Name: BS3 Kimyasal Çapraz Bağlama Testi: Kemirgen Beyninde Kronik Stresin Hücre Yüzeyi GABAA Reseptör Sunumu Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Öğrenin, BS3 kimyasal çapraz bağlama testiyle kronik psikososyal stresin kemirgen beynindeki GABA A reseptör hücre yüzeyi sunumuna etkisini. Bu yöntem, anksiyete ve bilişsel bozuklukların moleküler temellerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, çalışma süresi boyunca hayvanlara baktıkları için CAMH hayvan tesisi personeline teşekkür eder. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR Project Grant # 470458 to T.T.), CAMH'den Keşif Fonu (T.P.'ye), Ulusal Şizofreni ve Depresyon Araştırma İttifakı (NARSAD ödülü #25637 E.S.'ye) ve Campbell Aile Ruh Sağlığı Araştırma Enstitüsü (E.S.'ye) tarafından desteklenmiştir. E.S., kliniğe yeni GABAerjik bileşikler getirmeye adanmış bir biyofarma olan Damona Pharmaceuticals'ın kurucusudur.

Bu protokoldeki tüm hayvan çalışmaları, Ontario Araştırma Hayvanları Yasası (RSO 1990, Bölüm A.22) ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) uyarınca tamamlanmış ve Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvanların hazırlanması
<ol><li>Deneylerde kullanılacak hayvan sayılarını belirleyin ve bunları uygun gruplara veya deney kohortlarına bölün. Grup büyüklüğü, cinsiyeti ve istatistiksel gücü hakkında bir tartışma için tartışma bölümüne bakın. NOT: Bu protokol fareler için özelleştirilmiştir (C57BL6/J suşu; 2-4 aylık; tipik olarak 20-30 g vücut ağırlığı; kullanılacak eşdeğer sayıda erkek ve dişi).</li>
	<li>Hayvanları UCMS altına yerleştirin veya daha önce14'te açıklandığı gibi protokolü izleyerek 5-8 hafta boyunca stresli olmayan koşulları kontrol edin.</li>
	<li>Son UCMS prosedüründen sonra, reseptör ekspresyonu üzerindeki akut stres etkilerinden kaçınmak için çapraz bağlama testi için kullanmadan önce hayvanların 1 gün boyunca ev kafeslerinde kalmalarına izin verin.</li>
</ol>2. Stok çözümlerinin hazırlanması
<ol><li>Aşağıdaki çözümleri tahlilden önce talimat verildiği şekilde hazırlayın ve saklayın.<ol><li>14.6 g NaCl'yi 40 mL deiyonize suda çözerek 5 M NaCl hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.</li>
		<li>3.22 g KCl'yi 40 mL deiyonize suda çözerek 1.08 M KCl hazırlayın. RT'de depolayın.</li>
		<li>3.25 g MgCl 2·6H 2O'yu 40 mL deiyonize suda çözerek 400 mM MgCl2 hazırlayın. RT'de depolayın.</li>
		<li>3 g glisini 40 mL deiyonize suda çözerek 1 M glisin hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>10 mL deiyonize suda 1.54 g DTT'yi çözerek 1 M ditiyotreitol (DTT) hazırlayın. Gözenek boyutu 0,2 μm olan bir filtreden geçirin ve 2 mL tüplere aliquot yapın. −20 °C'de saklayın.</li>
		<li>%10 Nonidet-P40 (NP-40) değerini deiyonize suda 1:10 (v/v) oranında seyrelterek hazırlayın. RT'de depolayın.</li>
		<li>0,5 M EDTA (pH = 8,0) hazırlayın ve RT'de saklayın.</li>
		<li>1 M HEPES tamponu (pH = 7.2-7.5) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>2,5 M veya %45 (w/v) glikoz hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. İş istasyonunun hazırlanması
<ol><li>BS3 çapraz bağlama testi gününde, aşağıdaki malzemeleri hayvan diseksiyon odasında toplayın (Şekil 1), buz üzerinde önceden soğutulmuş birkaç öğe ile: bir buz kovası, bir metal sıcaklık bloğu (buz üzerinde önceden soğutulmuş), 50 mL'lik bir konik tüpte buz gibi soğuk PBS ve bir Petri kabında dondurulmuş PBS, PBS ile nemlendirilmiş ve soğutulmuş düz bir yüzeye veya mavi buza yerleştirilmiş filtre kağıdı, buz üzerinde önceden soğutulmuş bir beyin matrisi (tıraş bıçağı yerleştirme için 1 mm aralık), buz üzerinde önceden soğutulmuş tıraş bıçakları (~ 10), diseksiyon aletleri (makas, forseps, kavisli bir prob), bir doku zımbası,% 70 etanol sprey silme kağıdı ve kağıt havlular, pipet uçları (200 μL), bir pipetleyici (P200), bir kronometre, bir not defteri, bir kalem ve mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL).<ol><li>Tahlilden önce, mikrosantrifüj tüplerini numune bilgileriyle etiketleyin (örneğin, hayvan kimlik numarası, tedavi tipi [UCMS'ye karşı stressiz (NS)], beyin bölgesi, BS3'lü veya BS3'süz, vb.). NOT: BS3 çapraz bağlama testleri için, her beyin bölgesinden iki örnek toplanmalıdır; bir numune çapraz bağlama (BS3 ile) ve diğeri çapraz bağlanma olmayan reaksiyon (BS3 olmadan) için bir kontrol olarak kullanılacaktır. Bu nedenle, 12 farede iki beyin bölgesinden (yani, prefrontal korteks [PFC] ve hipokampus [HPC]) örneklemek için, ilk örnekleme için 48 tüp etiketleyin (= 2 örnek × 2 bölge × 12 fare) (bölüm 6'da kullanılacaktır). Daha sonra depolamak üzere 48 tüpten oluşan ek iki seti etiketleyin (her numunenin iki farklı hacmini [100 μL, 300 μL] depolamak için) (bölüm 7'de kullanılacaktır). Bu nedenle, bu kohort boyutu için toplam 144 tüpün etiketlenmesi gerekmektedir.</li>
	</ol></li>
	<li>Ek olarak, laboratuvarda aşağıdaki ekipmanların bulunduğundan emin olun: masa üstü soğutmalı mikrosantrifüj, bir sonikatör, bir tüp rotatör (soğuk odada veya buzdolabının içinde kullanılacak [4 °C]), numuneleri depolamak için bir dondurucu (-80 °C) ve numunelerin geçici olarak depolanması için bir kova kuru buz (bölüm 7'de kullanılacaktır)</li>
</ol>4. Çalışma çözeltilerinin ve tamponların hazırlanması
NOT: Tahlil sabahında, aşağıdaki çözeltileri hazırlayın. Bu hesaplama, 12 fareden iki beyin bölgesini (yani PFC ve HPC) işlemek için gerekli çözümlere dayanmaktadır.
<ol><li>Tablo 1'de belirtildiği gibi yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF, pH = 7.4) hazırlayın. Her bir numune alma tüpüne (adım 3.1.1'de etiketlenen 48 tüp) 750 μL aCSF dağıtın ve tamponu önceden soğutmak için bunları buz üzerindeki metal sıcaklık bloğuna yerleştirin.</li>
	<li>Lizis tamponunu Tablo 2'de belirtildiği gibi hazırlayın. Buz üzerinde saklayın (numune başına 400 μL kullanılacaktır).</li>
	<li>5 mM sodyum sitrat tamponunda (pH = 5.0) 52 mM BS3 stok çözeltisi (26x) hazırlayın.<ol><li>İlk olarak, 100 mM sitrik asit (stok A) ve 100 mM sodyum sitrat (stok B) hazırlayın.</li>
		<li>Stok A ve stok B'yi deiyonize su ile 1:20 oranında seyreltin. Sırasıyla 5 mM sitrik asit (stok C) ve 5 mM sodyum sitrat (stok D) hazırlamak için her biri 1,9 mL suya 100 μL ekleyin.</li>
		<li>5 mM sodyum sitrat tamponu (pH = 5.0) (çözelti E, 1 mL) hazırlamak için 410 μL stok C ve 590 μL stok D'yi karıştırın.</li>
		<li>Bir pH gösterge şeridi kullanarak E çözeltisinin pH'ını onaylayın.</li>
		<li>BS3 stok çözeltisini (26x) hazırlamak için 24 mg BS3'ü 806.4 μL E çözeltisi içinde 30 s boyunca vorteks yaparak çözün.</li>
		<li>Çapraz bağlanmayan numuneler için araç kontrolü olarak kullanmak üzere 1 mL'lik başka bir E çözeltisi hazırlayın. NOT: Diğer her şey hazır olduğunda ve deney başlamak üzereyken BS3 stok çözeltisini hazırlayın. BS3, kullanılıncaya kadar 4 °C'de kurutularak saklanmalıdır. Yeniden yapılandırıldıktan sonra, BS3 sadece yaklaşık ≤3 saat boyunca aktif kalır. 5 mM sodyum sitrat tamponunun (çözelti E) pH'ının zamanla yükseldiği ve BS3 hidrolizinin hızlanmasına neden olduğu bildirildiğinden, E çözeltisinin stok çözeltileri A veB9'dan taze olarak hazırlanması önerilir. BS3'ün düşük sıcaklıklarda sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, yeniden yapılandırılmış BS3'ü RT'de tutun. yeniden yapılandırılmış BS3'ü 3 saatte kullanın ve yeniden yapılandırılmış BS3'ü dondurmayın / çözmeyin veya yeniden kullanmayın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Beyin dokularının diseksiyonu
NOT: Bu adımdan itibaren, en az iki kişi koordineli bir şekilde birlikte çalışmalıdır. Bir kişi hayvan diseksiyonuna odaklanırken (adım 5.2-5.10 ve adım 6.3), diğer kişi zaman tutucu olarak çalışmalı ve tahlilin koordine edilmesine yardımcı olmalıdır (adım 5.1, adım 6.1, adım 6.2, adım 6.4 ve adım 6.5)
<ol><li>Diseksiyon için ilk hayvanı konut alanından diseksiyon odasına getirin. NOT: Akut stresörler (örneğin, yeni bir ortam, kan kokusu) beyin protein dinamiklerini etkileyebileceğinden, hayvanlar diseksiyon alanından uzağa yerleştirilmiş ev kafeslerinde tutulmalı ve daha sonra derhal dekapitasyon için diseksiyon odasına ayrı ayrı getirilmelidir.</li>
	<li>Fareyi servikal çıkık ve ardından kafa kesme ile ötenazi yapın. Beyni kafatasından hızla çıkarın ve 10-15 s boyunca bir Petri kabında buz gibi PBS'ye batırın (Şekil 2). NOT: Hayvanlar BS3 deneyleri için uyuşturulmamıştır, çünkü herhangi bir anestezik ajan nörotransmitter reseptörlerinin yüzey sunum seviyesini potansiyel olarak etkileyebilir9.</li>
	<li>Soğutulmuş beyni, beynin ventral tarafı yukarı bakacak şekilde buz üzerindeki beyin matrisine yerleştirin (Şekil 3).</li>
	<li>Beyni koronal olarak kesmek için ilk tıraş bıçağını koku alma ampulü ile koku alma pedinkülü arasındaki sınırdan yerleştirin (Şekil 4). Üç ila dört ek tıraş bıçağı kullanarak, beynin ön kısmını 1 mm aralıklarla koronal olarak seri olarak kesin.</li>
	<li>Yerleştirilen tüm tıraş bıçaklarını bir arada tutarak koronal dilimleri beyin matrisinden kaldırın ve beynin arka kısmını beyin matrisinde geride bırakın. Tıraş bıçağını birbirinden ayırmak için forseps kullanın ve beyin dilimi yukarı bakacak şekilde düz, soğutulmuş yüzeye yerleştirin (Şekil 5).</li>
	<li>İlgilenilen bölgeyi içeren dilimleri tanımlayın. PFC'yi örneklemek için, koku alma pedinkülünü içeren ilk dilimin arkasındaki ikinci ve üçüncü dilimleri seçin.</li>
	<li>Bir doku zımbası kullanarak ilgilendiğiniz bölgeyi çıkarın (Video 1), soğutulmuş tıraş bıçağının üzerinde bir kenara koyun ve dokuyu eşit olarak ikiye bölün (örneğin; soldan sağ yarımküreye karşı dokular, bir yarısı BS3 çapraz bağlama reaksiyonu için ve diğer yarısı da ilgilenilen hedef protein her iki yarımkürede eşit olarak ifade edilirse, çapraz bağlanma kontrolü için kullanılacaktır).</li>
	<li>Dokuları ezmek veya taşlamak yerine forsepsin ince ucunu bıçağa karşı çoklu dikey hareketlerle kullanarak her dokuyu tıraş bıçağı üzerinde parçalara ayırın (Video 2). Bu, hücrelerin membran bütünlüğünden ciddi şekilde ödün vermeden BS3 tarafından erişilebilen yüzey alanını en üst düzeye çıkaracaktır. Kıymadan hemen sonra, kıyılmış dokuları uygun tüplere aktarın (bkz. adım 6.3).</li>
	<li>HPC'yi örneklemek için, beynin arka kısmını matristen çıkarın ve beyni dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde soğutulmuş düz yüzeydeki nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirin (Şekil 6).</li>
	<li>Kavisli bir prob ve forseps kullanarak ve dorsal taraftan yaklaşarak (Video 3), HPC'yi (dorsal yarım, ventral yarı veya her ikisi) her iki yarımküreden (BS3 çapraz bağlama için bir yarısı ve diğer yarısı kontrol için) disseke edin. Her dokuyu adım 5.8'deki gibi kıyın ve dokuyu uygun tüplere aktarın (bkz. adım 6.3). NOT: Deney koşullarının ve sonuçların tutarlı olması için her hayvan için tüm diseksiyon süresi ~ 5 dakika olarak tutulmalıdır.</li>
</ol>6. Çapraz bağlama reaksiyonu
<ol><li>Diseksiyon için bir sonraki hayvanı, önceki farenin beyninin diseksiyonu bitmek üzereyken barınma alanından diseksiyon odasına getirin (adım 5.10).</li>
	<li>Kıyılmış dokular uygun tüplere aktarılmaya hazır olmadan hemen önce buz üzerinde önceden soğutulmuş tüpü 30 μL BS3 çözeltisi (26x) veya araç çözeltisi E ile (adım 4.1'den itibaren) yükseltin. Çapraz bağlanmayan kontrol tüplerinde BS3'ün kirlenmediğinden emin olmak için borular arasındaki pipet uçlarını değiştirin.</li>
	<li>Kıyılmış dokuları (adım 5.8 ve adım 5.10'dan) uygun tüplere aktarın ve ardından bir sonraki hayvanı diseke etmeye başlayın (adım 5.2)</li>
	<li>Doku parçalarını daha küçük parçalara ayırmak için tüpü ters çevirin ve karıştırın (Video 4) ve numuneleri soğuk odadaki tüp rotatöründe 30 dakika ila 2 saat boyunca inkübe etmeye başlayın. Her tüp için BS3 inkübasyonunun başlangıç zamanını kaydedin. En uygun inkübasyon süresi için tartışma bölümüne bakın.</li>
	<li>Tüpü 78 μL 1 M glisin ile yükselterek reaksiyonu söndürün ve numuneyi sabit rotasyonla 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Her tüp için söndürmenin başlangıç ve bitiş zamanını kaydedin. Bir sonraki hayvanı getirerek (adım 6.1) ve çapraz bağlamaya yardımcı olarak (adım 6.2) hayvan diseksiyonuna odaklanan kişiye yardım etmeye devam edin. NOT: Her numuneye, tüm numunelerde tam olarak aynı zamanlama ile muamele edin. Diseksiyon odası soğuk odadan uzaksa, numune inkübasyonuna katılmak ve soğuk odada söndürmek için üçüncü bir kişinin işe alınması şiddetle tavsiye edilir.</li>
</ol>7. Doku lizisi, protein hazırlama ve batı lekesi
<ol><li>10 dakikalık söndürmeden sonra (adım 6.5), numuneleri 2 dakika boyunca 4 ° C'de 20.000 x g'de döndürün ve süpernatanı atın. Üçüncü bir kişi mevcutsa, adım 7.2'ye geçin; Aksi takdirde, numuneleri kuru buz üzerinde dondurun ve tüm hayvanlar için beyin diseksiyonu (bölüm 5) ve çapraz bağlama (bölüm 6) tamamlanana kadar tahlili burada duraklatın.</li>
	<li>Tüp başına 400 μL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri buz üzerinde tutarken, örnekleri aralarında 5 s aralıklarla 1 s beş kez sonikleştirin.</li>
	<li>Çözünmeyen doku kalıntılarını (pelet) dışarı atmak ve süpernatanı kurtarmak için numuneleri 2 dakika boyunca 20.000 x g'de döndürün.</li>
	<li>Bisinkonik asit (BCA) testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için süpernatantın 5 μL'sini kullanın.</li>
	<li>Süpernatantın geri kalanını iki tüpe bölün; Bir tüp sonraki batı lekesi için 100 μL süpernatant içerir ve diğer tüp -80 ° C'de uzun süreli depolama için geri kalanını (~ 300 μL) içerir. Numunelere uygun miktarda 4x SDS numune tamponu (β2-merkaptoetanol ile desteklenmiş) ekleyin ve 10 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Elektroforez için bir akrilamid jel (SDS-PAGE) üzerinde kuyucuk başına 10-20 μg protein çalıştırın ve daha sonra batı leke analizi için proteinleri poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın.</li>
	<li>PVDF membranını, RT'de 1 saat boyunca% 0.1 Ara-20 (TBS-T) içeren Tris tamponlu salin içinde çözünmüş% 5 (w / v) yağsız sütte bloke edin.</li>
	<li>Membranı TBS-T ile iki kez kısaca yıkayın ve gece boyunca 4 ° C'de TBS-T'de seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.</li>
	<li>Birincil antikoru RT'de TBS-T'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
	<li>Membranı, RT'de 1 saat boyunca TBS-T'de seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.</li>
	<li>İkincil antikoru RT'de TBS-T'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
	<li>Membranı gelişmiş kemilüminesans reaktifinde inkübe edin ve jel dokümantasyon aparatını kullanarak sinyali tespit edin.</li>
</ol>

<ol><li>Groc, L., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+glutamate+receptor+movements+and+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking glutamate receptor movements and synapse function.</a> Science. 368 (6496), (2020).</li>
<li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPA+receptor+code+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The AMPA receptor code of synaptic plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li>
<li>Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+DISC1+in+neuronal+trafficking+and+its+implication+in+neuropsychiatric+manifestation+and+neurotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics.</a> Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).</li>
<li>Sumitomo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulk2+controls+cortical+excitatory-inhibitory+balance+via+autophagic+regulation+of+p62+and+GABAA+receptor+trafficking+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons.</a> Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).</li>
<li>Brady, M. L., Jacob, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+%CE%B15+GABA+%28A%29+receptors+via+gephyrin+interaction+regulates+dendritic+outgrowth+and+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation.</a> Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gephyrin+regulates+the+cell+surface+dynamics+of+synaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).</li>
<li>Takamura, Y., Kakuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+receptor+visualization+and+evaluation+of+receptor+occupancy+with+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).</li>
<li>Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+and+metabolic+half-life+of+AMPA+receptors+in+cultured+rat+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells.</a> Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).</li>
<li>Boudreau, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+crosslinking+assay+for+measuring+cell+surface+expression+of+glutamate+receptor+subunits+in+the+rodent+brain+after+in+vivo+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).</li>
<li>Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin-positive+gamma-aminobutyric+acid+interneuron+deficits+in+depression%3A+Cortical+microcircuit+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives.</a> Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).</li>
<li>Bernardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptomatic+and+neurotrophic+effects+of+GABAA+receptor+positive+allosteric+modulation+in+a+mouse+model+of+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress.</a> Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).</li>
<li>Prévot, T., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+GABA-mediated+information+processing+and+cognitive+dysfunctions+in+depression+and+other+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders.</a> Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).</li>
<li>Martin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha5GABAA+receptor+activity+sets+the+threshold+for+long-term+potentiation+and+constrains+hippocampus-dependent+memory%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).</li>
<li>Nollet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+depression%3A+Unpredictable+chronic+mild+stress+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice.</a> Current Protocols. 1 (8), e208(2021).</li>
<li>Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+origin+of+somatostatin-positive+neuron+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability.</a> Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).</li>
<li>Guilloux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+BDNF-+and+GABA-related+dysfunctions+in+the+amygdala+of+female+subjects+with+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression.</a> Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).</li>
<li>Lin, L. C., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin%2C+neuronal+vulnerability+and+behavioral+emotionality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality.</a> Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).</li>
<li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain%3A+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).</li>
<li>Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29+and+gene+expression+analysis+of+Fos-expressing+neurons+from+fresh+and+frozen+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54358(2016).</li>
<li>Boudreau, A. C., Wolf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+sensitization+to+cocaine+is+associated+with+increased+AMPA+receptor+surface+expression+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).</li>
<li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li>
<li>Tomoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+controls+GABAAR+trafficking+and+related+cognitive+processes+via+autophagic+regulation+of+p62%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62.</a> Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).</li>
<li>Hernandez-Rabaza, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sildenafil+reduces+neuroinflammation+and+restores+spatial+learning+in+rats+with+hepatic+encephalopathy%3A+Underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 195(2015).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.

Kronik psikososyal stresin davranışlar (yani, duygusallık ve bilişsel eksiklikler) ve moleküler değişiklikler (yani, GABAerjik genlerin ekspresyonunun azalması ve GABAerjik nörotransmisyonda eşlik eden eksiklikler) üzerindeki etkisi iyi belgelenmiş olmasına rağmen,10, bu tür eksikliklerin altında yatan mekanizmaların daha fazla araştırılması gerekmektedir. Özellikle, kronik stresin ER fonksiyonları üzerindeki aşırı yüklenme yoluyla nöronal proteomu önemli ölçüde etkilediğini ve dolayısıyla yüksek ...

Nörotransmitter reseptörleri ya nöronal plazma membran yüzeyinde ya da hücre içi olarak endomembranlarda (örneğin, endozom, endoplazmik retikulum [ER] veya trans-Golgi aparatı) lokalize olur ve nöronlardaki içsel fizyolojik durumlara bağlı olarak veya dışsal sinir ağı aktivitelerine yanıt olarak bu iki bölme arasında dinamik olarak mekik dokumaktadır 1,2. Yeni salgılanan nörotransmitterler fizyolojik fonksiyonlarını öncelikle yüzey-lokalize reseptör havuzu aracılığıyla ortaya çıkardığından, belirli bir nörotransmitter için yüzey reseptör seviyeleri, nöral devre3 içindeki sinyal kapasitesinin kritik belirleyicilerinden biridir.
Kültürlenmiş nöronlarda yüzey reseptör seviyelerini izlemek için, yüzey biyotinilasyon testi4, geçirgen olmayan koşullarda spesifik bir antikora sahip immünofloresan testi5 veya genetik olarak pH'a duyarlı floresan optik göstergeyle (örneğin, pHluorin) kaynaşmış bir reseptör transgeninin kullanımı dahil olmak üzere çeşitli yöntemler mevcuttur. Buna karşılık, bu yaklaşımlar in vivo yüzey reseptör seviyelerini değerlendirirken sınırlı veya pratik değildir. Örneğin, yüzey biyotinilasyon prosedürü, nispeten yüksek fiyatı ve avidin konjuge boncuklar üzerindeki biyotinile proteinlerin saflaştırılması için gerekli sonraki adımlar nedeniyle büyük miktarlarda ve in vivo beyin dokularının örnek sayılarını işlemek için pratik olmayabilir. Üç boyutlu beyin mimarisine gömülü nöronlar için, düşük antikor erişilebilirliği veya mikroskop tabanlı nicelemedeki zorluklar, in vivo yüzey reseptör seviyelerini değerlendirmek için önemli bir sınırlama oluşturabilir. Nörotransmitter reseptörlerinin bozulmamış beyinlerdeki dağılımını görselleştirmek için, pozitron emisyon tomografisi gibi non-invaziv yöntemler, reseptör doluluğunu ölçmek ve yüzey reseptör seviyelerini tahmin etmek için kullanılabilir7. Bununla birlikte, bu yaklaşım kritik olarak belirli radyo ligandlarının, pahalı ekipmanların ve özel uzmanlığın mevcudiyetine dayanır ve bu da çoğu araştırmacı tarafından rutin kullanım için daha az erişilebilir olmasını sağlar.
Burada, deneysel hayvan beyinlerindeki yüzey reseptör seviyelerini ex vivo olarak ölçmek için suda çözünür, membran geçirimsiz bir kimyasal çapraz bağlayıcı olan bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) 8,9 kullanarak basit, çok yönlü bir yöntem açıklıyoruz. BS3, lizin kalıntılarının yan zincirindeki birincil aminleri hedefler ve birbirine yakın proteinlere kovalent olarak çapraz bağlayabilir. Beyin dilimleri ilgilenilen bir bölgeden taze olarak hazırlandığında ve BS3 içeren bir tamponda inkübe edildiğinde, hücre yüzey reseptörleri komşu proteinlerle çapraz bağlanır ve böylece daha yüksek moleküler ağırlıklı türlere dönüşürken, hücre içi endomembran ile ilişkili reseptörler değiştirilmeden kalır. Bu nedenle, yüzey ve hücre içi reseptör havuzları sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılabilir ve incelenecek reseptöre özgü antikorlar kullanılarak batı lekesi ile ölçülebilir.
Öngörülemeyen kronik hafif stres (UCMS), kemirgenlerde kronik psikososyal stresi indüklemek için iyi kurulmuş bir deneysel paradigmadır10. KMYS, GABA ve reseptörleri10,11 dahil olmak üzere bir dizi nörotransmitter sisteminin modülasyonu yoluyla anksiyete / depresif benzeri davranışsal fenotipleri ve bilişsel eksiklikleri ortaya çıkarır. Özellikle, α5 alt birimi içeren GABA A reseptörü (α5-GABAAR), hafıza ve bilişsel işlevlerin düzenlenmesinde rol oynar12,13, bu alt birimin değiştirilmiş fonksiyonlarının UCMS kaynaklı bilişsel eksikliklere olası katılımını düşündürmektedir. Bu protokolde, BS3 çapraz bağlama testini, stressiz kontrol farelerine kıyasla UCMS'ye maruz kalan farelerin prefrontal korteksindeki yüzey eksprese α5-GABAAR seviyelerini ölçmek için kullandık.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Canlandırıcı</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>2,5 M (%45, a/d) Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>4x SDS numune tamponu (Laemmli)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sülfosüksinimidil) suberat (BS3)</td> <td>Pierce</td><td>A39266</td><td>tartımsız format; 10 x 2 mg</td></tr><tr><td>Beyin matrisi</td><td>Ted Pella</td><td>15003</td><td>Fare için, 30 g yetişkin, koronal, 1 mm</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli prob</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10088-15</td><td>Brüt Anatomi Probu; açılı 45</td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td>milli-Q</td><td>EQ 7000</td><td>Ultra saf su [direnç 18.2 M & Omega; &orta nokta; cm @ 25 & derece; C; toplam organik karbon (TOC) &le; 5 ppb]&nbsp;</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı (3MM)</td><td>Whatman</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Forseps (büyük)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11152-10</td><td>Ekstra İnce Graefe Forseps</td></tr><tr><td>Forseps (küçük)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-10</td><td>Dumont #5 Forseps</td></tr><tr><td>GABA-A R alfa 5 antikor</td><td>İnvitrojen</td><td>PA5-31163</td><td>Poliklonal tavşan IgG; kimyasal çapraz bağlama üzerine hatalı sinyali tespit</td></tr><tr><td>edin GABA-A R alfa 5 C-terminal antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>PPS027</td><td>Poliklonal Tavşan IgG; fare ve sıçan ile çapraz reaksiyona girer</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>W328707</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz konjuge keçi tavşan karşıtı IgG (H + L)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1721019</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2 ve orta nokta; 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40, ikame (NP-40)</td><td>SantaCruz</td><td>68412-54-4</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Makas (büyük)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14007-14</td><td>Cerrahi Makas - Tırtıklı</td></tr><tr><td>Makas (küçük)</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>14060-09</td><td>İnce Makas - Keskin</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör (Qsonica Sonicator Q55)&nbsp;</td><td>Qsonica</td><td>15338284</td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü refregere santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Doku zımbası (ID 1 mm)</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td>Pistonlu Miltex Biyopsi Punch, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 5x Transfer tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>10026938</td><td></td></tr><tr><td>Tüp döndürücü (LabRoller)</td><td>Labnet</td><td>H5000</td><td></td></tr></tbody></table>

bs3 kimyasal Çapraz bağlama testi: kemirgen beyninde kronik stresin hücre yüzeyi gabaa reseptör sunumu Üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Evaluating the Effect of Chronic Stress on Cell Surface GABAA Receptor Presentation in the Rodent Brain

Anksiyete, bilişsel işlevler de dahil olmak üzere hayvan davranışlarını değişken olarak etkileyen bir duygu durumudur. Davranışsal anksiyete belirtileri hayvan krallığında gözlenir ve çok çeşitli stres modalitelerine uyarlanabilir veya uyumsuz tepkiler olarak kabul edilebilir. Kemirgenler, moleküler, hücresel ve devre seviyelerinde anksiyetenin bütünleştirici mekanizmalarını ele alan translasyonel çalışmalar için kanıtlanmış bir deneysel model sunmaktadır. Özellikle, kronik psikososyal stres paradigması, insanlar ve kemirgenler arasında benzer olan anksiyete / depresif benzeri davranışsal fenotipleri taklit eden uyumsuz tepkileri ortaya çıkarır. Önceki çalışmalar, kronik stresin beyindeki nörotransmitter içeriği üzerinde önemli etkileri gösterirken, stresin nörotransmitter reseptör seviyeleri üzerindeki etkisi yeterince çalışılmamıştır. Bu makalede, kronik stres altındaki farelerde nörotransmitter reseptörlerinin nöronal yüzey seviyelerini ölçmek için deneysel bir yöntem sunuyoruz, özellikle duygu ve bilişin düzenlenmesinde rol oynayan gama-aminobütirik asit (GABA) reseptörlerine odaklanıyoruz. Membran geçirimsiz geri dönüşümsüz kimyasal çapraz bağlayıcı bisülfosuccinimidyl suberat (BS3) kullanarak, kronik stresin prefrontal korteksteki GABAA reseptörlerinin yüzey mevcudiyetini önemli ölçüde azalttığını gösteriyoruz. GABAA reseptörlerinin nöronal yüzey seviyeleri, GABA nörotransmisyonu için hız sınırlayıcı bir süreçtir ve bu nedenle, deneysel hayvan modellerinde moleküler bir belirteç veya anksiyete / depresif benzeri fenotiplerin derecesinin bir vekili olarak kullanılabilir. Bu çapraz bağlama yaklaşımı, herhangi bir beyin bölgesinde ifade edilen nörotransmiterler veya nöromodülatörler için çeşitli reseptör sistemlerine uygulanabilir ve duygu ve bilişin altında yatan mekanizmaların daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunması beklenir.

Fare PFC'sindeki yüzey α5-GABA A R seviyelerini değerlendirmek için BS3 çapraz bağlama testinin fizibilitesini göstermek için, SDS-PAGE'de BS3-çapraz bağlı ve çapraz bağlı olmayan protein örneklerinin her biri 10 μg çalıştırdık ve proteinleri bir anti-α5-GABAAR antikoru (tavşan poliklonal) kullanarak batı lekesi ileanaliz ettik (Şekil 7). Çapraz bağlı olmayan protein örnekleri, ~ 55 kDa'da toplam α5-GABA A R miktarını verirken, BS3-çapraz bağlı protein örnekleri, α5-GAB...

BS3 kimyasal çapraz bağlama testi, kronik psikososyal stres koşulları altında fare beyinlerinde azalmış hücre yüzeyi GABAA reseptör ekspresyonunu ortaya koymaktadır.

BS3 Kimyasal Çapraz Bağlama Testi: Kemirgen Beyninde Kronik Stresin Hücre Yüzeyi GABAA Reseptör Sunumu Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Anxiety is a state of emotion that variably affects animal behaviors, including cognitive functions. Behavioral signs of anxiety are observed across the ...

BS3'ü çapraz bağlayıcı olarak kullanan kimyasal çapraz bağlama testi, nörotransmitter reseptör hücre yüzey seviyesinin belirlenmesinde yardımcı olacaktır, bu da nöro iletimin etkinliğinin kritik bir belirleyicisidir. Bu tahlil, hayvan modellerinde çeşitli psikotropik ajanlara veya psikojenik stres modalitelerine yanıt olarak reseptör dinamiklerinin beyin bölgesine özgü değerlendirilmesi için özellikle yararlıdır. Başlamak için, beyni ötenazi C57BL / 6J farenin kafatasından hızla çıkarın.Buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabına 10 ila 15 saniye batırın. Soğutulmuş beyni, ventral tarafa bakan buz üzerindeki beyin matrisine yerleştirin. Beyni koronal olarak kesmek için, ilk tıraş bıçağını koku alma ampulü ile koku alma pedinkülü arasındaki sınırdan yerleştirin.Üç ila dört ek tıraş bıçağı kullanarak, beynin ön kısmını bir milimetre aralıklarla koronal olarak seri olarak kesin. Koronal dilimleri beyin matrisinden kaldırmak için takılı tıraş bıçağını bir arada tutun ve arka kısmı geride bırakın. Forseps kullanarak, tıraş bıçağını birbirinden ayırın ve beyin dilimi yukarı bakacak şekilde düz, soğutulmuş yüzeye yerleştirin.Prefrontal korteksi örneklemek için, koku alma pedinkülünü içeren ilk dilimin arkasındaki ikinci ve üçüncü dilimleri seçin. Bir doku zımba veya forseps kullanarak, istenen bölgeyi çıkarın. Mendili soğutulmuş tıraş bıçağının üzerine koyun ve eşit şekilde iki parçaya bölün.Forsepsin ince ucunu kullanarak her dokuyu tıraş bıçağı üzerinde birden fazla dikey hareketle parçalara ayırın. Yapay beyin omurilik sıvısı içeren önceden soğutulmuş etiketli tüpü 30 mikrolitre BS3 çözeltisi veya araç çözeltisi ile yükseltin E.Sonra hemen kıyılmış dokuları istenen tüpe aktarın. Hipokampusu örneklemek için, beynin arka kısmını matristen çıkarın ve dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde soğutulmuş düz bir yüzeye nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirin.Dorsal taraftan yaklaşan kavisli bir prob ve forseps ile, hipokampüsü her iki yarımküreden diseke edin, ardından dokuyu kıyın ve daha önce gösterildiği gibi uygun çivili tüplere aktarın. Çapraz bağlama reaksiyonu için, doku parçalarını küçük parçalara ayırmak için doku ve çözelti içeren tüpü ters çevirin. Tüp rotatördeki numuneleri 4 santigrat derecede 30 dakika ila 2 saat boyunca inkübe edin ve her tüp için BS3 inkübasyonunun başlangıç zamanını kaydedin.Daha sonra reaksiyonu 78 mikrolitre bir molar glisin ile söndürün. Sabit rotasyonla 4 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin ve söndürme için başlangıç ve bitiş zamanını kaydedin. BS3 çapraz bağlanmasından sonra batı leke analizinde, çapraz bağlı olmayan protein, GABA-A reseptörünün toplam alfa5-alt biriminin yaklaşık 55 kilodaltonda olduğunu gösterdi.Bununla birlikte, BS3 çapraz bağlı proteini, GABA-A reseptörünün endomembranla ilişkili alfa5-alt biriminin, yaklaşık 55 kilodaltonda göç ettiğini ve GABA-A reseptörünün alfa5-alt birimine kovalent olarak çapraz bağlanmış protein komplekslerini temsil eden daha yüksek moleküler ağırlıklı protein türlerini göstermiştir. Ayrıca, GABA-A reseptör seviyelerinin yüzey alfa5-alt biriminde, prefrontal kortekste, stressiz kontrol farelerine kıyasla üç hafta ve beş haftalık KMYS'de anlamlı ve ilerleyici bir azalma gözlenmiştir. Reseptörlerin, ortam sıcaklığında plazma membran yüzeyi ile iç membran arasında mekik dokuduğu bilinmektedir.Bu nedenle doku diseksiyonunun düşük sıcaklıkta yapılması önemlidir. Çapraz bağlama testi kullanılarak, psikososyal stresin, kısmen kaygı, davranış veya bilişsel eksiklikler için moleküler bir temel olarak hizmet eden GABA reseptörlerinin yüzey seviyelerini önemli ölçüde modüle edebileceği ortaya çıkmıştır.

bs3-chemical-crosslinking-assay-evaluating-effect-chronic-stress-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz TSSB hastalarının karakteristik nöroendokrin fonksiyonlarda kalıcı değişikliklere ve gecikmiş uzun vadeli, abartılı bir korku tepkisi, ortaya travma sonrası stres bozukluğu (TSSB) bir sıçan modelinde tarif. Hayvan modeli ve burada tarif edilen yöntemler, fakat mekanistik çevresel beyaz kan hücrelerindeki biyolojik olan hastalarda ölçülemez beyin çekirdeklerinde biyo, kutu arasında ilişki için yararlıdır.

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Bu video, Bis-sülfosüksinimidil suberat veya BS3 kullanılarak nöronal yüzey proteinlerinin çapraz bağlanmasını göstermektedir. İzole edilmiş ve soğutulmuş fare beyni koronal olarak bölümlere ayrılmıştır. İstenilen bölge bölümlerden çıkarılır, kıyılır ve BS3 ile muamele edilir. BS3, GABA reseptörleri gibi yüzey proteinlerini çapraz bağlar ve iç proteinleri değiştirmeden bırakır. Reaksiyon, daha fazla analiz için numuneler işlenmeden önce glisin ile söndürülür.

Kimyasal Çapraz Bağlama Testi Kullanılarak Fare Beynindeki Nöronal Yüzey Proteinlerinin Çapraz Bağlanması

Stres granüller (SGS) takılmıştır ribonükleoprotein parçacıklar (RNP) ve çeşitli gerilimlere, hücresel yanıt olarak önemli sitoplazmik RNA ihtiva eden granüller bulunmaktadır. SG-Dinamiği stresten sonra transfekte primer hücrelerde SGS etiketli bileşeninin lokalizasyonu görselleştirerek canlı hücrelerde takip edilebilir.

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

Öngörülemeyen kronik hafif stres (UCMS) protokolü, kronik stres ve depresif belirtilerle ilişkili davranışsal ve fizyolojik değişiklikleri incelemek için doğrulanmış bir yöntemdir. UCMS protokolünün sekiz haftalık uygulanması, her iki cinsiyetteki kemirgenlerde davranış değişikliklerine ve kötü sağlık sonuçlarına neden olur.

Tahrik Depresif Belirtiler, Davranış Değişiklikleri ve Kemirgenler Negatif Sağlık Kazanımları için Öngörülemeyen Kronik Hafif Stres Protokolü

Burada fareler öngörülemeyen kronik hafif stres iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı uzun vadeli bir depresif benzeri fenotip indükler ve davranışsal ve neuromolecular depresif benzeri açıkları ters içinde sözde antidepresanlar etkinliğini değerlendirmek için sağlar.

Anhedonia farelerde Inducing için öngörülemeyen kronik hafif stres Protokolü

Burada, protokolü ve metil-Seq, kronik stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare modeli kullanarak bir epigenomic platform uygulanması açıklanmaktadır. Sonuçları sıçan metil-Seq platformu sıçanlarda stres maruz kaynaklanan metilasyonu farklılıklar tespit kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir.

Stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare metil-Seq Platform

Bu makalede, bir kısıtlamacı kullanarak kronik immobilize fareler depresif benzeri davranış indüksiyon için Basitleştirilmiş ve standartlaştırılmış bir protokol sağlar. Buna ek olarak, depresyon indüksiyonu doğrulamak için davranış ve fizyolojik teknikler açıklanmıştır.

Farelerde depresyon benzeri davranışlar Inducing için kronik Immobilizasyon Stres Protokolü

Y-labirent bariyer görevi ödül için çaba harcamak için motivasyon inceleyen bir davranış testidir. Burada, kronik kortikosteron ve bu davranış ile sosyal yenilgi stres idestmesi de dahil olmak üzere birden fazla iyi doğrulanmış kronik stres test tartışmak, yanı sıra yeni kronik non-ayrımcı sosyal yenilgi stres (CNSDS), hangi kadınlarda etkilidir.

Kronik Stres Shifts Çabalar-İlgili Seçim Davranış Farelerde Bir Y-Labirent Bariyer Görev

Bu protokol, Moğol tıp teorisine dayanan depresyon için kronik öngörülemeyen hafif stres (CUMS) modelini ve davranışsal testleri doğrulama yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir.

Moğol tıbbına dayalı Sıçanlarda Kronik Öngörülemeyen Hafif Stres

Bu çalışma, dört günlük sosyal stresörleri entegre ederek, dişi C57BL / 6J farelerinde psikiyatrik bozukluklar için çoklu entegre bir sosyal stres (MISS) modelini tanımlamaktadır. On günlük tekrarlanan MISS maruziyetinden sonra, fareler depresif ve anksiyete benzeri fenotipler geliştirdi, böylece kadın deneklerde psikiyatrik bozuklukları incelemek için doğal, etiyolojiye dayalı bir hayvan modeli sağladı.

Dişi C57BL/6J Farelerde Psikiyatrik Bozukluklar için Çoklu Entegre Sosyal Stres Modeli

Bu makale, farelerde ve sıçanlarda fiziksel kısıtlama stresi kullanarak stres tepkilerini indükleme prosedürlerini kapsar. Kemirgen modellerinde kısıtlama stresi seçerken ve kullanırken dikkat edilmesi gereken ek hususlar tartışılmaktadır.

Farelerde ve sıçanlarda stresi indüklemek için kısıtlama

Öğrenin, BS3 kimyasal çapraz bağlama testiyle kronik psikososyal stresin kemirgen beynindeki GABA A reseptör hücre yüzeyi sunumuna etkisini. Bu yöntem, anksiyete ve bilişsel bozuklukların moleküler temellerini anlamaya yardımcı olur.

BS3 Kimyasal Çapraz Bağlama Testi: Kemirgen Beyninde Kronik Stresin Hücre Yüzeyi GABAA Reseptör Sunumu Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

BS3 Kimyasal Çapraz Bağlama Testi: Kemirgen Beyninde Kronik Stresin Hücre Yüzeyi GABA_A Reseptör Sunumu Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet