Name: Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Öğrenin, SW480 ve SW620 kanser hücre hatlarından düşük endotoksin içerikli hücre dışı vezikül izolasyonu yöntemini. Bu protokol, endotoksin kontaminasyonunu en aza indirerek güvenilir EV araştırmaları yapmanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi, 2019/33/B/NZ5/00647 hibe numarası ile desteklenmiştir. Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü'nden Profesör Tomasz Gosiewski ve Agnieszka Krawczyk'e EV'lerde bakteri DNA'sının tespitinde paha biçilmez yardımları için teşekkür ederiz.

1. Ultra santrifüj tüplerinin hazırlanması
<ol><li>Steril, tek kullanımlık tüpler kullanın. Bu mümkün değilse, ultrasantrifüj tüplerini steril bir Pasteur pipet veya diğer tek kullanımlık aplikatörler kullanarak bir deterjanla yıkadıktan sonra tekrar kullanın. Ultra santrifüj tüplerinin bir tür santrifüjlü malzemeye (hücre kültürü süpernatan / serum / plazma) ve türlere (insan / fare / vb.)</li>
	<li>Bir deterjanla yıkadıktan sonra, ultra santrifüj tüplerini deiyonize, LPS içermeyen suyla 3x durulayın. NOT: Düşük kaliteli su kullanmayın.</li>
	<li>Ultra santrifüj tüplerini kurutun ve% 70 etanol ile doldurun. Gece boyunca dezenfeksiyon için tüpleri% 70 etanol ile bırakın. Etanol çıkarın ve tüpleri tekrar kurutun.</li>
	<li>Tüpleri ve kapakları sterilizasyon ambalajına yerleştirin ve sıkıca kapatın. Plazma veya gaz (etilen oksit) sterilizasyon yöntemini kullanın18,19. Sterilizasyon ambalajı içinde bulunan ultrasantrifüj tüplerini kuru bir yerde saklayın ve son kullanma tarihinden önce kullanın. NOT: Fosfat tamponlu salin (PBS) içindeki LPS seviyesinin ve EV'lerin izolasyonu için kullanılan suyun aylık olarak izlenmesini sağlayın. İzleme, tüpleri de içermelidir (örneğin, ultrasantrifüj tüplerinde gece boyunca oda sıcaklığında [RT] depolanan suyu [yıkama kontrolü] test ederek).</li>
</ol>2. EV tükenmiş düşük endotoksin fetal sığır serumunun (EE-FBS) hazırlanması
<ol><li>Ultra düşük endotoksin FBS kullandığınızdan emin olun (ticari olarak temin edilebilir; bakınız Malzeme Tablosu; <0.1 AB / mL).</li>
	<li>Bir şişe ultra düşük endotoksin FBS'yi bir su banyosuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca 56 ° C'de inkübe edin. Bu adım, kompleman sistemini devre dışı bırakmak için gereklidir.</li>
	<li>Devre dışı bırakılmış FBS'yi ultra santrifüj tüplerine pipet edin ve 4 °C'de 4 saat boyunca 100.000 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı steril 50 mL'lik tüplere toplayın, kapak kontaminasyonunu önlemek ve tüpün halkasını ıslatmak için tüp başına 45 mL'yi aşmadığından emin olun.</li>
	<li>Bu şekilde hazırlanan EE-FBS serumunu -20 °C'de saklayınız. EE-FBS'deki LPS konsantrasyonunu kontrol edin (adım 6). LPS konsantrasyonu, ultrasantrifüjlemeden önceki ile aynı seviyede olmalıdır.</li>
</ol>3. Hücre kültürü
<ol><li>Bu çalışma için, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Kartal besiyerinde (DMEM) 4.5 g / L glikoz, L- glutamin, sodyum piruvat ve gentamisin (50 μL / mL) ile kültür SW480 ve SW620 hücre hatları, aseptik teknik kullanılarak 75cm2 kültür şişelerinde% 10 EE-FBS ile desteklenmiştir. SW480 ve SW620 için şişe başına sırasıyla yaklaşık 4,5 x 10 6 hücre ve 6,5 x 106 hücre tohumlayın.</li>
	<li>Süpernatantları haftada iki kez (şişe başına ~ 10 mL) hücreler tam akıcılığa ulaştığında toplayın (SW480 ve SW620 için şişe başına sırasıyla ~ 13.5 x 106 ve 20 x 106 hücre) ve bölün. Hücrelerin yaşayabilirliğinin% 99'dan az olmadığından ve hücrelerin% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de kültürlendiğinden emin olun.</li>
	<li>Süpernatantları hücre kültüründen uygun şekilde etiketlenmiş 15 mL tüplere toplayın. Hücre kalıntılarını temizlemek için toplanan süpernatantları RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantları dikkatlice toplayın, aspire edici döküntülerden kaçının, etiketli tüplere yerleştirin ve 4 ° C'de 12 dakika boyunca 3.200 x g'de tekrar santrifüj yapın.</li>
	<li>İkinci santrifüjleme adımından süpernatantları steril, etiketli 50 mL tüplere toplayın. Tüplerin kenarlarını ıslatmaktan kaçının. Süpernatant hacminin 45 mL'yi geçmediğinden ve tüplerin dikey olarak tutulduğundan emin olun.</li>
	<li>Tüpün kapağını steril şeffaf bir filmle sarın ve süpernatantları -80 ° C'de dikey konumda saklayın. NOT: Mycoplasma spp'nin aylık kontrolünü gerçekleştirin. ve taze kültür süpernatantlarında LPS kontaminasyonu (adım 6). Süpernatantlardaki endotoksin seviyesi 0.05 EU / mL'yi aşarsa, kontaminasyonun hangi aşamada meydana gelmiş olabileceğini doğrulayın ve işlemi en baştan başlatın. Hücre kültürünün Mycoplasma spp ile kontaminasyonu durumunda. tespit edilirse, EV'lerin bu tür süpernatantlardan izolasyonu durdurulmalıdır.</li>
</ol>4. EV'lerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu
<ol><li>0.22 μm şırınga filtreleri ve uygun hacimde şırıngalar hazırlayın. Kültür süpernatantları (90 mL) ile iki tüp hazırlayın.</li>
	<li>Şırıngayı süpernatant ile doldurun ve filtreyi iğne adaptörüne takın. Doldurulmuş şırıngayı filtreyle birlikte 50 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. Piston flanşını itin ve ~ 90 mL filtrat toplayın.</li>
	<li>Filtreyi (7 mL) ultra santrifüj tüplerine pipet edin (uygun denge için her bir tüpe aynı hacmin pipetlenmesini sağlayın) ve 4 °C'de 2 saat boyunca 100.000 x g'de santrifüjleyin. NOT: EV'lerin peletlenmesinin verimliliği, EV'lerin20'sinin daha iyi geri kazanılması için optimize edilmesi gereken birçok faktöre (örneğin, rotor tipi, k-faktörü, göç yolu uzunluğu, ortamın viskozitesi vb.) bağlıdır.</li>
	<li>Steril bir Pasteur pipet kullanarak süpernatantı atın. Uzun, filtrelenmiş pipet uçlarını kullanarak kalan peletleri toplayın ve iki ultrasantrifüj tüpünde toplayın. EV'leri durulamak için filtrelenmiş endotoksin içermeyen PBS ile 7 mL'ye kadar doldurun.</li>
	<li>PBS ile yeniden askıya alınmış peletleri 100.000 x g'de 4 °C'de 2 saat boyunca santrifüj edin. Steril bir Pasteur pipet kullanarak süpernatantı tamamen çıkarın ve EV'leri yeniden askıya almak için her iki tüpe de 200 μL filtrelenmiş, endotoksin içermeyen PBS ekleyin. Tüm EV'leri toplamak için EV'lerin peletini nazikçe pipetin.</li>
	<li>EV'lerin süspansiyonunu steril bir 1,5 mL test tüpüne aktarın (mümkünse, düşük proteinli bir bağlama tüpü kullanın). Nanopartikül izleme analizi (NTA) ve diğer amaçlar (örneğin, protein konsantrasyonu ölçümü) için bir seyreltme hazırlamak için EV süspansiyonunun 10 μL'sini koruyun.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre, NTA ile ölçümler için EV'leri filtrelenmiş PBS (1: 1.000) ile seyreltin. Kapağı steril şeffaf bir filmle sararak EV tüplerini sabitleyin. EV'leri -80 ° C'de saklayın.</li>
</ol>5. Batı lekelenmesi ile spesifik belirteçlerin tespiti
<ol><li>Numunelerdeki protein seviyesini belirleyin (örneğin, Bradford testi ile) ve numuneleri (20 μg) yükleme tamponu ile hazırlayın. 5 μL numune tamponu (4x) ve 2 μL numune indirgeyici maddeyi (10x) toplam 20 μL hacme karıştırarak yükleme tamponunu hazırlayın.</li>
	<li>SDS (% 10 -% 14) ile poliakrilamid jeller hazırlayın ve 20 μg EV'leri her bir kuyucuğa yükleyin.</li>
	<li>Elektroforezi çalışan tamponla (30 g Tris, 144 g glisin, 1 L başına %10 SDS) 150 V'ta 45 dakika boyunca çalıştırın.</li>
	<li>Proteinlerin jelden poliviniliden diflorür (PVDF) membranına yarı kuru transferini, 1 saat boyunca 25 V'ta Towbin tamponlu (1.51 g Tris, 7.2 g glisin, 0.5 L'de %10 metanol) bir transfer makinesinde gerçekleştirin.</li>
	<li>TBST tamponunda %1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke etmek için membranı TBST tamponuna (1 mL Ara, 1 L başına 100 mL Tris tamponlu salin (TBS 10x)) yerleştirin ve RT'deki rocker'da 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>%1 BSA'ya seyreltilmiş (1:1.000) antikorlar, anti-CD9 1 (klon#D8O1A) veya anti-Alix1 (klon#3A9) ekleyin ve rocker üzerinde gece boyunca 4 °C'de membranla inkübe edin. Antikorları çıkarın ve membranı 10 dakika boyunca 10 mL 1x TBST ile 3x yıkayın.</li>
	<li>Membrandaki birincil antikora bağlı olarak, yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare (seyreltme: 1: 2.000) ikincil antikoru ekleyin ve RT'deki rocker üzerinde 1 saat inkübe edin. antikorları çıkarın ve membranı 10 dakika boyunca 10 mL 1x TBST ile 3x yıkayın.</li>
	<li>1 mL'lik bir çözelti elde etmek için substratı ve luminol'ü 1:1 oranında karıştırın. Çözeltiyi membran üzerine dökün. Membranı hemen görüntüleme sisteminin ölçüm odasına yerleştirin, kemilüminesans modülünü seçin ve ekranda protein bantlarını görselleştirin.</li>
</ol>6. Limulus Amebosit Lizat testi (LAL) ile endotoksin düzeyinin ölçülmesi
<ol><li>Üreticinin tavsiyesine göre endotoksin seviyesinin kromojenik LAL ölçümünü yapın. Kısaca, endotoksinin limulus amebosit lizatı (LAL) ile etkileşimine dayanan yöntemi kullanın. Bu yöntemin algılama sınırı 0,005 EU/mL'dir. NOT: LAL testi, sınırlamalarına rağmen, şu anda bilim veya tıpta kullanılan farklı çözeltilerde ve diğer ürünlerde endotoksin kontaminasyonunu tespit etmek ve ölçmek için standart yöntem olmaya devam etmektedir8. Bu kitin sınırlayıcı faktörü, yeniden yapılandırılan amebosit lizat çözeltisinin stabilitesidir, bu da sulandırıldıktan hemen sonra dondurulduğunda -20 ° C'de sadece 1 hafta stabil kalır.</li>
	<li>EV'lerin ve diğer numunelerin on kat seyreltilmesini ve 50 kat serum seyreltilmesini kullanın. Daha ileri deneyler için, sadece EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0.005 AB / mL) ve LPS içermeyen kültür süpernatantları gibi düşük endotoksin reaktifleri kullanın.</li>
</ol>7. EV örneklerinde prokaryotik 16S rRNA geninin tespiti
<ol><li>DNA'yı EV örneklerinden izole edin. Reaktifleri ve izolasyon bölgesini aseptik tutmaya çalışın. DNA konsantrasyonunu ve kalitesini ölçün (örneğin, bir spektrofotometre kullanarak).</li>
	<li>Daha önce21'de açıklandığı gibi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin. PCR ürünlerini ultraviyole ışıkta (UV) görselleştirmek için ethidyum bromür veya SYBR yeşili ile% 1.5 agaroz jeli hazırlayın.</li>
	<li>Numunenin elektroforezini ve ağırlık işaretleyicisini TRIS-asetat-EDTA tamponu ile 75 V'ta 45 dakika boyunca çalıştırın. Görüntüleme sistemini kullanarak DNA bantlarını görselleştirin.</li>
</ol>8. İnsan monosit modelinde stimülasyon için etkili LPS konsantrasyonunun belirlenmesi
<ol><li>RPMI 1640'ta L-glutamin, glikoz ve% 2 EE-FBS ile desteklenmiş 2 x 106 monosit / mL monosit süspansiyonu hazırlayın. 96 delikli bir doku kültürü plakası22'nin kuyucuğu başına 50 μL süspansiyon ekleyin.</li>
	<li>Aşağıdaki son konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda LPS veya kültür ortamı ekleyin: 100 μL toplam hücre süspansiyonu hacminde 0 pg / mL (kontrol), 10 pg / mL, 50 pg / mL, 100 pg / mL, 1 ng / mL ve 100 ng / mL. Her LPS konsantrasyonunun üçlüsünü yapın.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de 18 saat boyunca kültürleyin,% 5 CO2. Supernatan'ı topla.</li>
	<li>Süpernatantı 5 dakika boyunca 2.000 x g'de döndürün. Süpernatantları yeni tüplere aktarın. Toplanan süpernatantlardaki TNF8,23 ve IL-1023 konsantrasyonunu, üreticinin prosedürüne göre, bir akış sitometresi ile sitometrik boncuk dizisi (CBA) insan sitokin kiti ile ölçün.</li>
</ol>

