttığına dikkat edin.TFS araçlarıyla alternatif bir yaklaşım, mikro prob moduna geçmektir, bu da azaltılmış bir yarı yakınsama açısına yol açar. Ardından, toplama açısının yakınsama açısından üç kat daha büyük olması için kamera uzunluğunu ayarlayın; yani, ekrandaki BF dedektör alanı işaretleri ışından yaklaşık üç kat daha büyüktür.Bir denklem kullanarak kayıt dozunu tahmin edin. Genel bir kural olarak, tüm tomografi için kare mürekkepstrom başına 100 ila 150 elektron hedefleyin. Sahne alanını bir bütün haline getirin ve istediğiniz ekran akımına ulaşmak için spot boyutu ve/veya tabanca lensi ayarlarını kullanarak ışın akımını ayarlayın.STEM modunda kaydedilen tam düşük büyütmeli ızgara haritası, ilgilenilen hücrelerin bulunduğu alanları gösterir. Hücreler, HAADF dedektörüne doğru dağılmış elektronlarla kısmen parlak görünür. STEM modunda kaydedilen orta çözünürlüklü harita, iki orta çözünürlüklü çapa haritası görüntüledi.Bir gövde eğim serisinin sıfır derece eğimi, bir mitokondrinin kalsiyum fosfat birikintilerinin, krista ve altın fiducial belirteçlerinin görselleştirilmesine izin verdi. 60 nanometre ve 40 nanometre kalınlığındaki kesitlerin hacim gösterimi gösterilmiştir. Kriyo kök tomografi veya CSTET, yapısal biyoloji ve hücre biyolojisi arasında bir köprü ve süper çözünürlüklü floresan için bir bağlam sağlar.Kesitleme veya lamel hazırlığına gerek kalmadan, tüm hücresel tiyatroyu yakın bir doğal durumda görebiliriz.

visualization-of-organelles-in-situ-by-cryo-stem-tomography

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı "makromoleküler" (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

Burada, kriyo yumuşak X-ışını tomografisinde (SXT) kriyo-korunmuş hücrelerin ultrayapısını 25 nm yarım perde çözünürlükte görüntülemek için gerekli numune hazırlama ve veri toplama adımlarını açıklayan bir protokol sunulmaktadır.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bu protokolün amacı, hücre yapıştırma ve büyümesini kriyo-elektron mikroskopisi için hedeflenen ızgara alanlarına yönlendirmektir. Bu, kullanıcı tarafından belirtilen desenlerde ablated bir anti-kirlenme tabakasının uygulanması ve ardından hücre tohumlamadan önce desenli alanlarda hücre dışı matris proteinlerinin birikmesi ile elde edilir.

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel üst yapının nanometre çözünürlükte 3D görselleştirilmesini sağlar, ancak manuel segmentasyon zaman alıcı ve karmaşık olmaya devam etmektedir. Kriyo-ET tomogramlarını segmentlere ayırmak için gelişmiş sanal gerçeklik yazılımını entegre eden ve memeli hücrelerinde mitokondrinin segmentasyonu yoluyla etkinliğini gösteren yeni bir iş akışı sunuyoruz.

Kriyo-elektron tomografi verilerinin sürükleyici segmentasyonu ve analizi için sanal gerçeklikten yararlanma

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Öğrenin, kriyo-STEM tomografi ile mikrometre kalınlığındaki biyolojik örneklerde organelleri nanometre çözünürlüğünde üç boyutlu görüntüleyin. Bu yöntem, hücre biyolojisi araştırmalarında yüksek çözünürlüklü yapısal analiz sağlar.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet