Yağsız Süt Flokülasyonu ve Ultrafiltrasyon Kullanılarak Çevresel Su ve Atık Su Numunelerinden Virüs Partiküllerinin Konsantrasyonu

Su bazlı ve atık su epidemiyolojisi, topluluklardaki salgınların seyrini izlemek ve tahmin etmek için alternatif bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Yağsız süt flokülasyon yöntemi, konsantre mikroplara alternatif bir yaklaşımı temsil eder. Yağsız süt flokülasyon yöntemi, ultra filtrasyon veya teğetsel akış filtrasyon yaklaşımlarına kıyasla önemli bir fark olmadan mikrobiyal fraksiyonları konsantre etmek için çok yönlü, ucuz ve kolay bir hands-off yöntemini temsil eder.

Bu yaklaşım metagenomik veya hedefli PCR çalışmaları için kullanılır. Mikrobiyal fraksiyonlar konsantre edildikten sonra, nükleik asit ekstraksiyonu ticari ekstraksiyon kitleri veya şirket içi protokol kullanılarak gerçekleştirilebilir. Yağsız süt flokülasyon yöntemi, büyük veya küçük hacimli su veya atık su numuneleri için nispeten daha kolaydır.

Bu yöntemin bir parçası olarak Milli-Q su ile bir arka plan kontrolü dahil edilmelidir. Prosedürü gösterenler, Miguel Uyaguari'nin laboratuvarından yüksek lisans öğrencileri Kadir Yanac, Jhannelle Francis ve Jocelyn Zambrano-Alvarado olacak. Başlamak için, iki litre 24 saatlik akış orantılı kompozit atık su numunesi toplayın.

Numuneleri bir buz kutusunda ışık geçirmez şişelerde laboratuvara taşıyın ve 24 saat içinde işleyin. Atıksu arıtma tesisi teknik personelinden atıksu özellikleri verilerini alın. Her ultra filtrasyon yöntemi için, zırhlı RNA'nın beş kez 10 ila dördüncü kopyalarına, bir tarihte toplanan altı taze atık su örneğinin her birinin 140 mililitresine ve başka bir tarihte altı taze atık su örneğine beş kez 10 ila dördüncü kopya halinde yerleştirin.

Manyetik bir karıştırma üzerinde dört santigrat derecede 30 dakika karıştırarak numunedeki zırhlı RNA'yı homojenize edin. Yağsız süt topaklaştırması veya SMF için, 50 mililitre sentetik deniz suyunda 0,5 gram yağsız süt tozunu çözerek% 1 yağsız süt çözeltisi hazırlayın. SMF'nin pH'ını normal bir hidroklorik asit kullanarak 3.5'e ayarlayın.

500 mililitre ham atık su numunesine beş mililitre yağsız süt çözeltisi ekleyin. Numuneyi sekiz saat karıştırın ve oluşan sürülerin oda sıcaklığında sekiz saat daha yerleşmesine izin verin. Yerleşmiş sürüleri rahatsız etmeden serolojik bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın.

Sürüleri içeren 50 mililitrelik son bir hacmi bir santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve sterilize edilmiş bir spatula kullanarak peletleri dikkatlice kazıyın. Kalan peleti 250 mikrolitre 0.2 molar sodyum fosfat tamponunda tekrar askıya alın.

Kazınmış ve yeniden askıya alınmış peletleri aynı 1,5 mililitrelik mini santrifüj tüpüne aktarın. Üreticinin talimatlarına göre, atık su numunelerinin viral konsantrelerinden viral RNA ekstraksiyonu ve geri kazanım verimliliği analizlerini, 25: 24: 2: 1 fenolün kloroforma ve izoamil alkole ve beta merkaptoetanol oranına sahip bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak gerçekleştirin. Son olarak, RNA'yı 50 mikrolitre elüsyon tamponunda boşaltın.

RT-qPCR analizi için, sentetik tek sarmallı DNA veya gBlock yapısının on kat seyreltmesini kullanarak zırhlı RNA'yı sayısallaştırın. Her RT-qPCR çalıştırması için kalibrasyon eğrileri edinin. Negatif denetimleri dahil edin ve örnekleri üçlü olarak çalıştırın.

10 litre çevresel yüzey suyu örneği toplayın. Arka plan kontrolü için 10 litre deiyonize su ekleyin. Metagenomik dizileme sırasında gürültüyü en aza indirmek için 0,45, 0,2 ve 0,1 mikron boyutlarında membran disk filtreleri kullanarak kapsül ve vakum filtrasyonu gerçekleştirin.

Filtrelemeden sonra, bir normal hidroklorik asit kullanarak su numunesinin pH'ını 3,5'e ayarlayın. % 1 önceden topaklanmış yağsız süt çözeltisi hazırlayın ve pH'ı 3,5'e ayarlayın. 10 litre asitleştirilmiş çevresel su numunesine 100 mililitre asitleştirilmiş yağsız süt çözeltisi ekleyin.

Numuneyi manyetik bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında sekiz saat karıştırın ve sürülerin sekiz saat daha yerçekimi ile çökelmesine izin verin. Yerleştikten sonra, sürüleri rahatsız etmeden bir vakum pompası kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın. Aliquot ve kalan sürüleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpü ve santrifüjdeki ağırlığa göre dengeleyin.

Süpernatantı çıkarın ve peleti 200 mikrolitre 0.2 molar sodyum fosfat tamponunda çözün. Ekstraksiyon işlemi sırasında koptupite olan serbest DNA ve RNA'yı ortadan kaldırmak için üreticinin talimatlarını izleyerek çözünmüş peletleri DNaz I ve RNase A ile tedavi edin. İnkübasyondan sonra, DNaz I ve RNaz A.Bir DNA veya RNA ekstraksiyon kiti kullanarak çözünmüş peletten nükleik asitleri ekstrakte edin.

Bir florometre kullanarak çevresel yüzey suyu örneğinden çıkarılan toplam DNA veya RNA miktarını ölçün. İlgilenilen enterik virüsleri hedeflemek için qPCR analizi ve viral topluluk yapısını tanımlamak için Illumina dizilimi yapın. Korunan ve etkilenen su yollarından iki litre su örneği toplayın.

Numune önemli miktarda döküntü içeriyorsa, bunları çıkarmak için bir tülbent kullanın. Daha önce pH ayarlı iki litrelik tatlı su numunesine 20 mililitre %1 yağsız süt çözeltisi ekleyin. Numuneyi oda sıcaklığında sekiz saat karıştırın ve sürülerin sekiz saat daha yerçekimi ile çökelmesine izin verin.

Yerleştikten sonra, peristaltik bir pompa kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın. Tortulmuş sürüleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peletleri 200 mikrolitre 0.2 molar sodyum fosfat tamponunda yeniden askıya alın.

Üreticinin talimatlarını izleyerek tercih edilen nükleik asit izolasyon kitini kullanarak DNA ekstraksiyonu için sürünün yaklaşık 0,5 gramını seçin. Bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. 3.000 G'de ultra filtrasyon ile işlenen altı numunenin tümü pozitifti.

Buna karşılık, numuneler 7.500 G'de ultra filtrasyon ile işlendiğinde sadece bir numune pozitifti.SMF ile işlenen tüm numuneler pozitifti ve daha iyi geri kazanım ile sonuçlandı. 3.000 G ve SMF'nin ortalama geri kazanım oranları, 7.500 G'de ultra filtrasyondan önemli ölçüde ve tutarlı bir şekilde daha yüksekti.Etkilenen numunelerdeki su kalitesi parametreleri ve Winnipeg'de üç mevsim boyunca toplanan çevresel su örneklerinden ekstrakte edilen nükleik asitler burada özetlenmiştir. Nisan-Ekim 2022 tarihleri arasında Assiniboine Nehri suyundan toplanan örnekler, Ormanlık 1'den en yüksek DNA konsantrasyonunu verdi ve en düşük konsantrasyon üçüncü tarım alanından geri kazanıldı.

Doğru konsantrasyonda yağsız süt kullanmak ve kullanmadan önce numuneyi asitleştirmek çok önemlidir. Bu teknik, su ve atık su gibi çevresel örneklerde bulunan farklı mikrobiyal patojenlerin hızlı bir şekilde taranmasını sağlayabilir. Toprak veya tortular gibi katı matrisler kullanılarak ek modifikasyonlar uygulanabilir.