<ol><li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li>
<li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi%CE%B1+dependent+PI-3+kinase+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li>
<li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840(2014).</li>
<li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32(2013).</li>
<li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li>
<li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activity+of+masked+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750(2017).</li>
<li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956(2018).</li>
<li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li>
<li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+%28ectosomes%29+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li>
<li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766(2020).</li>
<li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li>
<li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastics%2C+endotoxins%2C+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parenteral+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li>
<li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li>
<li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li>
<li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li>
<li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology%3A+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216(2019).</li>
<li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science%22%5BJournal%5D)">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li>
<li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li>
<li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42(2022).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858(2014).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+%27exosome-depleted+serum%27+is+utilised%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963(2021).</li>
<li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination%3A+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li>
<li>Álvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915(2017).</li>
<li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273(2018).</li>
<li>Gałuszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).</li>
<li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+polymyxins%3A+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27(2006).</li>
<li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+removal+from+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak inşa edilebilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.

Son birkaç yılda, uygun EV'lerin izolasyonu için yöntemler giderek daha önemli hale geldi ve örneğin güvenilir omikler ve fonksiyonel veriler elde etme bağlamında daha güvenilir analizleri mümkün kıldı24. Önceki araştırma deneyimlerine dayanarak, sadece izolasyon yönteminin türünün değil, aynı zamanda bu prosedür sırasındaki diğer koşulların da önemli olabileceği görülmektedir. EV tükenmiş FBS'nin kullanımı yaygın olarak bir gereklilik olarak kabul edilmektedir25,26</s...

MISEV 2018 terminolojisine göre hücre dışı veziküller (EV'ler), çok sayıda fizyolojik ve patolojik süreçte çok önemli rol oynayan hücre salgılanan membranöz veziküllerin çeşitli alt tiplerini tanımlayan kolektif bir terimdir 1,2. Dahası, EV'ler çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler, terapötik ajanlar ve ilaç dağıtım araçları olarak umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü satın almalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır3. Böyle bir zorluk, birçok durumda ihmal edilen endotoksin içermeyen EV'lerin izolasyonudur. En yaygın endotoksinlerden biri, gram-negatif bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşeni olan veçeşitli hücreler tarafından çok sayıda enflamatuar sitokinin salınması nedeniyle akut enflamatuar yanıta neden olabilen lipopolisakkarittir (LPS) 4,5. LPS, LPS bağlayıcı proteine bağlanarak bir yanıt indükler, ardından miyeloid hücreler üzerinde CD14 / TLR4 / MD2 kompleksi ile etkileşime girer. Bu etkileşim, MyD88 ve TRIF'e bağımlı sinyal yollarının aktivasyonuna yol açar ve bu da nükleer faktör kappa B'yi (NFkB) tetikler. NFkB'nin çekirdeğe translokasyonu, sitokinlerin üretimini başlatır6. Monositler ve makrofajlar LPS'ye karşı oldukça hassastır ve LPS'ye maruz kalmaları enflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin (örneğin, IL-6, IL-12, CXCL8 ve TNF-α) salınımına neden olur7,8. CD14 yapısı, benzer afiniteye sahip farklı LPS türlerinin bağlanmasını sağlar ve diğer toll-like reseptörleri (TLR'ler) için bir ko-reseptör görevi görür (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ve 9)6. EV'lerin monositler / makrofajlar üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmaların sayısı halaartmaktadır 9,10,11. Özellikle monositlerin, alt popülasyonlarının ve diğer bağışıklık hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek açısından bakıldığında, EV'lerde endotoksin varlığı ve hatta maskelenmiş varlığı büyük önem taşımaktadır12. EV'lerin endotoksinlerle göz ardı edilen kontaminasyonu, yanıltıcı sonuçlara yol açabilir ve gerçek biyolojik aktivitelerini gizleyebilir. Başka bir deyişle, monositik hücrelerle çalışmak, endotoksin kontaminasyonunun yokluğunda güven gerektirir13. Endotoksinlerin potansiyel kaynakları su, ticari olarak elde edilen ortam ve serumlar, ortam bileşenleri ve katkı maddeleri, laboratuvar cam eşyaları ve plastik eşyalar olabilir 5,14,15.
Bu nedenle, bu çalışma düşük endotoksin içeren EV'lerin izolasyonu için bir protokol geliştirmeyi amaçlamıştır. Protokol, endotoksinleri EV'lerden çıkarmak yerine, EV'lerin izolasyonu sırasında endotoksin kontaminasyonunun nasıl önleneceğine dair basit ipuçları sağlar. Daha önce, endotoksinlerin, örneğin nanotıpta kullanılan mühendislik nanopartiküllerinden nasıl çıkarılacağına dair birçok protokol sunulmuştu; ancak, hiçbiri EV'ler gibi biyolojik yapılar için yararlı değildir. Nanopartiküllerin etkili depirojenasyonu, etanol veya asetik asit durulama, 3 saat boyunca 175 ° C'de ısıtma, γ ışınlama veya triton X-100 muamelesi ile gerçekleştirilebilir; ancak, bu prosedürler EV'lerin 16,17'nin tahrip olmasına yol açmaktadır.
Sunulan protokol, EV'lerin monositler üzerindeki etkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların aksine, EV'lerde endotoksin safsızlıklarından kaçınmaya odaklanan öncü bir çalışmadır9. Önerilen ilkelerin laboratuvar uygulamalarına uygulanması, EV'lerin klinikte terapötik ajanlar olarak potansiyel kullanımı göz önüne alındığında çok önemli olabilecek güvenilir araştırma sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olabilir12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Alix (3A9) Fare mAb&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>2171</td><td></td></tr><tr><td>1250ul Filtre Üniversal Pipet Uçları, Şeffaf, Polipropilen, Pirojenik Olmayan</td><td>GoogLab Scientific</td><td>GBFT1250-R-NS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Akış Sitometrisi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBA İnsan Th1/Th2 Sitokin Kiti II</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>CD9 (D8O1A) Tavşan mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>13174</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Görüntüleme Sistemi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları A.Ş.</td><td></td><td></td>17001401</tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ELX800NB, Üniversal Mikroplaka Okuyucu</td><td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Güney Amerika Ultra Düşük Endotoksin</td><td>&nbsp; Biyobatı</td><td>&nbsp; S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin, 50 mg / mL</td> <td>&nbsp; PAN &ndash; Biyoteknoloji</td><td>P06-13100</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG- HRP</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan IgG- HRP</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membran</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1620177</tr><tr><td>Salmonella abortus equi S-formundan (TLRGRADE) LPS</td><td>&nbsp; Enzo Yaşam Bilimleri A.Ş.</td><td>ALX-581-009-L002</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Elektroforetik Transfer Hücresi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1703930</tr><tr><td>Nanopartikül İzleme Analizi&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Numune Tamponu (4X)</td><td>&nbsp; Canlandırıcı</td><td>&nbsp; NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Numune Azaltıcı Ajan (10x)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>şeffaf film</td></tr><tr><td>Mükemmel 100-1000 bp DNA Merdiveni</td><td>EURx</td><td>E3141-01 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PierceTM Kromojenik Endotoksin Quant Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39552</td><td></td></tr><tr><td>PP Meşe Sırtı Tüpü, sızdırmazlık kapaklı</td><td>Thermo Scientific</td><td>3929, 03613</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>RPMI-1640 (Gibco)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Termal Döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistem</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall wX+ ULTRA SERİSİ T-1270 rotorlu</td> <td>SantrifüjThermo Scientific</td><td>75000100</td><td></td></tr><tr><td>Alt Hücre GT Yatay Elektroforez Sistemi</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1704401</tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Kemilüminesan Yüzey</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>SW480 hücre hattı</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SW480 hücre hattı</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Şırınga filtresi 0.22 um</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Yarı Kuru Transfer Hücresi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları A.Ş.</td><td>1703940</td><td>Transfer makinesi</td></tr><tr><td>Transfer pipeti, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr></tbody></table>

kanser hücre hatlarından elde edilen düşük endotoksin İçeriği hücre dışı veziküllerin İzolasyonu

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Hücre dışı veziküller (EV'ler), in vitro ve in vivo hücreler tarafından salınan heterojen bir membran vezikülü popülasyonudur. Her yerde bulunmaları ve biyolojik bilgi taşıyıcıları olarak önemli rolleri, onları izolasyonları için güvenilir ve tekrarlayan protokoller gerektiren ilgi çekici çalışma nesneleri haline getirir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü araştırmalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır (uygun edinim gibi). Bu çalışma, küçük EV'lerin (MISEV 2018 terminolojisine göre) diferansiyel santrifüjlemeye dayalı tümör hücre hatlarının kültür süpernatantından izolasyonu için bir protokol sunmaktadır. Protokol, EV'lerin izolasyonu sırasında endotoksinlerle kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir. EV'lerin endotoksin kontaminasyonu, sonraki deneyleri önemli ölçüde engelleyebilir veya hatta gerçek biyolojik etkilerini maskeleyebilir. Öte yandan, gözden kaçan endotoksinlerin varlığı yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu, monositler de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücrelerine atıfta bulunurken özellikle önemlidir, çünkü monositler endotoksin kalıntılarına özellikle duyarlı bir popülasyon oluşturur. Bu nedenle, özellikle monositler, makrofajlar, miyeloid türevli baskılayıcı hücreler veya dendritik hücreler gibi endotoksine duyarlı hücrelerle çalışırken, EV'lerin endotoksin kontaminasyonu açısından taranması şiddetle tavsiye edilir.

Bu protokol için ön koşul veya zorunlu bir adım, olası endotoksin kontaminasyonunun reaktiflerden dışlanmasıdır. FBS, DMEM, RPMI, PBS ve hatta ultrasantrifüj tüpleri gibi kullanılan tüm reaktifler endotoksin içermemelidir (&lt;0.005 AB / mL). Endotoksin kontaminasyonu olmayan rejimin sürdürülmesi kolay değildir, çünkü örneğin, hücre kültürü için düzenli / standart serum zengin kaynağı olabilir (0.364 AB / mL; bakınız Tablo 1).
Bu protokol düşük endotoksin içeriğine sahip EV'le...

Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.

Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Bu protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar sağlar. Bu protokolün temel avantajı, EV'lerle ilgilenen her laboratuvarın aseptik bir prosedür uygulayarak ve basit ve yaygın olarak bulunan ekipman kullanarak endotoksin kontaminasyonunu sınırlayabilmesidir. Bu tekniği ilk kez deneyen herkes, düşük endotoksinli, pirojenik olmayan etiketli yeni medya, reaktifler ve plastik eşyalarla başlamalıdır.Bu protokol için endotoksin içermeyen reaktifler, su, kültür ortamı, filtrelenmiş PBS, ultra düşük endotoksin FBS ve ultra santrifüj tüpleri kullanın. Başlamak için, süpernatantı daha önce kültürlenmiş SW480 ve SW620 hücre hatlarından uygun şekilde etiketlenmiş 15 mililitrelik tüplere toplayın. Süpernatantı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ederek hücre kalıntılarını temizleyin.Enkazı rahatsız etmeden, süpernatantı yeni bir etiketli tüpe toplayın ve dört santigrat derecede 12 dakika boyunca 3.200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantın 45 mililitresini, tüpün kenarlarını ıslatmadan dikey olarak yerleştirilmiş steril 50 mililitrelik bir tüpe dikkatlice aktarın. Tüpün kapağını steril, şeffaf bir filmle sarın ve hücre dışı veziküllerin daha sonra izolasyonu için eksi 80 santigrat derecede dikey olarak saklayın.İzolasyona, yaklaşık 90 mililitre süpernatan içeren 0,22 mikrometre şırınga filtreleri, şırıngalar ve tüpler hazırlayarak başlayın. Bir şırıngayı süpernatantla doldurun ve filtreyi iğne adaptörüne sabitleyin. Süpernatantı filtreden 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin.Filtratın yedi mililitresini hazırlanmış bir ultra santrifüj tüpüne pipet edin ve dört santigrat derecede iki saat boyunca 100.000 x g'de santrifüj. Supernatanı atmak için steril bir Pasteur pipeti kullanın. Peletleri uzun filtrelenmiş bir pipet ucu kullanarak ultra santrifüj tüpüne çekin.Yedi mililitre filtrelenmiş endotoksin içermeyen PBS ekleyerek hücre dışı vezikülleri durulayın. Ultra santrifüjlemeden sonra, steril bir Pasteur pipeti kullanarak süpernatantı atın ve peleti 200 mikrolitre endotoksin içermeyen PBS'de yeniden askıya alın. Süspansiyonu steril bir 1.5 mililitre düşük protein bağlayıcı test tüpüne aktarın.Daha sonra daha fazla analiz için 10 mikrolitre süspansiyonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpün kapağını sarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Şimdi, yeni bir tüpe dönüştürün, nanopartikül izleme analizi için filtrelenmiş PBS kullanarak bir mikrolitre süspansiyonu 1 ila 1000 oranında seyreltin.Lekeleme analizi yapmak için, önce numunelerin 20 mikrogramını bir yükleme tamponu ile karıştırın. Numuneleri 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra numunenin 20 mikrogramını SDS ile% 10 ila% 14'lük bir poliakrilamid jelin her bir kuyucuğuna yükleyin ve çalışan tamponla 150 voltta 45 dakika boyunca elektroforez yapın.Daha sonra, jeli Towbin tamponlu bir transfer makinesine yerleştirin ve proteinlerin bir saat boyunca 25 voltta bir poliviniliden diflorür membranına yarı kuru bir transferini gerçekleştirin. Membranı bir rocker üzerinde bir saat boyunca inkübe ederek% 1 BSA ile bloke edin. Membrana BSA seyreltilmiş antikorlar, anti-CD9 veya anti-Alix ekleyin ve bir rocker üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Antikorları çıkardıktan sonra, zarı 10 dakika boyunca 10 mililitre TBST ile üç kez yıkayın. Şimdi keçi anti-tavşan veya anti-fare ikincil antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca bir rocker üzerinde tekrar inkübe edin. Antikoru atın ve membranı daha önce gösterildiği gibi yıkayın.Substrat ve luminol içeren çözeltinin bir mililitresini membran üzerine eşit oranda dökün. Membranı hemen bir görüntüleme sistemine yerleştirin ve protein bantlarını ekranda görselleştirin. Bu çalışmada, western blot analizi, CD9 ve Alix olmak üzere iki hücre dışı vezikül belirtecinin varlığını doğruladı.Hem SW480 hem de SW620'den izole edilen veziküllerin ortalama büyüklüğü ve konsantrasyonları benzerdi. Monositin farklı dozlarda lipopolisakkarit veya LPS ile uyarılması, interlökin 10'un salgılanmasını sağlayan en düşük LPS dozunu ve monositlerde tümör nekroz faktörünün mililitre başına 50 pikogram olduğunu göstermiştir. Kromojenik LAL testi, hücre dışı veziküllerin LPS kontaminasyonunun her iki hücre hattı için mililitre başına yaklaşık 50 pikogram olduğunu göstermiştir.Hatırlanması gereken en önemli şey, LPS içermeyen veya tükenmiş reaktiflerin kullanılması ve prosedürün her adımında rutin LPS ölçümüdür. Endotoksin kontaminasyonunu önlemek, onu ortadan kaldırmaktan daha kolaydır. Önerilen protokol, EV'lerin endotoksin ile kontaminasyonu nedeniyle yanlış sonuç olasılığını sınırlar ve hücre başına EV'lerin aktivitesinin değerlendirilmesine izin verir.Önerilen protokol, monositler, dendritik hücreler ve makrofajlar gibi endotoksine duyarlı hücrelerle çalışan araştırmacılar için yararlıdır.

isolation-low-endotoxin-content-extracellular-vesicles-derived-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Bu karaciğerden doku ekstrasellüler (EVs) izole etmek için bir protokoldür. Protokol, kollajenaz perfüzyonunu içeren iki aşamalı bir süreci ve ardından karaciğer dokusu EVs'lerini izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüji tanımlıyor.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV'ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM'ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.

Endozom kaynaklı veziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yöntemi

Doğal öldürücü hücre kaynaklı hücre dışı veziküller (NK-EV'ler), kanser biyoterapötikleri olarak umut verici bir potansiyele sahiptir. Bu metodolojiye dayalı çalışma, büyük miktarlarda yüksek saflıkta NK-EV'leri sürekli olarak üretmek ve izole etmek için tasarlanmış, ölçeklenebilir bir kapalı döngü biyoüretim iş akışı sunmaktadır. Biyo-üretim iş akışı boyunca süreç içi kontrol testi gerçekleştirilir ve EV'lerin ürün piyasaya sürülmesi için kalite standartlarını karşılaması sağlanır.

Doğal öldürücü hücre kaynaklı hücre dışı vezikül bazlı kanser biyoterapötiklerini üretmek ve izole etmek için ölçeklenebilir biyoüretim iş akışı

Bu protokol, hücre dışı veziküllerin insan anne sütünden yüksek saflıkta etkili bir şekilde izole edilmesini hızlandırmak ve buna izin vermek için tasarlanmıştır.

İnsan Anne Sütünden Elde Edilen Hücre Dışı Veziküllerin Hızlı İzolasyonu

Öğrenin, SW480 ve SW620 kanser hücre hatlarından düşük endotoksin içerikli hücre dışı vezikül izolasyonu yöntemini. Bu protokol, endotoksin kontaminasyonunu en aza indirerek güvenilir EV araştırmaları yapmanızı sağlar.

Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet