Atık Su ve Hava Örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının Miktar Tayini ve Tüm Genom Karakterizasyonu

Atık su bazlı epidemiyoloji şu anda atık su örneklerinde viral RNA'yı tespit ederek ve potansiyel salgınları belirleyerek dünya çapında COVID-19 kontrol stratejilerini tamamlamak için kullanılmaktadır. Bu teknik, asemptomatik vakaları içeren topluluğumuzda COVID-19 prevalansının popülasyon çapında bir görüntüsünü sağlar. Hava örneklemesi de bu protokole önemli bir ektir.

Klinik teşhis, hastalık salgınlarını ve pandemileri yönetmenin hala en doğru yoludur. Bununla birlikte, bu teknik hala bir tamamlayıcı olarak yararlıdır. Bu yöntemin birçok adımı ve kritik noktası vardır.

Moleküler biyolojiye çok aşina olmayan laboratuvarların prosedürü tekrarlamasına izin vereceği için görsel bir gösteri gereklidir. Başlamak için, 24 saatlik kompozit atık su örneğinden bir litre toplayın. 20 mikrolitre mengovirüsü numunenin 70 mililitresine dökün.

Numuneyi 700G'de 10 dakika santrifüjledikten sonra, elde edilen süpernatanı, santrifüjleme ile 10 kilodaltonluk bir kesme ile santrifüjlü bir ultrafiltrasyon cihazı kullanarak konsantre edin. 700G'de 40 dakika santrifüjleyerek ve ultrafiltrasyon cihazının konumunu tersine çevirerek konsantreyi yükseltin. Elde edilen konsantreyi RNA ekstraksiyonu için kullanın.

Hava örneklerini toplamak için, toplamaya başlamadan önce hava örnekleyiciye steril bir koni yerleştirin. Örnekleme bittikten sonra, ticari bir viral RNA ekstraksiyon kiti veya kurum içi bir yöntem kullanarak koninin yıkanmış PBS'sinden RNA'yı çıkarın. Her hedef, mengovirüs, SARS-CoV-2, N1 ve N2 genleri için reaksiyon ana karışımını reaktif kurulum odasında temiz bir başlıkta hazırlayın.

Primer-prob karışımını ve enzimi beş kez ters çevirerek veya darbeli vorteksleme yaparak karıştırın. Mikrosantrifüj tüplerini soğuk bir rafta tutarak, karışımın 15 mikrolitresini şerit PCR tüplerine veya bir soğutma rafına yerleştirilmiş 96 oyuklu bir PCR plakasına dağıtın. Plakayı örtün ve nükleik asit işleme alanına taşıyın.

Ekstrakte edilen RNA'nın bir alikotunu beş saniye boyunca nazikçe girdaplayın. 25 mikrolitre yapmak için reaksiyon karışımına beş mikrolitre RNA'yı pipetleyin ve RT-qPCR'yi başlatın. Bir PCR plakasında, her numuneden 16 mikrolitreyi plaka üzerindeki konumuna pipetleyin ve beş kez ters transkripsiyon veya RT ana karışımından dört mikrolitre ekleyin.

Ardından PCR reaksiyonunu başlatın. Daha sonra, her bir primer setinin 10 mikromolar dilüsyonunu ve her bir primer seti için ana karışımı hazırlayın. Yeni bir PCR plakasında, ana karışımdan 20 mikrolitre, ardından her karışıma beş mikrolitre RT numunesi pipetleyin.

Plakayı kapattıktan sonra PCR reaksiyonunu başlatın. PCR bittiğinde, plakayı 1000 G'de 15 ila 30 saniye döndürün. PCR saflaştırması için, her bir oyuğa 50 mikrolitre boncuk bazlı reaktif ekleyin ve manyetik ayırmaya devam etmek için pipetleme ile karıştırın.

Plakayı manyetik standdan çıkarın. Her peleti 15 mikrolitre PCR sınıfı su ile yeniden süspanse edin ve plakayı oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Plakayı manyetik standa geri yerleştirin ve boncukların iki dakika boyunca peletlenmesine izin verin.

Ardından, her numuneden 15 mikrolitre süpernatanı dikkatlice yeni bir PCR plakasına pipetleyin. Daha sonra, kütüphane hazırlığı için, DNA kütüphanesi hazırlama kitinden 1.75 mikrolitre reaksiyon tamponu ve her numuneye 0.75 mikrolitre enzim karışımı ekleyin. Kapalı plakayı kısaca girdap haline getirin ve 15 ila 30 saniye boyunca 1000G'de döndürün.

21 santigrat derecede beş dakika ve 65 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Her numune için üç mikrolitre PCR sınıfı suyu yeni bir PCR plakasına pipetleyin. Hazırlanan örneklerden 0,75 mikrolitre ve kitaplık hazırlığı için 1,25 mikrolitre barkod ekleyin.

Ardından beş mikrolitre T4 DNA ligaz ana karışımı ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Plakayı santrifüjde döndürdükten sonra, plakayı 21 santigrat derecede 20 dakika ve 65 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Tüm numuneleri bir araya getirdikten sonra, PCR saflaştırması için havuza 192 mikrolitre boncuk bazlı reaktif ekleyin.

Pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Süpernatantın temizlenmesini ve bir boncuk peletinin oluşmasını bekleyin.

Süpernatanı ve tüpü manyetik standdan çıkarın. 700 mikrolitre kısa parça tamponu veya SFB ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Tüpü manyetik standa geri yerleştirin ve peletin oluşmasını ve sıvının temizlenmesini bekleyin.

Süpernatanı bir pipet kullanarak atın. Tüpe 35 mikrolitre PCR sınıfı su ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin ve boncukların peletlenmesine ve sıvının temizlenmesine izin verin.

Süpernatanın 35 mikrolitresini yeni bir tüpe pipetleyin. Ardından, adaptör ligasyon reaksiyon karışımını metin yazısında açıklandığı gibi hazırlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. PCR saflaştırması için 20 mikrolitre boncuk bazlı reaktifi ligasyon reaksiyonu karışımına karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Tüpü manyetik standa yerleştirin ve boncuk peletinin oluşmasını ve süpernatantın renksiz hale gelmesini bekleyin. Süpernatanı pipetleyerek dikkatlice atın. 125 mikrolitre SFB'yi tüpe karıştırın ve boncukları ayırmak için manyetik standa geri yerleştirin.

Sıvı berraklaştığında, süpernatanı atın ve daha önce gösterildiği gibi SFB eklemeyi tekrarlayın. Manyetik stand üzerindeki tüpü 30 saniye açık bırakın. 15 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.

Kısa bir sıkma ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edildikten sonra, iki dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Florometrik bir DNA miktar tayin kiti ile konsantrasyonu ölçmek için 15 mikrolitre süpernatanı yeni bir düşük bağlayıcı tüpe pipetleyin. Ardından, akış hücresini gerçek zamanlı DNA ve RNA dizileme cihazına yerleştirin.

200 mikrolitreye ayarlanmış 1.000 mikrolitrelik pipetin ucunu hazırlama portuna yerleştirin. Uçtaki sıvıyı görene kadar sesi artırmak için ses ayar çarkını çevirin ve ardından ucu atın. 800 mikrolitre hazırlama karışımını kabarcıksız hazırlama portuna ekleyin ve beş dakika bekleyin.

Kütüphane karışımının 200 mikrolitresini hazırlama portuna pipetleyin. Kapak portunu ve doldurma portunu kapatın. Yazılımda sıralama deneyini başlatın ve Base Calling On'u seçin.Bu yöntem, atık su ve hava örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sını tespit etti ve ölçtü.

Atık su örnekleri, üçlüler arasında %1.91 ila %13.98 arasında standart sapmaya sahipti ve litre başına 3.05 çarpı 10 ila üç ila 2.83 kez 10 ila sekiz gen kopyası arasında değişiyordu. Hava numuneleri 6.17 çarpı 10 ila üç ila 5.48 çarpı 10 ila dokuz arasında değişmekte olup, kopyalardaki standart sapma %0.54 ile %10.95 arasındadırBu protokolde açıklandığı gibi, numuneler sıralanmıştır ve üç sıralı numune sonucunun bir örneği burada özetlenmiştir. Her üç örnekte de soy BA.5.

x, Freyja aracı tarafından en yaygın olarak atandı. Atık sularda düşük konsantrasyonlarda viral RNA bulunduğundan, atık su örneklerinin konsantrasyonu çok önemli bir adımdır. Ve bu adım, doğru tespit ve miktar tayini için esastır.

Bu prosedür, diğer enfeksiyöz ajanları tespit etmek ve ölçmek için kullanılacak RT-qPCR protokolünde farklı primerler kullanılarak uyarlanabilir. Teknik, atık su ve hava örneklerinde SARS-CoV-2'yi doğru bir şekilde ölçtü. Farklı patojenler farklı konumlardan tespit edilebilir ve ölçülebilir.