Name: Caenorhabditis elegansta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Öğrenin, C. elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünü ölçme yöntemini. Bu standart protokol, genetik çalışmalarda gelişim süreçlerini değerlendirmek için yeni araştırmacılara rehberlik eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jaramillo-Lambert laboratuvarındaki çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS R35GM142524 tarafından desteklenmektedir. Tüm C. elegans suşları , Ulusal Sağlık Enstitüleri, P40 OD010440 tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Şekil 1D , Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız.
1. Deney plakalarının hazırlanması
<ol><li>Modifiye Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) ortamı ile 35 mm çapında Petri yemekleri hazırlayın. MYOB plakaları yapmak için, 20 g Bacto agar, 2 g NaCl, 0.55 g Trizma-HCl, 0.24 g Trizma-OH, 3.1 g Bacto pepton ve 1.6 mL kolesterolü 1 L ddH2O'ya ve 121 ° C'de 40 dakika boyunca otoklav ekleyin. 55 ° C'ye soğumaya bırakın ve steril teknik kullanarak, her 35 mm Petri kabına 4 mL erimiş ortam dökün. NOT: Bir litre MYOB, 6 aya kadar 4 ° C'de saklanabilen ~ 250 plaka yapar. Her suş için üç replika kümesi ile replika başına en az 10 birey öneririz.</li>
	<li>Steril tekniği kullanarak, plakaları plakanın ortasında küçük bir nokta (yaklaşık 50 μL) OP50 bakterisi ile tohumlayın. NOT: Küçük çimler, çapraz döllenmeyi değerlendirmek için özellikle önemlidir, çünkü daha küçük nokta erkekler ve hermafroditler arasında daha fazla karşılaşmaya yol açar, böylece çiftleşme şansını arttırır.</li>
</ol>2. Embriyonik canlılık testleri (hermafrodit kendi kendine döllenme)
<ol><li>1. Gün<ol><li>Her plakanın arkasını etiketleyin. Deney boyunca her plakayı ve ilgili solucanları takip ettiğinizden emin olun. NOT: Tercih edilen etiketleme tekniği-Gün 1: solucan 1, Gün 1: solucan 2, ... ve saire.</li>
		<li>Her plakaya ayrı bir L4 evre hermafrodit aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Solucanların yetişkinlere dönüşmesine izin verin ve 20 ° C'lik standart kültür sıcaklığında 24 saat boyunca kendi kendine soy bırakmayın. Bu plakaları 3. günde puanlayın. NOT: Deneylerin sıcaklığı, sıcaklığa duyarlı mutasyonlar durumunda değiştirilebilir. Sıcaklığa duyarlı mutasyonlar için, embriyonik canlılık testleri hem izin verilen (15-16 ° C) hem de izin verilmeyen sıcaklıklarda (24-26 ° C) yapılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>Bir dizi yeni plakayı etiketleyin-Gün 2: solucan 1, Gün 2: solucan 2, ... ve saire.</li>
		<li>1. gün bireysel solucanları yeni plakalara aktarın. NOT: Bu solucanlar yetişkinliğe ulaşmış olmalı ve vahşi tip solucanlar embriyo bırakmaya çoktan başlamış olmalıdır.</li>
		<li>Solucanların 20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca embriyo bırakmasına izin verin. Bu plakaları 4. günde puanlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün<ol><li>Bir dizi yeni plakayı etiketleyin. 3. Gün: Solucan 1. Gün, 3. Gün: Solucan 2, ... ve saire.</li>
		<li>2. gün bireysel solucanları yeni plakalara aktarın. 20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca soy bırakmalarına izin verin. Bu plakaları 5. günde puanlayın. NOT: Düşük sıcaklıklarda, kuluçka süreleri artacaktır. Buna göre ayarlayın.</li>
		<li>İnce bir işaretleyici kullanarak 35 mm'lik bir kapak üzerine bir ızgara deseni çizin. Daha önce sayılan solucanları takip etmek için ızgaralı kapağı sayım için test plakasının altına yerleştirin (Şekil 1A-B).<ol><li>Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, döllerin varlığı veya yokluğu için 1. gün plakalarını puanlayın. Canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayın. NOT: Bu noktada, herhangi bir canlı embriyonun yumurtadan çıkması gereken yeterli bir süre geçmiştir. Yumurtadan çıkmamış embriyoların öldüğü varsayılır.</li>
			<li>Tek bir kare içinde, tamamen kare içinde bulunan yumurtadan çıkmamış embriyoları ve canlı larvaları sayın (Şekil 1C-F).</li>
			<li>Kare kenarlıklarda bulunan solucanlar için, solucan kafasının konumuna göre sayın. Kafaları karenin üst ve sol kenarlarına dokunan solucanları sayın (alt veya sağ kenarlara dokunanları saymayın; Şekil 1D). Bu tahlil için döllenmemiş oositleri saymayın (Şekil 1F).</li>
		</ol></li>
		<li>Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>4. Gün<ol><li>Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak 2. gün plakalarını puanlayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>5. Gün<ol><li>Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak 3. günü puanlayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Veri analizinde açıklanan yöntemi kullanarak elde edilen verileri analiz edin. NOT: Bazı genetik mutantlar gecikmiş veya genişlemiş üreme döngüsüne sahip olabilir. 3. gün plakalarının ötesinde embriyoların devam eden döşemesi için bireysel suşları izleyin. Embriyo üretimi 4. güne kadar durmadıysa, yetişkinleri yeni plakalara aktarmaya devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Embriyonik canlılık testleri (erkek / hermafrodit çapraz döllenme)
<ol><li>1. Gün<ol><li>Her plakanın arkasını etiketleyin. Deney boyunca her plakayı ve ilgili solucanları takip ettiğinizden emin olun.</li>
		<li>Her plakaya ayrı bir L4 hermafrodit solucanı aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. NOT: Sperm üretmeyen fog-2 fonksiyon kaybı mutantları gibi dişileştirilmiş suşlar, hermafroditlerin yerine kullanılabilir.</li>
		<li>L4 hermafrodit içeren her etiketli plakaya tek bir L4 erkek solucanı aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. NOT: Plg-1 varyantı erkekler gibi suşlar, çiftleşmenin gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için kullanılabilir, çünkü bu erkekler çiftleşmeden sonra hermafrodit vulva üzerinde bir çiftleşme tıkacı biriktirir.</li>
		<li>Solucanların çiftleşmesine ve 20 ° C'de 24 saat boyunca veya başka bir uygun sıcaklıkta soy bırakmasına izin verin. Bu plakaları 3. günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için puanlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>Bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve yukarıdaki 2. günde olduğu gibi solucanları aktarın. Bu durumda, hem hermafroditi hem de erkeği yeni plakalara aktardığınızdan emin olun. Hermafroditin yetişkinliğe ulaştığından emin olun.</li>
		<li>Hermafroditlerin 20 ° C'de 24 saat boyunca veya başka bir uygun sıcaklıkta soy bırakmasına izin verin. Bu plakaları 4. günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için puanlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün<ol><li>Bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve yukarıdaki 3. günde olduğu gibi solucanları aktarın. Hem hermafroditi hem de erkeği yeni plakalara aktardığınızdan emin olun.</li>
		<li>20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca döl bırakmasına izin verin. Bu plakaları 5. günde canlı ve yumurtadan çıkmamış embriyolar için puanlayın.</li>
		<li>Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları 1. gün plakalarından sayın. NOT: 4. gün için gerekli oldukları için plakaları atmayın.</li>
		<li>Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>4. Gün<ol><li>Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı soyu ve yumurtadan çıkmamış embriyoları 2. gün plakalarından sayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.</li>
		<li>Erkekler için gün 1 plakalarını kontrol edin. Çiftleşme meydana gelmişse, hermafroditlerin erkeklere beklenen genetik oranı 50:50 olmalıdır. 1. gün plakaları herhangi bir erkek içermiyorsa, erkek ve hermafrodit arasında çiftleşme meydana gelmemiştir. Bu çiftleşme çiftini atın ve bu gözlemi laboratuvar defterine kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>5. Gün<ol><li>Canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları, adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, 3. gün plakalarından sayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Veri analizinde açıklanan yöntemleri kullanarak elde edilen verileri analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Denklemi kullanarak bir suşun belirli bir biyolojik kopyasının embriyonik canlılık yüzdesini hesaplayın (1). NOT: Canlı soy ve yumurtadan çıkmamış embriyo sayıları, deney dönemi boyunca günlük sayımın toplamı ile elde edilir. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>Ana hermafrodit tarafından üretilen döl sayısını (yumurtadan çıkmamış embriyolar ve larvalar) toplayarak belirli bir suşun solucanı başına yavru boyutunu hesaplayın. Denklemi kullanarak ortalama yavru boyutunu hesaplayın (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	<li>Embriyonik canlılık yüzdesini ve ortalama yavru büyüklüğünü, biyolojik replikalar arasındaki ortalama ve standart sapma ile raporlayın. Kontrol ve deneysel verileri karşılaştıran Student'ın t-testini gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li>
<li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities%3A+aneuploidies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Education%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172(2008).</li>
<li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li>
<li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li>
<li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li>
<li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li>
<li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Cinsel olarak üreyen türlerin çoğalması, mayoz yoluyla haploid gametlerin (yani yumurta ve sperm) oluşumunu gerektirir, bunlar daha sonra döllenmede birleştirilir, diploid kromozom sayısını geri kazandırır ve embriyonik gelişimi başlatır. Bu süreçlerden herhangi birindeki hatalar kısırlığa, embriyonik ölümcüllüğe ve / veya doğum kusurlarına yol açabilir. C. elegans, cinsel üremeyi incelemek için güçlü bir model sistemdir. Gen mutasyonlarının veya gen ekspresyonunun nakavtının (örneğin, RNA girişimi) etkileri, yukarıda açıklanan embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma testleri kullanılarak nispeten hızlı ve kolay bir şekilde değerlendirilebilir. Bu yöntemleri, mayotik kromozom ayrışması ve döllenme/yumurta aktivasyonu10,11,12 ile ilgili genlerin ilk karakterizasyonu için kullandık. Embriyonik canlılıkta veya yavru boyutunda gözlenen bir azalma, mayoz, gametogenez, döllenme veya embriyogenezde bir bozulma olduğunu gösterir.
Embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma, soy sayımı ve basit bir matematiksel hesaplama yoluyla nispeten kolay bir şekilde değerlendirildiğinden, bunlar laboratuvarda veya sınıfta araştırma acemileri için en uygun giriş deneyleridir. C. elegans yetiştiriciliğinin kolaylığı ve ekonomik avantajları, onları deneysel biyoloji dersleri için özellikle uygun hale getirmektedir. Öğrenciler C. elegans hayvancılığı yoluyla değerli araştırma deneyimi kazanırlar, diseksiyon mikroskoplarını kullanmayı öğrenirler ve gelişimsel bir sistemde nispeten kısa sürede (bu makalede açıklanan protokolle yaklaşık 5 gün) cevaplanabilecek biyolojik sorular sorabilirler.
Embriyonik canlılık testleri için soy sayımlarının zamanlaması çok önemlidir. 20 ° C'de, embriyogenez yaklaşık 16 saat sürer ve üreme açısından olgun yetişkinler, L1 larvaları olarak yumurtadan çıktıktan yaklaşık 60 saat sonra yumurta bırakmaya başlar. Yaşam döngüsü hızlı olduğu için, embriyoların yumurtadan çıkması için yeterli zamana izin veren, ancak döllerin kendileri yumurta bırakmaya başlamadan önce uygun pencerede dölleri saymak önemlidir. Büyüme dönemlerinin sıcaklığa bağlı olarak değiştiğini de belirtmek önemlidir. Büyüme, 24-25 °C'de 15-16 °C'den yaklaşık 2,1 kat daha hızlıdır ve 20 °C'de 15-16°C'den yaklaşık 1,3 kat daha hızlıdır. Bu protokolde, yetişkinler taze bir tabağa yerleştirildikten 48 saat sonra sayımların yapılmasını öneririz. Bu zaman dilimi, vahşi tip gelişime sahip tüm embriyoların yumurtadan çıkmak için yeterli zamana (>16 saat) sahip olmasını, ancak üreme kabiliyeti noktasına kadar yaşlanmamasını sağlar. 20 ° C'den düşük sıcaklıklarda yapılan testlerin, embriyoların yumurtadan çıkması ve yumurtadan çıkan döllerin MYOB plakalarındaki bakteriler arasında gözlemlenmesi daha kolay olan larva aşamalarına (L3-L4 aşamaları) ulaşması için uzatılması (4 gün boyunca hayvanları transfer etmek) gerekebilir.
Embriyonik canlılık tahlilleri ve yavru boyutlandırma ile ilgili bir sınırlama, bozulan spesifik gelişimsel sürecin kolayca belirgin olmamasıdır. Bununla birlikte, bu ilk tahliller, hangi sürecin etkilendiğini belirlemek için sitolojik tekniklerle takip edilebilir. Örneğin, gonadı serbest bırakmak için yetişkin solucanların diseksiyonu, ardından 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyaması ve germ hattı içindeki DNA morfolojisinin dikkatli bir şekilde analiz edilmesi, mayotik süreçlerin bozulup bozulmadığını ortaya çıkarabilir. Ek olarak, embriyoların DAPI boyaması, embriyogenezin hangi aşamada durduğunu ortaya çıkarabilir.
Sonuç olarak, üretilen embriyo sayısını (yavru) ve çeşitli C. elegans mutantları için uygun embriyoların yüzdesini belirlemek için bir protokol tanımladık. Bu tahlil hem kendi kendine döllenen hermafroditler hem de erkek / hermafrodit haçları için kullanılabilir. C. elegans'ın kısa yaşam döngüsü ile bu protokol 1 haftadan daha kısa sürede tamamlanabilir. Embriyonik canlılık testleri ve yavru boyutları, mayoz, döllenme veya embriyonik gelişimde rol oynayan genlerin ilk analizleri olarak kullanılabilir ve daha gelişmiş araştırmacılar ve araştırma acemileri (lisans ve birinci sınıf lisansüstü öğrencileri) için uygun protokollerdir.

Ökaryotik organizmalarda cinsel üreme, döllenme süreci boyunca bir embriyo oluşturmak için birleşen fonksiyonel gametlerin üretimini gerektirir. Maternal ve paternal gametler, yumurta (yumurtalar) ve sperm, mayoz ve gametogenezin özelleşmiş hücre bölünmesi ve farklılaşma süreçleri yoluyla oluşturulur1. Mayoz, tek bir diploid hücre ile başlar ve orijinal ebeveyn hücrenin kromozom sayısının yarısını içeren yavru hücrelerin oluşumu ile sona erer. Ploidinin azaltılmasından, genetik materyalin bağımsız ürün çeşitliliği ve çapraz rekombinasyon yoluyla karıştırılmasına kadar, mayoz birçok önemli fonksiyona hizmet eder1. Mayoz içindeki hatalar, bir gamet içinde çok fazla veya çok az kromozom bulunan anöploidi ile sonuçlanabilir. Anöploidi insidansı insan sağlığı üzerinde muazzam etkilere sahiptir, çünkü kromozomal dengesizlikler düşüklerin ve Down sendromu ve Edwards sendromu gibi gelişimsel bozuklukların önemli bir nedenidir2.
Döllenme, anne ve baba gametlerinin yeni bir organizma oluşturmak için kaynaştığı süreçtir3. Gamet-gamet tanıma, gamet yüzeyindeki proteinler tarafından kolaylaştırılır3. Gamet uyumluluğu ile ilgili hatalar, sperm ve yumurta füzyonu ilerleyemediği için infertiliteye yol açar. Spermin bir oosit ile füzyonu, tek hücreli bir embriyodan mitotik bölünmeler yoluyla tamamen işlevsel çok hücreli bir organizmaya gelişimsel yolculuğa başlayabilen aktif bir embriyonun doğru oluşumuna yol açan bir dizi olayı tetikler4. Embriyogenez boyunca, gelişimi düzenleyen moleküler olaylar, organizmanın düzgün büyümesini sağlamak için sıkı bir şekilde düzenlenmeli ve hassas bir şekilde zamanlanmalıdır5. Erken gelişim sırasında uygun hücresel farklılaşma, organizma pluripotent bir embriyodan tam teşekküllü bir organizmaya geçerken çok önemlidir. Bu olayların karmaşıklığı nedeniyle, bozulmalar embriyonik ölümcüllükle sonuçlanan gelişimsel kusurlara yol açabilir.
Caenorhabditis elegans, mayoz, döllenme ve embriyonik gelişimi incelemek için mükemmel bir model organizmadır. C. elegans, erkek ve hermafrodit olmak üzere iki cinsiyeti olan şeffaf bir nematoddur. Kendi kendine döllenme yeteneğine sahip olan C. elegans hermafroditleri, baskın cinsiyettir 6,7. Hermafrodit gonad ilk olarak spermatheca'da depolanan dördüncü larva (L4) aşamasında sperm üretir. L4'ten yetişkinliğe geçişte, germ hattı oosit üretmeye geçer ve bunlar daha sonra depolanan sperm yoluyla döllenir. Hermafroditlerde% 0.2'den daha az bir oranda ortaya çıkan erkekler sadece sperm üretir ve hermafroditlerle çiftleşebilir. Çapraz döllenme üzerine, erkek spermi, oositlerin döllenmesinde hermafrodit spermini geride bırakır8. Bu, homozigot mutantların kendi kendine döllenen stoklar yoluyla nispeten kolay bir şekilde korunmasına ve genetik haçlar yoluyla genetik manipülasyonlara izin verir. İki cinsiyet, erkek ve dişi germ hatlarındaki mayoz arasındaki farkları araştıran çalışmalara izin verir. Ayrıca, C. elegans ve yumurtalarının şeffaf doğası nedeniyle, mayoz, gametogenez, döllenme ve embriyogenez süreçleri, floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak canlı, sağlam hayvanlarda incelenebilir.
C. elegans'ta mayoz, döllenme ve / veya embriyonik gelişimde rol oynayabilecek genlerdeki yeni mutasyonları analiz ederken, çok önemli bir ilk adım, embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü belirlemektir, çünkü bu süreçlerdeki hatalar genellikle canlı döl üretiminde bir başarısızlığa veya azalmaya yol açar. Bu yazıda, kendi kendine döllenen hermafroditlerden veya hermafroditler ile erkekler arasındaki çaprazlardan doğurganlığı, embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu klasik tahlil birçok C. elegans çalışmasında kullanılmış olsa da, kurulum ve doğru niceleme için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, çiftleşme ve soy üretimine izin vermek için bireysel solucanlar veya erkek / hermafrodit çiftleri izole edilir. Döl üretimi ve canlılığı, canlı soy ve canlı olmayan embriyoların sayısını belirlemek için bir dizi gün boyunca gözlemlenir. Deneyin sonunda, embriyonik canlılık yüzdesini ve toplam yavru boyutunu hesaplamak için bireysel yavrular analiz edilir.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri kapları</td><td>Tritech research</td><td>T3501</td><td>Yarı istiflenebilir, havalandırmasız.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson ve Şirketi</td><td>214010</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>Kolestrol</td><td>Sigma için&nbsp;</td><td>MYOB</td>Sodyum Klorür için <td>C8503</td></tr><tr><td></td><td>JT Baker</td><td>FW 58.440</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>için T1503</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>Trizma hidroklorür</td><td>için Sigma T3253 MYOB için <</td><td></td><td></td></tr><tr><td>güçlü > Suşlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C elegans vahşi tip suş</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td> Escherichia coli</td> <td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td> him-5 (e1490) </td> <td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td>DR466</td><td></td></tr> <tr><td> spo-11 (ok79) </td> <td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td>AV106</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman / yazılım< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diferansiyel hücre sayacı</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-670-12</td><td></td></tr><tr><td>MicroSoft Excel veya Prism</td><td>MicroSoft veya GraphPad</td><td></td><td>Verilerin grafiksel temsillerini kaydetmek ve oluşturmak için.</td></tr><tr><td>platin tel</td><td>Tritech araştırması</td><td>PT9901</td><td>Solucan kazmaları yapmak için. %99,5 Platin, %0,5 İridyum. Bu, 36 solucan kazması yapmak için yeterli olan 3 ft/paket olarak gelir (seçim başına ~ 1 inç platin tel).</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td>Odak montajlı diyaskopik taban, entegre LED modülü, güç kablosu, 6,7x - 50x Yakınlaştırma aralığı [WD 115 mm], Geniş Alan Göz Merceği C-15x/17 (Not: eşdeğer stereomikroskoplar diğer üreticilerden temin edilebilir.)</td></tr><tr><td>solucan toplama kolu</td><td>Tritech araştırma</td><td>TWPH1</td><td>Solucan kazmaları yapmak için. Platin tel içinde ~ 1'i sonsuz çekme sapına monte edin. Alternatif olarak, platin telin bir cam Pasteur pipetine monte edilmesiyle solucan kazmaları yapılabilir.</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans , mayoz, döllenme ve embriyonik gelişim çalışmaları için mükemmel bir model organizmadır. C. elegans , büyük yavru yavruları üreten kendi kendine döllenen hermafroditler olarak bulunur - erkekler mevcut olduğunda, daha büyük çapraz soy yavruları üretebilirler. Mayoz, döllenme ve embriyogenezdeki hatalar hızla sterilitenin fenotipleri, azalmış doğurganlık veya embriyonik ölümcüllük olarak değerlendirilebilir. Bu makalede, C. elegans'ta embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bireysel bir Modifiye Youngren'ın, Sadece Bakto-pepton (MYOB) plakasına bir solucan toplayarak bu tahlilin nasıl kurulacağını gösteriyoruz, canlı soy ve canlı olmayan embriyoları saymak için uygun zaman dilimini oluşturuyoruz ve canlı solucan örneklerinin nasıl doğru bir şekilde sayılacağını açıklıyoruz. Bu teknik, kendi kendine döllenen hermafroditlerde canlılığı ve çiftleşme çiftleriyle çapraz döllenmeyi belirlemek için kullanılabilir. Bu nispeten basit deneyler, lisans öğrencileri ve birinci sınıf lisansüstü öğrencileri gibi yeni araştırmacılar için kolayca benimsenebilir.

N2 (vahşi tip) ve mayozda rol oynayan genlerde mutasyon barındıran iki suş, him-5 (e1490) ve spo-11 (ok79) üzerinde embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma testleri yaptık. Hem him-5 hem de spo-11<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank"></a>

Burada, C. elegans model organizmasını kullanarak embriyonik canlılığı ve üretilen toplam embriyo sayısını (kuluçka) belirlemek için genel bir yöntem sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Yavru büyüklüğünü ve embriyonik canlılığı belirlemek için kullanılan bu protokol birçok C.elegans laboratuvarı tarafından kullanılmaktadır. Kaba boyut ve embriyonik canlılıktaki azalmalar, miyoz, döllenme ve embriyogenez gibi önemli gelişimsel süreçlerdeki kusurları gösterebilir. Bu teknik, acemi C.elegans araştırmacıları için açık talimatlar sağlar.Kurulumu ve yürütülmesi nispeten basittir ve yeni mutant suşlarla çalışırken harika bir başlangıç noktasıdır. Bu teknik için en büyük zorluk, embriyoya karşı döllenmemiş embriyo tanımlamasıdır. Yeni araştırmacılar, bu deneylere başlamadan önce embriyoların, oositlerin ve farklı larva aşamalarının tanımlanması için pratik yapmalıdır.Başlamak için, plakanın arkasını etiketleyin, ayrı bir L4 aşamalı hermafroditi plakaya aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Solucanların yetişkinlere dönüşmesine izin verin ve 20 santigrat derecelik standart kültür sıcaklığında 24 saat boyunca kendi soylarını bırakın.Plakayı üçüncü günde puanlayın. Ertesi gün, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve bir günlük solucanı yeni plakaya aktarın. Solucanların embriyoları 20 santigrat derecede 24 saat boyunca bırakmalarına izin verin.Plakayı dördüncü günde puanlayın. Üçüncü günde, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve ikinci gün bireysel solucanları yeni plakaya aktarın. Solucanların 20 derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin.Plakayı beşinci günde puanlayın. İnce bir işaretleyici kullanarak 35 milimetrelik bir kapak üzerine ızgara deseni çizin. Daha önce sayılan solucanları takip etmek için ızgaralı kapağı sayım için test plakasının altına yerleştirin.Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları bireysel kare içinde sayın. Kare kenarlıklardaki solucanlar için solucan kafasının konumuna göre sayılır. Kafaları karenin üst ve sol kenarlarına dokunan solucanları sayın.Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Dördüncü günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak ikinci gün plakasını puanlayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Beşinci günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak üçüncü gün plakasını puanlayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin.Plakanın arkasını etiketledikten sonra, tek bir L4 hermafrodit solucanını plakaya aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Tek bir L4 erkek solucanını bir L dört hermafrodit içeren plakaya aktarın.Solucanların çiftleşmesine ve 20 santigrat derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Üçüncü günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için plakayı puanlayın. Ertesi gün, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve hermafrodit ve erkeği yeni plakaya aktarın.Hermafroditin yetişkinliğe ulaştığından emin olun. Hermafroditlerin 20 santigrat derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Dördüncü günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için plakayı puanlayın.Üçüncü günde, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve hermafrodit ve erkeği yeni plakaya aktarın. Solucanların 20 derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Beşinci günde canlı ve yumurtadan çıkmamış embriyolar için plakayı puanlayın.Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları bir plakadan itibaren sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Dördüncü günde, canlı soyları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları ikinci gün plakasından sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Erkekler için bir gün tabağı kontrol edin.Çiftleşme meydana gelmişse, hermafroditlerin erkeklere beklenen genetik oranı 50 ila 50'dir. Bir gün plaka herhangi bir erkek içermiyorsa, erkek ve hermafrodit arasında çiftleşme gerçekleşmedi. Bu çiftleşme çiftini atın ve gözlemi laboratuvar defterine kaydedin.Beşinci günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları üçüncü günden itibaren sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. N2 için embriyonik canlılık testi% 98.9'luk bir canlılık yüzdesi verirken, hem him-5 (e1490) hem de spo-11 (ok79) sırasıyla % 74.9 ve% 0.8'lik bir yüzde ile embriyonik canlılıkta bir azalma göstermiştir. Ortalama yavru büyüklüğü N2, him-5(e1490) ve spo-11(ok79) sırasıyla 217, 105 ve 219 olarak belirlenmiştir.C.elegans gelişiminin çeşitli aşamalarının tanınması, doğru ve tekrarlanabilir veriler için önemlidir. Resimler ve diseksiyon mikroskobu kullanarak solucan gelişimine aşina olmanızı öneririz. Bu prosedür, bir genin gelişimsel bir sürece dahil olup olmadığını belirlemek için harika bir ilk adımdır ve hangi sürecin bozulduğunu belirlemek için sitolojik analizlerle takip edilebilir.

measuring-embryonic-viability-and-brood-size-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, C. elegans'ın ömrünü ölçmek için geleneksel, plaka tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Örnek protokol, RNAi ile tedavi edilen solucanların ömrünü ölçer.

Yaşam Süresi Analizi: C. elegans Uzun Ömürlülüğün Ölçülmesi

C. elegans yumurtlama davranışı, gelişimsel, üreme ve anatomik çalışmalarda önemli bilgiler sağlayabilir. Bu video, bir yumurtlama testinin önemli adımlarını tanıtır ve bir ilacın üreme toksisitesi açısından test edildiği örnek bir deneyi gösterir.

Yumurtlama Deneyi: C. elegans'ın Yumurtlama Davranışını Ölçmek İçin Bir Yöntem

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bir modeli hayvan, Caenorhabditis elegans, kimyasal toksisitesi değerlendirmek için temel bir protokol açıklanmıştır. Uygun ve risk değerlendirmesi çeşitli çevresel kirleticilerin gelince de eczacılık gelişimi için yararlı yöntemdir.

Büyüme ve üreme Caenorhabditis elegans kimyasallar etkisi ölçme

Burada biz yineleme kümesi yöntemi, bir yaklaşım kantitatif ölçmek C. elegans ömrü/hayatta kalma ve healthspan yüksek üretilen iş ve sağlam bir şekilde böylece veri kalite ödün vermeden birçok koşullar tarama izin tanımlamak. Bu iletişim kuralı strateji detayları ve yineleme kümesi veri çözümlemesi için bir yazılım aracı sağlar.

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

Mitokondrial solunum organizmalar hayatta kalmak için önemlidir; Bu nedenle, oksijen tüketim oranını mitokondrial sağlık mükemmel bir göstergesidir. Bu iletişim kuralı, Bazal ölçmek için piyasada bulunan bir respirometer nasıl kullanılacağını açıklar ve maksimal oksijen tüketimi oranlarında yaşa, sağlam ve serbestçe hareketli Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Sperm, bir ooksit döllemek için ovidukt üzerinden başarılı bir şekilde gezinmelidir. Burada, C. elegans hermafrodit uterusun içinde sperm göçünü ölçmek için bir tahlil açıklanmaktadır. Bu tahlil çiftleşme sonra rahim içinde sperm dağılımı nicel veri sağlayabilir, yanı sıra hız, yönlü hız, ve ters frekans.

Ölçme sperm rehberlik ve motilite içinde Caenorhabditis elegans hermafrodit üreme yolu

Bu protokol, Drosophila'nın embriyodan yetişkine kadar her gelişim aşamasındaki canlılığını değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yöntem, farklı genotiplerin veya büyüme koşullarının canlılığını belirlemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir.

Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Bu protokol, Caenorhabditis elegans'ta embriyonik ölümlülük oranını nicelendirmek için basit ve düşük maliyetli bir prosedür sunar. Özel ekipman veya solucan toplama uzmanlığı olmadan popülasyonlar arasında embriyonik anormalliklerin doğrudan tespit edilmesini sağlar. Protokol, genetik mutasyonların, RNA girişimiyle yapılan gen çökerliklerinin ve diyetin etkilerini nicelendirmek için kullanılabilir.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik ölümcüllük oranının nicelendirilmesi

Öğrenin, C. elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünü ölçme yöntemini. Bu standart protokol, genetik çalışmalarda gelişim süreçlerini değerlendirmek için yeni araştırmacılara rehberlik eder.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Daha fazla video keşfet