Name: Manuel Polinasyon, Mikroskopi ve S-Genotip Analizleri Kullanılarak Narenciyede Kendini-(In)uyumluluk, Uyumluluk-(In)uyumluluklarının ve Inter-(In)uyumluluklarının belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Öğrenin, Citrus maxima'da polen uyumluluğunu mikroskopi ve S-genotip analiziyle belirleyin. Bu yöntem, yetiştiricilerin uygun tozlayıcı ağaçları seçmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32122075, 32072523) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

1. Anilin mavisi boyama için hazırlık
<ol><li>Deney için aşağıdaki reaktifleri ve araçları hazırlayın: tozlayıcı fırça, cımbız, kurşun kalem, sülfat kağıdı, tozlaşma torbası, fermuarlı kilit torbaları, ataşlar, formaldehit, buzul asetik asit, mutlak etanol, santrifüj tüpleri, forseps, tutkal damlalıkları, cam slaytlar, örtüler, neşterler ve polietilen glikol.</li>
	<li>% 0.02 MgSO4,% 0.01 KNO 3,% 0.03 Ca (NO 3)2,% 0.01 H 3 BO 3,% 20 PEG-4000 ve% 15 sakkaroz içeren in vitro çimlenme ortamını hazırlayın. KOH ile pH'ı 6.0-6.2'ye ayarlayın. PEG-4.000'in çözülmesi zor olduğu için manyetik bir karıştırıcı kullanın.</li>
	<li>Carnoy'un mutlak etanol ve 3: 1 oranında karıştırılmış buzul asetik asit olan fiksatif çözeltisini hazırlayın. % 40 formaldehit,% 80 etanol ve buzul asetik asit (1: 8: 1) olan FAA fiksasyon çözeltisini hazırlayın. 0.1 MK3PO 4'te% 0.1 anilin mavisi olan 4 M sodyum hidroksit (NaOH) ve anilin mavisi çözeltisi hazırlayın. Anilin mavisi çözeltisini saklamak için kehribar bir şişe kullanın, çünkü ışığa duyarlıdır.</li>
</ol>2. Polen toplama
<ol><li>Deney ağaçlarının çiçeklenme dönemini (bu çalışmada Ma jia pummelo) önceden bilin. Çiçeklenme döneminin başlangıcından en yüksek çiçeklenme aşamasına kadar olgun açılmamış çiçekleri toplayın ve bir fermuarlı kilit torbasına koyun. Çiçekler buzdolabında 4 ° C'de 24 saat saklanabilir.</li>
	<li>Çiçekleri laboratuvara götürün. Anterleri toplamak için cımbız kullanın ve bunları filtre kağıdı içeren bir Petri kabına yerleştirin. 20 ila 30 çiçek arasında anterler toplayın.</li>
	<li>Anterleri içeren Petri kabını, polen taneleri kuruyana kadar 24 saat boyunca 28 ° C'lik bir fırına koyun. Ayrıntılı çiçek organizasyonu için Hu et al.9'a bakınız.</li>
	<li>Kurutulmuş poleni 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun. Polenleri, renk değiştiren silika jel (kurutucu) içeren hava geçirmez fermuarlı kilitli bir torbada saklayın. Torbayı kapatın ve torbayı polen çeşidinin adı ve depolama tarihi ile etiketleyin. Kurutulmuş polenler -20 °C buzdolabında 96 hafta16 saklanabilir.</li>
</ol>3. In vitro polen çimlenme testi
<ol><li>Bir hücre kültürü kabına veya 2 mL'lik bir santrifüj tüpünün kapağına 300 μL sıvı ortam dökün ve poleni bir tozlaşma fırçası yardımıyla eşit şekilde serpin. Polenleri 28 ° C'de nemlendirilmiş karanlık bir ortamda 12 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>1.000 μL pipet ucunun ucunun üst 1 mm'sini çıkarın. Polenleri az miktarda kültür çözeltisiyle emmek için pipeti kullanın ve mikroskop slaytının ortasına taşıyın. Bir kapak fişi ile örtün. 10x objektif kullanarak numuneyi ters çevrilmiş bir mikroskopla gözlemleyin.</li>
	<li>Her replika17 için yaklaşık olarak aynı polen yoğunluğunu kullanarak üç bağımsız replika gerçekleştirin. Polen miktarını görsel olarak yönetin, Petri kabının tamamının polenle kaplı olduğundan ve her Petri kabının neredeyse eşit miktarda polen içerdiğinden emin olun.</li>
	<li>Çimlenmiş polen, çapının yaklaşık iki katı uzunluğunda bir polen tüpü üretir. Tüm polen alanlarındaki çimlenmiş polenlerin yüzdesini veren 20 görsel alandan çimlenme oranını hesaplayın.</li>
</ol>4. Tozlaşma
<ol><li>Tozlaşma için rüzgarsız güneşli bir gün seçin. Açılmak üzere olan 10 tam gelişmiş tomurcuk seçin, yaprakları dikkatlice soyun ve çürümemeye dikkat edin.</li>
	<li>Stigmanın yüzeyine yeterli miktarda canlı polen yaymak için bir tozlaşma fırçası kullanın ve pistile zarar vermemeye dikkat edin. Kendi kendine tozlaşma için, polenleri aynı bitki / çeşitten kullanın. Çapraz tozlaşma için, poleni farklı bir genotipe sahip bir bitkiden kullanın.</li>
	<li>Tozlaşan çiçekleri bir sülfat kağıt torba ile örtün. Torbayı kapatmak ve genotipik olarak farklı polenler tarafından tozlaşmayı önlemek için bir ataş kullanın.</li>
	<li>Etikete türlerin adını ve tozlaşma sayısını ve zamanını yazın. Etiketi tozlaşmış çiçeklerin yakınındaki dallara asın.</li>
</ol>5. Örnekleme, sabitleme ve koruma
<ol><li>Tozlaşmadan yaklaşık 3-4 gün sonra tozlaşma torbalarını çıkarın ve tozlaşan çiçekleri fermuarlı torbalarda toplayın.</li>
	<li>Yaprakları, kapları ve yumurtalıkları çiçeklerden derhal çıkarın ve stillere kaynaşmış damgaları, taze hazırlanmış bir fiksatif çözelti içeren bir santrifüj tüpüne batırın. Fiksatif çözeltideki stigmaları ve stilleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, fiksatif çözeltiyi atın ve stigmaları ve stilleri% 95 etanol içinde iki ila üç kez yıkayın.</li>
	<li>Stilleri% 70'lik bir etanol çözeltisine aktarın. Numunenin çözeltiye tamamen daldırıldığından emin olun. Bu aşamadaki stiller 1-2 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.</li>
</ol>6. Anilin mavisi boyama
<ol><li>%70 etanol içinde saklanan stil numunelerini damıtılmış suyla üç ila dört kez yıkayın. 4 M NaOH çözeltisine daldırın, kapatın ve 60 dakika boyunca 65 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin. Bu adımda, stilin rengi sarı-beyazdan turuncu-kırmızıya değişir.</li>
	<li>Stilleri damıtılmış suda 30 dakika bekletin. Damıtılmış suyu atın ve stilleri üç ila dört kez veya stilin rengi sarı olana kadar damıtılmış suyla yıkayın.</li>
	<li>Numuneyi 10 mL'lik bir tüpe yerleştirin, numune daldırılana kadar anilin mavisini ekleyin ve karanlıkta 12 saat boyayın.</li>
	<li>Polen tüpü büyümesini floresan mikroskobu ile gözlemleyin.</li>
</ol>7. Floresan mikroskobu
<ol><li>Örnekleri gözlemlemeden önce, slaydı düz bir masaya yerleştirin ve slaydın yüzeyine iki ila üç damla polietilen glikol ekleyin.</li>
	<li>Dikkat edilecek stili damıtılmış su ile yıkayın. Uzunlamasına eksen boyunca iki yarıya bölmek için bir neşter kullanın. Stilin yarısını cam slayta yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün.</li>
	<li>Slaytı mikroskop sahnesine diyafram açıklığının üzerine yerleştirin ve 10x hedef kullanarak görselleştirin. DAPI filtresini kullanın (uyarım: 325-375 nm; emisyon: 435-485 nm). Her tozlaşma türü için beş stile dikkat edin. Polen tüpü büyümesini gözlemleyin.</li>
</ol>8. PCR tabanlı S genotipi tanımlama
<ol><li>CTAB yöntemi18'i kullanarak stigma örneğinden genomik DNA'yı çıkarın.<ol><li>Toplanan yaprakları 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun ve sıvı azotta tutturun. HCl:EDTA:NaCl:H2O tamponunu 1:1:3:5 oranında ve kloroform izoamil alkol karışımını 24:1 oranında hazırlayın</li>
		<li>50 mL'lik bir santrifüj tüpüne hazırlanan tampondan 10 mL, 0.2 g CTAB ve 200 μL merkaptoetanol ekleyin ve çözelti berrak ve şeffaf hale gelene kadar 5 dakika boyunca 65 ° C'de bir su banyosuna koyun.</li>
		<li>Bıçakları bir harç içine koyun, dondurulmuş numuneleri ekleyin, sıvı azot ekleyin ve öğütün. Öğütülmüş numuneyi 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun, 600 μL CTAB karışımı ekleyin, 60 dakika boyunca 65 ° C'de bir su banyosuna koyun ve her 30 dakikada bir baş aşağı karıştırın.</li>
		<li>700 μL kloroform izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin ve 10 dakika boyunca baş aşağı karıştırın. 10 dakika boyunca 12.000 x g'de 24 °C'de santrifüj, süpernatanı pipet edin ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
		<li>60 μL 5 M NaCl çözeltisi ve 1 mL mutlak etanol ekleyin ve baş aşağı karıştırın. 30 dakika boyunca -20 ° C'de dondurun ve 5 dakika boyunca 24 ° C ve 9.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatanı atın, 1 mL% 70 etanol çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1-2 saat bekletin. 24 ° C'de santrifüj, 5 dakika boyunca 9.000 x g , süpernatanı atın, fazla etanol çözeltisini aspire edin ve 5 dakika boyunca hava ile kurutun.</li>
		<li>Çözünmesi için 100 μL steril su ekleyin, DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün ve uzun süreli depolama için -4 ° C'lik bir dondurucuda dondurun.</li>
		<li>RT-PCR reaksiyon sistemini yapılandırın. Aşağıdaki reaksiyon karışımını, 5 μL 2x PCRMix, her biri 0,25 μL ileri ve geri astar, 1 μL DNA (100 ng / μL) ve 3,5 μLH2O içeren 10 μL için hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR programını Tablo 1'e göre ayarlayın. Tüm izoformlar için PCR programı 5 dakika 32x için 95 °C (30 s için 95 °C, 30 s için 55 °C ve 1 dakika için 72 °C) ve 5 dakika boyunca 72 °C idi. Ürünleri %1,5 TAE-agaroz jelleri üzerinde ayırın ve fotoğraf9. Genomik DNA kullanarak belirtilen S genotipini doğrulayın.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li>
<li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+selection+maintains+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22China+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li>
<li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li>
<li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li>
<li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li>
<li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+%26%2334%3BGuiyou+No.+1%26%2334%3B+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &#34;Guiyou No. 1&#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199(2021).</li>
<li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li>
<li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li>
<li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li>
<li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li>
<li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896(2019).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars%3A+self-incompatibility%2C+S-RNase+allele+identification%2C+and+incompatibility+group+assignment.+%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. </a> Frontiers in Plant Science. 9, 527(2018).</li>
<li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Studies%22%5BJournal%5D)">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1(2018).</li>
<li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).</li>
<li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li>
<li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatibility+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li>
<li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li>
<li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring%2C+hand+pollinations%2C+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897(2020).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+self-+and+inter-%28in%29compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination%2C+microscopy+and+genetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241(2020).</li>
</ol>

Yazarlar açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.

Meyve bitkilerinde, hem partenokarpi hem de SI önemli özelliklerdir, çünkü çekirdeksiz meyvelerin yolunu açarlar - tüketiciler tarafından çok takdir edilen bir özellik. Kendi kendine uyumsuzluk, kendi kendine polenin reddedilmesini teşvik eder ve böylece akrabalığı önler20. Narenciye arasında, pummelo kendi kendine uyumsuz bir çeşittir7. Tüm anjiyosperm türlerinin neredeyse% 40'ı SI21 sergiler. Bu özellik meyve tutumunu önler, verimi düşürür ve yetiş...

Kendine uyumsuzluk (SI), anjiyosperm türlerinin yaklaşık %40'ında bulunan genetik olarak kontrol edilen bir mekanizmadır. Bu süreçte, pistil aynı SI genotipine sahip bir bitkiden poleni reddeder ve böylece kendi kendine döllenmeyi önler 1,2. Ma jia pummelo, Çin'in Jinagsu eyaletinde, büyük, pembe meyve, zengin meyve suyu içeriği, tatlı ve ekşi bir tat ve kalın bir kabuğun mükemmel nitelikleri ile yerel bir çeşittir3. SI, geçişi teşvik etmesine rağmen, meyvelerin verimini ve kalitesini olumsuz yönde etkiler4 ve güvenilir meyve tutum oranları ve yüksek verim için farklı SI genotiplerine sahip uygun tozlaştırıcı ağaçlar gerektirir. Şu anda, Brassicaceae tarafından temsil edilen sporofitik öz uyumsuzluk (SSI) ve Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae ve Solanaceae 5,6,7,8 tarafından temsil edilen gametofitik öz uyumsuzluk (GSI) olmak üzere iki ana SI türü vardır.
Narenciye dünyanın en önemli meyve bitkilerinden biridir. S-RNaz bazlı GSI sistemi birçok narenciye katılımında bulunur ve meyve verme oranını olumsuz yönde etkiler9. Bu sistemde SI, pistil S determinantlarını ve polen S determinantlarını taşıyan iki karmaşık aleli olan tek bir polimorfik lokus olan S lokusu tarafından kontrol edilir7. Dişi determinant S ribonükleazdır (S-RNase) ve erkek determinant S lokus F-kutusu (SLF)7'dir. Pistilin hücreleri S-RNaz proteinlerini salgılar. Kendinden olmayan S-RNazlar, SLF proteinleri tarafından tanınır, bu da 26S proteazom yolu tarafından kendinden olmayan S-RNazların ubikitinasyonuna ve bozulmasına yol açar. Buna karşılık, kendi kendine S-RNazlar polen tüpü (PT) büyümesini biriktirebilir ve inhibe edebilir, çünkü SLF proteinlerinden kaçınırlar ve bu nedenle ubikitinzasyondan 10,11,12,13 önlenirler.
Burada, S-genotiplerini ve polen uyumluluğu ve uyumsuzluğunun derecelerini tanımlamak için yararlı olan bir in vivo tekniği sunuyoruz. Protokol, yapraklardan toplam DNA'nın çıkarılmasını ve S'ye özgü primerler kullanılarak S genotipinin tahmin edilmesini içerir. Ayrıca, anilin mavisi boyama ve floresan mikroskobu ve ardından el tozlaşması, uyumluluk ve uyumsuzluk derecesi için kanıt sağlar. Laboratuarda çiçeklerin manuel olarak tozlaşmasını içeren yarı in vivo tozlaşma prosedürü14,15, kendi kendine uyumluluk ve uyumsuzluk derecelerini değerlendirmek için de uyarlanmıştır. Bununla birlikte, polen tüplerinin doğal koşullarda gelişmesine izin vermek için istenmeyen polenlerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için tarla tozlaşmasını ve ardından çiçeklerin torbalanmasını da kullandık. Bu protokol basit ve anlaşılırdır ve uygun tozlaştırıcı ağaçların başarılı bir şekilde seçilmesi için gerekli bilgileri sağlar.

<table><tbody><tr><td>mutlak etanol</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Anilin mavisi</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borik asit, H3BO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>Kahverengi şişe</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum nitrat tetrahidrat, Ca (NO3) 2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>80029062</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüp</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>santrifüj tüpleri</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>57-09-0 (CAS)</td><td></td></tr> <tr><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd'yi</td><td></td><td></td> <td>Bırakma</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit, EDTA</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10009617</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>LUXIANZI Biyoteknoloji Co, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formaldehit</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Tam otomatik numune hızlı öğütücü</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td>Tissuelyser-96</td><td></td></tr><tr><td>buzlu asetik asit</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td></td></tr><tr><td>Öğütme Borusu Şangay</td><td>Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzoamil alkol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10003218</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>etiketi</td><td>M& G Chenguang Kırtasiye Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8</td><td>Şangay Leica Co., Ltd</td><td>21903797</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat, MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>MIKROSKOP Kapak camı</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>ataç</td><td>M& G Chenguang Kırtasiye Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kalem</td><td>M& G Chenguang Kırtasiye Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tozlayıcı fırça</td><td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol, PEG 6000</td><td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td><td>DH229-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol, PEG-4000</td><td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td><td>1521GR500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit, KOH</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017008</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum nitrat, KNO3</td><td>Sinopharm Kimyasal ReagentCo, Ltd</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Jiangsu Songchang Tıbbi Ekipman Co, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>slayt</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit, NAOH</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sinopharm Kimyasal ReagentCo., Ltd</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>sülfat kağıdı</td><td>Taizhou Jinnong Mesh Fabrikası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termostat su banyosu</td><td>Şangay Jinghong Deneysel Equipment Co, Ltd</td><td>L-909193</td><td></td></tr><tr><td>Triklorometan</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Tripotasyum fosfat tribazik trihidrat, K 3 PO 4 </td> <td>Şanghay Lingfeng Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>20032318</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>zip kilit çantaları</td><td>M & G Chenguang Kırtasiye Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>GEN-VIEW BİLİMSEL A.Ş</td><td>. 60-24-2 (CAS)</td><td></td></tr></tbody></table>

manuel polinasyon, mikroskopi ve s-genotip analizleri kullanılarak narenciyede kendini-(in)uyumluluk, uyumluluk-(in)uyumluluklarının ve inter-(in)uyumluluklarının belirlenmesi

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Narenciye, kendi kendine poleni reddetmek için S-RNaz bazlı kendi kendine uyumsuzluğu kullanır ve bu nedenle başarılı tozlaşma ve gübreleme için yakındaki tozlaştırıcı ağaçları gerektirir. Bununla birlikte, tozlaştırıcı olarak hizmet etmek için uygun çeşitlerin belirlenmesi zaman alıcı bir süreçtir. Bu sorunu çözmek için, agaroz jeli elektroforezi ve anilin mavisi boyama kullanan tozlaşma uyumlu narenciye çeşitlerini tanımlamak için hızlı bir yöntem geliştirdik. Polen uyumluluğu, toplam DNA'nın çıkarılması ve spesifik primerlerle PCR tabanlı genotipleme testlerinin yapılması ile S genotiplerinin tanımlanmasına dayanarak belirlenir. Ek olarak, stiller manuel tozlaşmadan 3-4 gün sonra toplanır ve anilin mavisi boyama yapılır. Son olarak, polen tüplerinin büyüme durumu floresan mikroskobu ile gözlemlenir. Polen uyumluluğu ve uyumsuzluğu, polen tüpü büyümesinin sırasıyla normal mi yoksa baskılanmış mı olduğu gözlemlenerek belirlenebilir. Sadeliği ve maliyet etkinliği nedeniyle, bu yöntem, farklı çeşitler arasında uyumsuzluk grupları ve uyumsuzluk ilişkileri kurmak için farklı narenciye çeşitlerinin polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için etkili bir araçtır. Bu yöntem, uygun tozlaştırıcı ağaçların başarılı bir şekilde seçilmesi için gerekli bilgileri sağlar ve böylece yeni meyve bahçelerinin kurulmasını ve ıslah programları için uygun ebeveynlerin seçilmesini kolaylaştırır.

Burada yapılan deneyler için olgun çiçekler seçildi, anterler toplandı, bir fırında kurutuldu ve polenler 12 saat boyunca 28 ° C'de çimlendi. Polen canlılığı ve çimlenme oranları Şekil 1'de gösterildiği gibi ölçülmüştür.
Narenciye manuel olarak tozlaştırıldı ve polen uyumluluğu ve uyumsuzluğu anilin mavisi boyama ve floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi. Uyumlu polen, stigmanın yüzeyinde çimlenebilir ve büyüyebilecek ve sonuçta yumurtalıkta döllenmeye y...

Bu protokol, narenciye çeşitlerinde polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için hızlı bir yöntem sağlar.

Manuel Polinasyon, Mikroskopi ve S-Genotip Analizleri Kullanılarak Narenciyede Kendini-(In)uyumluluk, Uyumluluk-(In)uyumluluklarının ve Inter-(In)uyumluluklarının belirlenmesi

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

Bu teknik, S genotipini etkili bir şekilde tanımlayabilir ve narenciye öz uyumsuzluğunu doğru bir şekilde tanımlayabilir ve uygun polenleştirici ağaçlarının seçilmesi için gerekli bilgileri sağlayabilir. Bu, ıslah programlarında uygun ebeveyn ağaçlarını seçmek için zaman verimli, basit ve güvenilir bir tekniktir. Bu tekniğin yapılması basit ve kolaydır ve ilk kez deney yapmak sabır ve özen gerektirir.S genotipinin tanımlanması ve S'ye özgü astar tasarımı daha fazla dikkat ve özen gerektirir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olan Yu Hu olacak. Polen toplamaya Majia pomelo, Citrus maxima, çiçekleri laboratuvara götürerek başlayın.Anterleri cımbız kullanarak toplayın ve filtre kağıdı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Anterleri içeren Petri kabını 24 saat boyunca 28 santigrat derecelik bir fırına koyarak polen tanelerini kurutun. Kuruduktan sonra, poleni renk değiştiren silika jel içeren Micro Centron hava geçirmez fermuarlı kilitli bir torbada saklayın.Torbayı kapatın ve torbayı polen çeşidinin adı ve depolama tarihi ile etiketleyin. İki mililitrelik bir santrifüj tüpünün kapağına 300 mikrolitre sıvı ortam dökün ve poleni bir tozlaşma fırçası yardımıyla eşit şekilde serpin. Polenleri nemlendirilmiş bir kara kutuya yerleştirin ve 12 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, üst bir milimetrelik ucu 1.000 mikrolitrelik pipet ucundan kesin ve poleni az miktarda kültür çözeltisi ile aspire edin. Polenleri mikroskop slaytının ortasına yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün. İşiniz bittiğinde, 10X hedefi kullanarak ters çevrilmiş bir mikroskopla numuneyi gözlemleyin.Her replika için yaklaşık olarak aynı polen yoğunluğunu kullanarak üç bağımsız replika gerçekleştirin. Tozlaşma için, yeterli miktarda canlı poleni stigmanın yüzeyine yaymak için bir tozlaşma fırçası kullanın ve pistile zarar vermediğinizden emin olun. Tozlaşan çiçekleri bir sülfat kağıt torba ile örtün ve torbayı bir ataş kullanarak kapatarak genotipik olarak farklı polenler tarafından tozlaşmayı önleyin.Etikete türlerin adını ve tozlaşma sayısını ve zamanını yazın. Etiketi tozlaşmış çiçeklerin yakınındaki dallara asın. Tozlaşmadan yaklaşık üç ila dört gün sonra tozlaşma torbalarını çıkarın ve tozlaşan çiçekleri fermuarlı kilit torbalarında toplayın.Yaprakları, kapları ve yumurtalıkları çiçeklerden derhal çıkarın ve stilize etmek için kaynaşmış damgalamayı taze hazırlanmış bir fiksatif çözelti içeren bir santrifüj tüpüne batırın. Fiksatif çözeltideki damgalama ve stili gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, stigmayı yıkamadan önce fiksatif çözeltiyi atın ve % 95 etanol içinde iki ila üç kez şekillendirin.Ardından, stile% 70 etanol çözeltisi ekleyerek numunenin çözeltiye tamamen daldırılmasını sağlayın. Bu aşamadaki stiller bir ila iki ay boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Anilin mavisi boyama için,% 70 etanol içinde saklanan stil örneklerini damıtılmış suyla üç ila dört kez yıkayın.Dört molar sodyum hidroksit çözeltisine daldırın ve 60 dakika boyunca 65 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe etmeden önce kapatın. Bu adımda, stilin rengi sarı-beyazdan turuncu-kırmızıya değişir. Ardından, stilleri damıtılmış suya batırın.30 dakika sonra, damıtılmış suyu atın ve stilleri damıtılmış suyla üç ila dört kez veya stilin rengi sarı olana kadar yıkayın. Ardından, numune suya batırılana kadar anilin mavisini ekleyin ve karanlıkta 12 saat boyunca inkübe edin. Polen tüpü büyümesini floresan mikroskobu altında gözlemleyin.Slaytı düz bir masaya yerleştirin. Bir neşter kullanarak stili uzunlamasına eksen boyunca iki yarıya bölün. Stilin bir yarısını bir cam slayta yerleştirin ve slaytın yüzeyine iki ila üç damla polietilen glikol ekleyin.Ardından, bir kapak fişi ile örtün. İşiniz bittiğinde, slaytı diyafram açıklığının üzerindeki mikroskop aşamasına yerleştirin ve 10X'lik bir hedef kullanarak görselleştirin. DAPI filtresini kullanın ve polen tüpü büyümesini gözlemleyin.Her tozlaşma türü için beş stile dikkat edin. Citrus maxima'nın polen canlılığı ve çimlenme oranları floresan mikroskopi kullanılarak ölçüldü. Uyumlu polen, stigmanın yüzeyinde başarılı bir şekilde çimlendi ve normal bir polen tüpü üretti, bu da büyüdü ve sonuçta yumurtalıkta döllenmeye yol açtı.Buna karşılık, uyumsuz polen tüpleri stilin yaklaşık 2 / 3'ü boyunca büyüdü ve daha sonra büyümeyi durdurdu. Agaroz jel elektroforezi, S lokusuna özgü primerler kullanılarak güçlendirilmiş DNA ürününü tespit etti. DNA ürününün 500 ila 1.000 baz çifti arasında amplifikasyonunu gösterdi.Karşılık gelen S genotipi tanımlandı. Bu yöntem kullanılarak farklı narenciye türlerinde 21 S haplotipi tanımlanmıştır. Tozlaşma adımı kritiktir.Sadece başarılı tozlaşma, polen tüplerinin daha sonra gözlemlenmesini sağlayabilir. Teknik, öz-uyumsuzluk özelliklerini analiz etmek ve öz-uyumsuzluğun kadın belirleyicilerini araştırmak ve tanımlamak için kullanılmıştır. Bu yöntem, kendi kendine uyumsuzluk araştırma ve ıslah programları için önemlidir.Ayrıca, çiftçi topluluğunun meyve bahçeleri için polenleştirici ağaçları seçmesini kolaylaştırabilir.

determination-self-compatibility-inter-compatibility-relationships

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz Setaris viridis'e (S. viridis) haçları gerçekleştirmek için bir metodoloji geliştirdik. Yöntem, uygun bir polen öldürmek için önce bir sıcak su tedaviye salkım budama içerir. Haçlar iyi-kontrollü bir büyüme rejimi aşağıdaki gerçekleştirilen ve genellikle 1 tohum / s salkımda başına çapraz tozlaşma 7 kurtarma neden vardır.

In Cross Sahne Yöntemleri<em&gt; Setaris viridis&#39;in</emOtlar için&gt; Yeni Bir Model Sistemi

Belirli bir bitki türünün tozlaştırıcılar etkinliğini göstermek için, saha deneyleri birden çok yöntem geliştirilmiştir. Bu çalışma Lycoris sanguinea var. Sanguinea vaka çalışması ve yeni tozlaşma mekanizması, kırma-tomurcuk tozlanma kullanarak tozlaşma ekoloji için tarla denemeleri temel yöntem gösterilmektedir.

Tozlaşma Ekoloji Saha Deneyleri: Örneği<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Bu protokol için ant Vollenhovia emeryiiçin akraba evliliği haçlar iletken ve bu haçlar başarısını değerlendiren yöntemler açıklanmıştır. Bu protokoller seks belirlenmesi sistemlerinde Hymenoptera genetik temeli anlama amaçlayan deneyler için önemlidir.

İndüksiyon ve karınca, Vollenhovia Emeryi kullanarak akraba evliliği haçlar değerlendirilmesi

Burada, çiçekli phytotron koşullar altında mandalina ağaçları içindeki zorlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Su stresi, yüksek Aydınlatma şiddeti ve kısa bir süre içinde elde edilecek uygun çiçek izin bir simüle bahar photoperiod. Bu yöntem 1 yıl içindeki birkaç çiçekli dönemleri araştırmacılar sağlar.

Phytotron koşullar altında mandalina ağaçlarında çiçeklenme zorla

Arabidopsis çift döllenmede sperm nükleer morfolojisi temelinde epifloresan mikroskobu kullanılarak başarılı veya başarısız döllenmeyi belirlemek için bir yöntem gösterilmektedir.

Arabidopsis Çift Döllenmede Sperm Nükleer Morfolojisinin İzlenmesi ile Döllenme Durumunun Değerlendirilmesi

Flüoresan mikroskopi ile öz-genotiyon un belirlenmesini birleştiren kayısı(Prunus armeniaca L.) çeşitlerinin tozlaşma gereksinimlerini niçin pcr analizi ile s-genotipinin tanımlanması ile biraraya getiren bir metodoloji salıyoruz.

El-Tozlaşma, Mikroskopi ve Genetik Analizleri Birleştiren Kayısıda Öz ve İnter-(in)Uyumluluk İlişkilerinin Belirlenmesi

Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji, floresan mikroskopisi altındaki polen tüplerinin alan ve laboratuvar tozlaşmalarını ve gözlemlerini, S-genotiplerinin PCR tarafından tanımlanması ve tozlayıcıların seçimi için çiçeklenmenin izlenmesi ile birleştiren bir metodoloji açıklanmaktadır.

Fenolojik İzleme, El Tozlaşmaları, Floresan Mikroskopisi ve Moleküler Genotipleme ile Japon Eriğinde Tozlaşma Gereksinimlerinin Oluşturulması

Bu çalışmada, maya Saccharomyces cerevisiae'de çiftleşme verimliliğinin ölçülmesi için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, türleşme çalışmalarında zigotik öncesi bariyerlerin nicelleştirilmesi için özellikle yararlıdır.

Saccharomyces cerevisiae'de Haploidlerin Çiftleşme Etkinliğinin Belirlenmesi

Arabidopsis thaliana'da polen hidrasyon profillerini ölçmek için geliştirilmiş bir yöntem burada açıklanmaktadır. Yeni yöntem daha yüksek çözünürlük sunar, invaziv değildir ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Protokol, tozlaşmanın erken aşamalarını düzenleyen süreçlerin daha ince bir diseksiyonu için yeni bir aracı temsil etmektedir.

Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, In Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Öğrenin, Citrus maxima'da polen uyumluluğunu mikroskopi ve S-genotip analiziyle belirleyin. Bu yöntem, yetiştiricilerin uygun tozlayıcı ağaçları seçmesine yardımcı olur.

Manuel Polinasyon, Mikroskopi ve S-Genotip Analizleri Kullanılarak Narenciyede Kendini-(In)uyumluluk, Uyumluluk-(In)uyumluluklarının ve Inter-(In)uyumluluklarının belirlenmesi (Video) | JoVE Journal

Manuel Polinasyon, Mikroskopi ve S-Genotip Analizleri Kullanılarak Narenciyede Kendini-(In)uyumluluk, Uyumluluk-(In)uyumluluklarının ve Inter-(In)uyumluluklarının belirlenmesi

Daha fazla video keşfet