Name: İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Öğrenin, fare beyninden izole edilen mikroglia hücrelerinde intranükleer akış sitometrisi ile global histon modifikasyonlarını nicel olarak nasıl tayin edebilirsiniz. Bu yüksek verimli yöntem, nörogelişimsel bozuklukların epigenetik mekanizmalarını hızla taramanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Şekil 5'teki immünoblota yardım ettiği için Yanyang Bai'ye teşekkürler. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri [CRC-RS 950-232402 - AC] tarafından desteklenmiştir; Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 - AC]; İskoç Riti Yardım Vakfı [21103'ten AC'ye] ve Beyin Kanada Vakfı'ndan [AWD-023132'den AC'ye]; British Columbia Üniversitesi Aborijin Yüksek Lisans Bursu (6481'den MT'ye); Britanya Kolumbiyası Yüksek Lisans Bursu (6768'den MT'ye); Kanada Açık Sinirbilim Platformu Öğrenci Akademik Ödülü (10901'den JK'ya); British Columbia Üniversitesi Dört Yıllık Doktora Bursu (6569'dan JK'ya). Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Fare Beyni Histon Modifikasyonu Miktar Tayini

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
<li>Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGosselin%2C+D+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis%3A+An+Integrated+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li>
<li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70(2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Flow+Cytometry+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li>
<li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li>
<li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+in+the+brain%3A+measuring+global+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li>
<li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRvix%22%5BJournal%5D)">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Sunulan protokol, akış sitometrisi yoluyla küresel HPTM seviyelerinin kantitatif değerlendirmesini sağlar. Bu protokol yeni bir yöntem sunarken, önceki çalışmalar benzer bir yaklaşım kullanarak proteinlerin kantitatif değerlendirmesini yapmıştır26. HPTM'lerin global düzeylerini değerlendirmek için kullanılan önceki yöntemler arasında immünohistokimya ve western blot 16,17,19,20 bulunmaktadır. Sunulan akış sitometrisi tabanlı yöntem kolayca ölçülebilir bir yöntem iken, western blot ve immünohistokimya yarı kantitatiftir ve daha düşük verime sahiptir. Western blot, hücre lizisine dayanır ve bu nedenle hem protein normalizasyonu hem de deneysel koşul27 tarafından değişmediği varsayılan bir yükleme kontrol proteini gerektirir. İmmünohistokimya yarı kantitatif ve çok düşük verimlidir, çünkü tek bir hücre düzeyinde inceleme yapmadan protein miktarını kantitatif olarak değerlendirmek zordur16. Benzer şekilde, izole edilmiş mikroglia için, western blot çok daha büyük protein girdisi gerektirdiğinden, sınırlı verim nedeniyle akış sitometrisi yöntemini kullanmanın bir faydası vardır19. Düşük hücre sayısı gereksinimleri, aynı hayvandan birden fazla boyama panelinin çalıştırılmasına izin verir.
Bununla birlikte, diğer herhangi bir yöntemde olduğu gibi, tüm antikorlar bir akış sitometrisi ortamında iyi çalışmadığından, antikor maliyeti ve kullanılabilirliği dahil olmak üzere bu tekniğin sınırlamaları vardır. Ek olarak, immünoblot ile karşılaştırıldığında, gerekli antikor konsantrasyonu çok daha yüksektir. Çoğullama, aynı hücre panelinde birden fazla antikorun kullanılmasına izin verirken, hücreler analizden sonra antikordan sıyrılamaz, böylece hücre kullanımını antikor türü başına bir tane ile sınırlandırır. Bu, aynı lekenin tekrar tekrar kullanılabileceği immünoblottan farklıdır. Bununla birlikte, antikorların mevcudiyetine ve bir sitometredeki tespit kanallarının sayısına bağlı olarak, aynı anda bir düzine kadar işareti incelemek mümkün olacaktır.
Mevcut yöntem, spesifik genomik konumu değil, yalnızca küresel protein ekspresyon seviyelerini yakalar ve küresel seviyelerdeki değişiklikler, bireysel genomik lokuslardaki değişiklikleri yansıtmayabilir. Benzer şekilde, küresel seviyelerde bir değişiklik olmaması, hiçbir genomik lokusun değişime uğramadığı anlamına gelmeyebilir, sadece küresel değişikliklerin tedaviler arasında hiçbir fark olmadığı anlamına gelir. Bu nedenle, bu tekniğin, genomik analiz için ilgilenilen HPTM'leri tanımlamak için bir ekran olarak kullanılması amaçlanmıştır. Ek olarak, bu yöntem, kontrol için bir kat değişikliği olarak değerlendirildiği durumlar dışında, farklı protein işaretleri arasında karşılaştırmaya izin vermez. Bu nedenle, protein tayini için ELISA gibi standart eğri tabanlı bir yöntemle karşılaştırıldığında bu sınırlıdır.
Sunulan protokol, canlı beyin mikrogliasını izole etmek için bir strateji sunmaktadır. Bu protokol, mikroglia izolasyonu için P2RY12 protein ekspresyonuna dayanır. Bununla birlikte, P2RY12, mikroglia'da homeostatik bir belirteçtir ve 5XFAD22 gibi hastalık modellerinde aşağı regüle edilebilir. Bu nedenle, bir hastalık modeli hayvanı kullanırken, mikroglia23'ün izolasyonuna yardımcı olmak için TMEM119, CD11b veya CD45 gibi diğer işaretleyici proteinleri seçtiğinizden emin olun. Benzer şekilde, bu protokolü hipokampus ve/veya korteksten izolasyon olarak sunuyoruz. Bu protokol, mikroglia'yı beyaz madde bölgeleri de dahil olmak üzere diğer beyin bölgelerinden izole etmek için çalışacaktır, ancak ilgilenilen bölgelerin büyüklüğüne bağlı olarak yeterli mikroglia elde etmek için birden fazla hayvan gerekebilir.
Sunulan protokol, canlı, beyin mikrogliasını sağlam bir şekilde izole edebilir, ancak izolasyon aşamasında, yanlış yapıldığında hücre verimini azaltabilecek aşağıda açıklanan birkaç adım vardır.
Bu protokol için perfüzyonlar, bağışıklıkla zenginleştirilmiş fragmanda daha yüksek bir mikroglia yüzdesi ile sonuçlanır ve bu da ayıklayıcıdaki süreyi azaltır. Bununla birlikte, perfüzyon gerekli değildir ve gerekirse diğer ötenazi yöntemleri kullanılabilir.
Mikroglia izolasyonu sırasında miyelin tamamen uzaklaştırılmalıdır. Akış sitometreleri, hücrelerin dar borulardan hızlı bir şekilde geçebilmesine dayanır. Viskozitesi ve topaklanma eğilimi nedeniyle miyelin, sitometrelerde sorunlara neden olur ve genellikle hem ekipmana zarar verebilecek hem de numuneyi tahrip edebilecek tıkanmalara neden olarak verimi büyük ölçüde azaltır. Aşağı akışta sorun yaşamamak için bağışıklıkla zenginleştirilmiş parçaların toplanması sırasında tüm miyelini çıkarmaya dikkat edin.
Tüp boyamaya karşı plaka boyama: Bu protokolde, 1.5 mL'lik tüplerde veya 96 oyuklu bir plakada hücreleri boyamak için iki seçenek tanımladık. Her birinin kullanım durumu denemeye bağlıdır; Bununla birlikte, genel olarak, tüp boyama, yanlış yapılırsa hareket hücre kaybı riski taşıdığından, verimi etkileme riski plaka boyamadan daha düşüktür. Her tüp için süpernatanı aspire etmek zaman alıcı olduğu için plaka boyama çok daha hızlıdır. Sabitlemeden önce (sıralama vb. için), verimi en üst düzeye çıkarmak ve kayıp riskini azaltmak için tüp boyama kullanın. Bununla birlikte, HPTM analizi için, hücreler intranükleer boyama için sabitlendikten sonra, pelet daha kararlıdır ve fiske ile kayıp riski azalır.
Süreksiz yoğunluk gradyanının oluşturulması: Katmanlamayı oluştururken, bağışıklıkla zenginleştirilmiş fraksiyonu elde etmek için katmanların uygun şekilde ayarlanması esastır. Katmanlar bozulursa veya karışırsa ve bulanık görünürse, hücreler istenen yerlerine göre sıralanmayacak ve bağışıklıkla zenginleştirilmiş hücre fraksiyonunun elde edilmesinde zorluk yaşanacaktır. Bu meydana gelirse, miyelini çıkarmak için yoğunluk ortamıyla döndürün ve ardından kalan tüm fraksiyonları toplayın, 3 mL FACS tamponu ile 1 mL yoğunluk ortamına seyreltin ve iyice karıştırın (bu, birden fazla tüp gerektirecektir). Fren 0 açıkken 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatanı atın, sadece ~ 300 μL çözelti bırakın. Tüm numuneyi toplayın ve boyayın. Bu, azaltılmış sıralama yüzdeleri ve sitometrede daha fazla zaman harcanmasına neden olacaktır, ancak verim yine de karşılaştırılabilir olabilir.
İzolasyon yöntemini kullanırken, aynı fare beyninden RNA ve HPTM değerlendirmesi için hücre toplayabilmek faydalıdır. Bu durumda, canlı mikrogliaları sıraladıktan sonra, hücreler RNA değerlendirmesine bir kısım tahsis etmek için bölünebilir (iyi bir RNA verimi elde etmek için minimum giriş sayısı 75.000 hücredir) ve daha ileri akış sitometrisi analizi için bir kısım (MFI'nin iyi belirlenmesi için kuyu başına minimum 10.000 hücre). Bu durumda, akış sitometresi sıralaması gereklidir. Bununla birlikte, hücreleri yalnızca HPTM analizi için kullanmayı planlarken, sıralama gerekli değildir ve bağışıklık fraksiyonu P2RY12 antikoru ve HPTM antikoru ile boyanabilir. Sitometre üzerindeki geçit daha sonra, mikroglia içindeki yalnızca HPTM sinyalini analiz etmek için akış sıralamasında olduğu gibi P2RY12+ mikroglia için ayarlanabilir. Sıralamayı ortadan kaldırmak, protokolün daha hızlı ve daha uygun maliyetli olmasını sağlar. Ek olarak, kültürlenmiş hücrelerden HPTM'ler değerlendiriliyorsa, boyama protokolünden başlamak yeterlidir ve Şekil 6'da gösterildiği gibi hücre marker antikorları gerekmez. HPTM değerlendirme protokolü, kültürlenmiş, birincil ve IPSC'den türetilmiş hücreler dahil olmak üzere birçok hücre tipi için kullanılabilir.
Son olarak, mikroglia'nın izolasyon aşağı akışında sadece iki potansiyel kullanımını sunmuş olsak da, ChIP, CUT & Tag ve CUT & RUN gibi epigenetik teknikler de dahil olmak üzere birçok başka kullanım vardır. Spesifik lokuslardaki değişikliklerin karakterize edilmesinin ilgi çekici olduğu genomik epigenetik teknikler söz konusu olduğunda, profillenen herhangi bir mikroglial epigenetik modifikasyonun, enzimatik sindirim gibi izolasyon prosedüründeki herhangi bir adımdan kaynaklanan teknik eserler olmadığından emin olmak için deneylere uyarlanmış kromatin işaretlerinin11 yazarları ve silgileri için spesifik inhibitörler seçin. Kantitatif akış sitometrisi kullanmak gibi epigenetik işaretlerin global seviyelerindeki değişiklikleri değerlendirirken, prosedüre bağlı herhangi bir değişikliğin global düzeyde tespit edilecek kadar büyük olması beklenmez.
Genel olarak, tartışılan yöntemler, akış sitometrisi ile küresel histon modifikasyon seviyelerini ve diğer epigenetik değişiklikleri ölçmek için yeni, tek hücreli bir yöntem sağlar. Bu yöntemin, in vivo LPS'ye yanıt olarak mikrogliadaki arttırıcı belirteç H3K27ac'deki küresel değişiklikleri tespit etmek için yeterince duyarlı olduğunu gösterdik. Bu, LPS28'e yanıt veren güçlendiricilerin dramatik bir şekilde yeniden şekillendiğini gösteren LPS stimülasyonunu takiben H3K27ac'nin önceki ChIP dizilimi ile tutarlıdır. Bu yöntemin uygulamaları, gelişim ve hastalıktaki farklı beyin hücresi tiplerinde küresel epigenetik değişikliklerin incelenmesine izin verecektir.

Epigenetik, altta yatan DNA dizisini değiştirmeden gen ekspresyonunu düzenleyen mekanizmaların incelenmesidir. Gen ekspresyonunun epigenetik regülasyonu hücreler içinde dinamiktir ve çeşitli çevresel uyaranlara hızlı ve koordineli tepkilere izin verebilir. Dinamik düzenleme kısmen, DNA1 tarafından sıkıca sarılmış bir oktamer çekirdeğe monte edilmiş histon proteinlerinden (H2A, H2B, H3, H4) oluşan nükleozom seviyesindeki kromatin yapısındaki değişiklikler nedeniyle meydana gelir. Histon proteinleri ve DNA arasındaki etkileşimler, DNA'nın transkripsiyon mekanizmasına erişilebilirliğini kontrol edebilir, bu da sonuçta gen ekspresyonunu ve kromatin biyolojisinin diğer yönlerini kontrol edebilir2. Histon proteinleri, negatif yüklü DNA omurgası ile elektrostatik etkileşimler oluşturan pozitif yüklü kalıntılara sahip yapılandırılmamış kuyruklara sahiptir. Bu etkileşimler, DNA'nın sıkı bir şekilde paketlenmesine ve DNA erişilebilirliğinin azalmasına neden olur. Histon kuyruklarında histon sonrası translasyonel modifikasyonlar (HPTM'ler) olarak adlandırılan kovalent modifikasyonlar, bu etkileşimleri düzenleyebilir 3,4. En iyi karakterize edilmiş HPTM'lerden bazıları, histon kuyrukları ve DNA arasındaki elektrostatik etkileşimlerin afinitesini değiştirebilen, altta yatan DNA'ya farklı erişilebilirlik ve bu HPTM'leri belirli bölgelerde tanıyan transkripsiyon faktörlerinin işe alınmasına neden olan histon kuyruğu asetilasyonu ve metilasyonunu içerir. HPTM'ler, HPTM'leri kaldıran okuyucular, biriktiren yazarlar ve silgiler olarak adlandırılan üç önemli enzim sınıfı tarafından düzenlenir. Bu nedenle, okuyucu, yazıcı veya silgi enzimlerinin işe alınması veya çözülmesi, nihayetinde HPTM'lerin manzarasını değiştirebilir ve kromatinin yapısını ve işlevini yönetebilir, bu da hücresel biyolojiyi ve işlevi anlamak için bunların düzenlenmesini ve okunmasını gerekli kılar 3,4.
Merkezi sinir sistemindeki (CNS) hücreler, çevresel uyaranlara uyum sağlamak için transkriptomlarını değiştirdikleri için epigenetik olarak esnektir. Biriken kanıtlar, DNA metilasyonu, kodlamayan RNA'lar ve HPTM'ler gibi epigenomdaki değişikliklerin hafıza oluşumunda ve sinaptik fonksiyonda önemli bir rol oynadığını göstermektedir5. İlgili okuyucuların, yazarların veya silgilerin manipülasyonu yoluyla HPTM dinamiklerini bozmak, ilişkisel öğrenmeyi ve uzun vadeli güçlendirmeyi engelleyebilir veya geliştirebilir 6,7,8. CNS'nin yerleşik bağışıklık hücresi olan mikroglia, epigenomlarındaki dinamik değişiklikler yoluyla bağışıklık stimülasyonuna yanıt olarak transkriptomlarını hızla düzenler 9,10,11. Çalışmalar, mikroglia'nın epigenomunun ve transkriptomunun, beyin ortamından çıkarıldıktan sonra kültür ortamında sadece birkaç saat sonra değiştiğini gösterdiğinden, yerel beyin ortamlarına bu yüksek düzeyde adaptasyon, onları izole bir bağlamda incelemeyi zorlaştırmaktadır11. Ek olarak, mikroglia beyin hücrelerinin sadece %10'unu oluşturduğundan, tüm doku seviyesindeki değişiklikleri inceleyen ölçümler duyarlılık ve özgüllükten yoksundur12,13. Sonuç olarak, HPTM seviyeleri, ex vivo gibi epigenetik değişiklikleri incelemek için mikroglia'nın hızla izole edilmesi gerekir.
HPTM'leri incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında kromatin-immünopresipitasyon dizilemesi (ChIP-seq) ve hedefler altında bölünme ve etiketleme dizilimi (CUT & Tag-seq) bulunur4. Bu teknikler bireysel bir HPTM'ye oldukça spesifik olsa ve belirli bir genomik bağlamda HPTM'lerin varlığını bildirebilse de, tek bir deneyde birçok olası HPTM'den yalnızca birini inceleyebilirler11,14 Bu nedenle, önemli bir zaman ve para yatırımı gerektiren bu tür deneylere geçmeden önce, küresel olarak yapılan değişiklikleri inceleyerek daha fazla araştırma için potansiyel olarak ilginç HPTM'lerin listesini daraltmak son derece değerlidir. HPTM seviyeleri. Global HPTM düzeylerini incelemek için iki ana yaklaşım immünohistokimya ve western blot analizidir, ancak her iki yaklaşım da yalnızca yarı kantitatiftir, düşük verimlidir ve çok sayıda doku kesiti veya izole hücre gerektirir 15,16. Böylece, global HPTM düzeylerini hızlı ve tek hücre düzeyinde incelemek için kullanılabilecek son derece hassas, kantitatif bir yöntem geliştirmeyi amaçladık.
Sunulan protokol, intranükleer akış sitometrisi kullanılarak küresel HPTM seviyelerinin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Kanser hücrelerinde yapılan önceki çalışmalar, küresel düzeylerin klinik bir bakış açısıyla incelenmesinin önemini haklı çıkarmıştır17,18. İlgilenilen spesifik HPTM'lerin genomik konumunu değerlendirmeden önce global düzeyleri bir tarama yöntemi olarak kullanan çalışmalar da yaygındır19,20. Mikroglia için, düşük hücre verimi nedeniyle izolasyonu takiben küresel seviyeleri değerlendirmek zordur; Pan ve arkadaşları, western blot19 ile protein seviyesinin saptanmasını sağlamak için üç hayvandan alınan mikrogliaların bir araya getirildiği izole mikrogliadan küresel HPTM seviyelerini sunar. Protokolümüzü kullanarak, çok daha düşük hücre girdileri ile küresel değişiklikleri tespit edebiliyoruz, hayvan başına birden fazla işaretin taranmasını sağlıyoruz ve numuneleri havuzlama ihtiyacını ortadan kaldırıyoruz.
Burada, izole mikroglialarda kantitatif intranükleer akış sitometrisi yoluyla HPTM seviyelerini hızlı bir şekilde tespit etmek için bir protokol açıklıyoruz. Kısalık uğruna özellikle HPTM miktar tayinine odaklanırken, bu protokol okuyucu, yazar ve silgi enzimlerinin küresel seviyelerini ölçmek için aynı şekilde kullanılabilir. Protokol iki kısımda sunulur: birincisi, mikroglia için izolasyon yöntemi ve ikincisi, HPTM seviyelerini belirlemek için akış sitometrisi tabanlı yöntem. İzolasyon yöntemi, aynı numuneden gen ekspresyonu ve HPTM seviyelerinin değerlendirilmesine izin veren hem RNA izolasyonu hem de HPTM seviyesi değerlendirmesi için kullanılabilecek hücreler verir. Ek olarak, HPTM değerlendirme yöntemi, protokolde belirtildiği gibi diğer hücre tiplerinde de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Santrifüj Tüpleri, Polipropilen, Steril ve nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Şeffaf İşlem Görmemiş Plakalar</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyu Şeffaf Polistiren Mikroplaka, şeffaf yuvarlak alt, işlenmemiş yüzey</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Asetil Histon 3 K9 (C5B11)</td> <td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9649S</td><td>Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>Asetil Histon H4 K8 (2594)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>2594S</td><td>Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>Asetil-Histon H3 K27 (D5E4)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>8173S</td><td>Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>Asetil-Histon H3 Lys27 (MA523516)</td><td>İnvitrojen</td><td>MA523516</td><td>Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>Aktinomisin D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>Anizomisin</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3 (tri metil K4)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-Laktil-Histon H4 (Lys 12) Tavşan mAb</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1411RM</td><td>Seyreltme: 1:250</td></tr><tr><td>Anti-L-Laktillisin Tavşan pAb</td><td>PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>Seyreltme: 1:250</td></tr><tr><td>Apc anti-P2RY12 Antikoru, Klon: S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>Sito-Son Tampon</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsülfoksit, steril</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti Fare AlexaFluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-546-150</td><td>Seyreltme: 1:500</td></tr><tr><td>Eşek Anti Tavşan AlexaFluor488</td><td>ABklonal</td><td>AS035</td><td>Seyreltme: 1:500</td></tr><tr><td>Eşek Anti Tavşan AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Seyreltme: 1:500</td></tr><tr><td>Eşek Anti Tavşan Parlak Menekşe 421</td><td>BioLegend</td><td>406410</td><td>Seyreltme: 1:500</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tek Kullanımlık Dereceli Transfer Pipetleri</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tek Kullanımlık PES Filtre Ünitesi, 250mL&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>H3K18ac Poliklonal Antikor</td><td>İnvitrojen</td><td>720095</td><td>Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X), kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yok</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yok</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>Histon 3 Trimetil K27 (ab6002)</td> <td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>KONTES Dounce Doku Öğütücüler 125mm 7mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Laktil-Histon H3 (Lys 18) Tavşan mAb</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>Seyreltme: 1:250</td></tr><tr><td>Lipopolisakarit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads Kompanzasyon Boncukları</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>PDS Kiti, Papain Flakon - Worthington Biyokimyasal</td><td>Cedarlane</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı</td><td>VWR</td><td></td><td></td>RC57004</tr><tr><td>QIAparçalayıcı</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Gökkuşağı Floresan Parçacıkları, 1 tepe (3.0-3.4 uM - Orta Aralıklı Yoğunluk</td><td>BioLegend</td><td>422905</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İçermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mL</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Mikro Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı Yuvarlak Alt Polipropilen Tüpler, 5 mL</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>New England Biolabs</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Nükleer Transkripsiyon Faktörü Tampon Seti</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS (anti-fare CD16/32) Antikor</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Tamir Edilebilir Canlılık Kiti</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

İzole fare beyni mikrogliasında İntranükleer akış sitometrisi kullanılarak global histon post translasyonel modifikasyonların miktar tayini

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gen ekspresyon kontrolü, kısmen, histon kuyruklarına posttranslasyonel modifikasyonların eklenmesi ve çıkarılması dahil olmak üzere kromatin yapısındaki modifikasyonlarla gerçekleşir. Histon translasyon sonrası modifikasyonlar (HPTM'ler), gen ekspresyonunu veya baskılanmasını kolaylaştırabilir. Örneğin, histon kuyruğu lizin kalıntılarının asetilasyonu, pozitif yükü nötralize eder ve kuyruk ile negatif yüklü DNA arasındaki etkileşimleri azaltır. Histon kuyruk-DNA etkileşimlerindeki azalma, altta yatan DNA'nın erişilebilirliğinin artmasına neden olarak transkripsiyon faktörü erişiminin artmasına izin verir. Asetilasyon işareti ayrıca bromodomain içeren transkripsiyonel aktivatörler için bir tanıma bölgesi görevi görür ve birlikte gelişmiş gen ekspresyonu ile sonuçlanır. Histon işaretleri, hücre farklılaşması sırasında ve farklı hücresel ortamlara ve uyaranlara yanıt olarak dinamik olarak düzenlenebilir. Yeni nesil dizileme yaklaşımları, bireysel histon modifikasyonları için genomik konumları karakterize etmeye başlamış olsa da, aynı anda sadece bir modifikasyon incelenebilir. Yüzlerce farklı HPTM olduğu göz önüne alındığında, daha kapsamlı genom dizileme yaklaşımları gerçekleştirmeden önce histon modifikasyonlarını taramak için kullanılabilecek yüksek verimli, nicel bir küresel HPTM ölçüsü geliştirdik. Bu protokol, global HPTM'leri tespit etmek için akış sitometrisi tabanlı bir yöntemi tanımlar ve kültürdeki hücreler veya in vivo dokulardan izole edilmiş hücreler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bakteri kaynaklı bir bağışıklık uyaranına (lipopolisakkarit) yanıt olarak HPTM'lerdeki küresel kaymaları tespit etmek için testin duyarlılığını göstermek için izole fare beyni mikrogliasından örnek veriler sunuyoruz. Bu protokol, HPTM'lerin hızlı ve kantitatif değerlendirmesine izin verir ve bir antikor tarafından tespit edilebilen herhangi bir transkripsiyonel veya epigenetik düzenleyiciye uygulanabilir.

Yetişkin fareler transkardiyal olarak perfüze edildi ve mikroglia izolasyonu için sakfiye edildi. Mikroglia buz üzerinde izole edildi ve P2RY12-APC ve violet 525 canlı ölü antikorları ile boyandı. P2RY12 pozitif, violet 525 canlı ölü lekesi için negatif olduğu belirlenen hücreler canlı mikroglia olarak sınıflandırıldı. Diseke bir fare beyninden ortalama mikroglia verimi 1.28 x 105 ± 0.05 idi (ortalama ± standart hata ortalaması (SEM), N = 100). Dişi (1.25 x 105 ± 0.09 [ortalama ± SEM, N=46]) ve erkek (1.32 x 105 ± 0.07 [ortalama ± SEM, N=54]) farelerden mikroglia verimi açısından bir fark yoktur (t(98)=0.6365, p=0.526). Belirli beyin bölgelerinden izole edilirken, fare kortekslerinden ortalama mikroglia verimi 8.3 x 104 ± 0.08 (ortalama ± SEM, N = 15) ve fare hipokampusundan 4.1 x 104 ± 0.02'dir (ortalama ± SEM, N = 16). Beklendiği gibi, her beyin bölgesinden mikroglia veriminde önemli bir fark vardır (F(2, 128)=25.25, P&lt;0.0001). Mikroglia izolasyonunu takiben, düşük girdili bir RNA izolasyon kiti kullanılarak izole edilen hücrelerden RNA ekstrakte edildi. Tutarlı bir şekilde RNA bütünlük skoru (RIN) 9.0'ın üzerindeydi (9.62 ± 0.05) ve hücre başına ortalama RNA verimi 0.25 ± 0.01 pg idi (ortalama ± SEM, N = 32; Ek Dosya S2).
Yetişkin farelere, kurban edilmeden 24 saat önce intraperitoneal olarak 1 mg / kg lipopolisakkarit (LPS) enjekte edildi. Fareler, HBSS ile transkardiyal olarak perfüze edildi ve mikroglia, tarif edilen protokole göre tüm beyinden izole edildi (Şekil 5A). Her leke için, her bir antikor paneline 20.000-30.000 hücre tahsis edildi. Histon 3 lizin 27 asetilasyonunun (H3K27Ac) global seviyeleri, akış sitometrisi ile izole mikrogliada değerlendirildi. Erkek ve dişi fareler için, MFI cinsiyet içinde normalleştirildiğinde LPS tedavisi H3K27Ac'de artışa neden oldu (t (6) = 9.676, p &lt; 0.0001; Şekil 5B). Boyanmış hücreler için histogramlar incelendiğinde, popülasyonlar benzer varyasyonlarla normal olarak dağılmış olarak kalır; bununla birlikte, hücreler MFI'de artışa neden olan artan floresansa kaymıştır (Şekil 5C). Aynı tedavide H3K9Ac incelendiğinde de benzer bir artış vardır (t(6)=7.299, p=0.0003; Şekil 5D,E), ancak LPS'nin H3K9Ac sinyalinin PBS'sine göre kat değişimi, H3K27Ac sinyalinden daha azdır.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> Şekil 5: İzole mikrogliadaki histon asetilasyonundaki global değişiklikler. (A) Fareler, kurban edilmeden 24 saat önce intraperitoneal olarak fosfat tamponlu salin (PBS) veya 1 mg / kg lipopolisakkarit (LPS) enjekte edilir. Mikroglia, immün kuvvetle zenginleştirilmiş fraksiyondan toplanır ve akış sitometrisi ve global histon translasyon sonrası modifikasyon değerlendirmesi için sabitlenir. Medyan floresan yoğunluğu, protein ekspresyonu için bir vekil olarak değerlendirilir. BioRender.com ile oluşturuldu. (B) LPS tedavisine yanıt olarak küresel H3K27Ac seviyeleri artmıştır. Deney ve cinsiyet içinde normalleştirilmiş PBS'ye katlama değişikliği. Eşlenmemiş iki kuyruklu t-testi, t(6)=9.676, p&lt;0.0001. Çubuk grafik, ortalama ± SEM'i gösterir. N = 8 hayvan; 2 bağımsız deneyde koşul başına 2. (C) H3K27Ac floresan yoğunluğunun kaymasını gösteren örnek histogramlar. Modal, PBS enjekte edilen ve LPS enjekte edilen farelerden alınan histogramları gösterir. (D) H3K9Ac floresan yoğunluğunun kaymasını gösteren örnek histogramlar. Modal, PBS enjekte edilen ve LPS enjekte edilen farelerden alınan histogramları gösterir. (E) LPS tedavisine yanıt olarak küresel H3K9Ac seviyeleri artmıştır. Deney ve cinsiyet içinde normalleştirilmiş PBS'ye katlama değişikliği. Eşlenmemiş iki kuyruklu t-testi, t(6)=7.299, p=0.0003. Çubuk grafik, ortalama ± SEM'i gösterir. N = 8 hayvan; 2 bağımsız deneyde koşul başına 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Açıklanan yöntemin, global histon modifikasyon ölçümü için daha önce kullanılan diğer yöntemlerle karşılaştırılabilir olduğunu doğrulamak için, karşılaştırmalı bir araç olarak immunoblot'u kullanmayı amaçladık. Bununla birlikte, izole edilmiş mikrogliadan elde edilen verim, makul bir değerlendirme sağlamak için çok düşüktür. Bu nedenle, hücre içi akış sitometrisi yöntemini Western blot (WB) ile karşılaştırmak için kültürlenmiş BV2 hücreleri kullandık. BV2 hücreleri, 37 ° C,% 5 CO2'de tam ortamda (DMEMF12,% 10 FBS, 1x penisilin / streptamisin ve 1x L-glutamin) büyütüldü. Hücreler% 0.25 tripsin-EDTA ile pasajlandı ve 250.000 hücre / kuyu yoğunluğunda kaplandı ve indirgenmiş serum ortamında (DMEM F12,% 2 FBS, 1x penisilin / streptamisin ve 1x L-glutamin) muamele edildi ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 12 saat iyileşmeye bırakıldı. Hücreler, yukarıda tarif edildiği gibi fiksasyondan veya bir WB lizis tamponu ile lizisten önce 24 saat boyunca 25 ng / mL LPS ile muamele edildi. H3K27Ac'nin sinyali, WB için bir yükleme kontrolü olarak kullanılan GAPDH ile her iki yöntemle de gerçekleştirildi. Her grup için PBS kontrolüne kıyasla normalleştirilmiş floresan yoğunluğunun analizi belirlendi (Şekil 6A). WB ile normalize H3K27Ac sinyalindeki değişiklik incelendiğinde, eşlenmemiş t-testi ile anlamlı olduğu belirlenenH2Okontrolüne göre LPS ile tedavi edilen durumda 1.527 kat artış vardı (t=3.024, df=5; p=0.0293). Akış sitometrisi kullanılarak değişiklik incelendiğinde, LPS ile tedavi edilen durumda anlamlı olduğu belirlenen 1.482 kat artış vardı (t = 7.843, df = 10; p&lt;0.0001). Yöntemlerin karşılaştırılmasında 2 yönlü varyans analizi (F(1,15)=45.21,p&lt;0.0001) tedavinin anlamlı bir etkisinin olduğu, ancak yöntemin (F(1,15)=0.05545, p=0.8697) veya etkileşimin (F(1,15)=0.02785, p=0.8697) anlamlı bir etkisinin olmadığı belirlendi. Ek olarak, 2 yönlü ANOVA'nın LPS tedavisinin (F(1,7)=0.02170,p=0.8870), yöntemin (F(1,7)=0.01191, p=0.9162) veya etkileşimin (F(1,7=0.01191, p=0.9162; Şekil 6B). Bu veriler için örnek lekeler ve histogram kaymaları da gösterilmiştir (Şekil 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> Şekil 6: Akış sitometrisi ve western blot arasındaki global histon modifikasyon değişikliğinin nicelleştirilmesi için yöntem karşılaştırması. (A) BV2 hücreleri, analizden önce 24 saat boyunca 25 ng / mL lipopolisakkarit (LPS) veyaH2Oile muamele edilir. H3K27Ac'nin floresan yoğunluğu, hem akış sitometrisi hem de western blot için araç kontrolü, fosfat tamponlu salin (PBS) kat değişikliği olarak tasvir edilir. 2 yönlü varyans analizi (F(1,15)=45.21, p&lt;0.0001) anlamlı etki gösterirken, yöntem (F(1,15)=0.05545, p=0.8697) veya etkileşim (F(1,15)=0.02785, p=0.8697) anlamlı etki göstermedi. Kalıntılar için Tukey'in çoklu hipotez testi düzeltmesi uygulanmıştır. * 0.0332, ** 0.0021 sunar. (B) Histon H3 için floresan yoğunluğu, hem akış sitometrisi hem de western blot için PBS'ye kat değişikliği olarak tasvir edilir. 2 yönlü varyans analizi, LPS tedavisinin (F(1,7)=0.02170, p=0.8870) veya yöntemin (F(1,7)=0.01191, p=0.9162) veya etkileşimin (F(1,7=0.01191, p=0.9162) anlamlı bir etkisini göstermedi. (C) Örnek lekeler ve (D) akış sitometrisi kaymaları tasvir edilmiştir. Histogram boyutu, mod floresan yoğunluğunda bulunan hücre sayısına bağlı olarak yüzde olarak normalleştirilir. Çubuk grafik, ortalama SEM'i gösterir. n=2 bağımsız deney, deney başına koşul başına 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hep birlikte, bu sonuçlar, bu tekniğin izole mikrogliadaki küresel HPTM seviyelerini kantitatif olarak değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Ek olarak, yöntemin önceki tekniklerle karşılaştırılabilir olduğu, ancak çok daha düşük hücre girdileri gerektirdiği gösterilmiştir. Ek olarak, gösterilmemiş olsa da, uygun kompanzasyonla, mevcut teknik, farklı HPTM'leri değerlendiren aynı panelde birden fazla antikorla kullanılabilir.
Ek dosya S1: Örnek analiz dosyaları. Bu dosya, bir wsp analiz dosyası ve lekesiz, P2RY12FMO, 568FMO, iki PBS ile tedavi edilmiş hayvan ve H3K27Ac ile boyanmış iki LPS ile muamele edilmiş hayvan dahil olmak üzere 7 fcs dosyası içerir. Bu dosyanın amacı, başarılı bir deneyin nasıl göründüğünü gösterebilecek bir deney üzerindeki analizi ve geçitleri göstermektir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya S2: İzolasyon verileri. Dahil edilen dosya, açıklanan protokolden mikroglia ve RNA verimini içeren mikroglia sıralaması sonrası ilgili verileri içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>GÜVENLIKLI NÜFUS</td>
			<td>Ebeveyn Sıklığı</td>
			<td>Toplam Frekans</td>
			<td>Saymak</td>
		</tr><tr><td>S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2&gt;S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ &gt; APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Örnek örnek soy tablosu, doğru protein tespiti için gereken yüzdeyi ve olay sayılarını gösterir.

Bu çalışma, izole beyin mikrogliasında intranükleer akış sitometrisi kullanılarak küresel histon modifikasyonlarının ölçülmesi için bir protokolü açıklamaktadır. Çalışma ayrıca veri toplama için kullanılan mikroglia izolasyon protokolünü de içermektedir.

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Araştırmamız, beyindeki gen ekspresyonunu kontrol eden temel düzenleyici mekanizmaları anlamayı amaçlamaktadır ve özellikle bu mekanizmaların bozulmasının nörogelişimsel ve nöropsikiyatrik koşullara nasıl katkıda bulunduğunu anlamakla ilgileniyoruz. Genetik ve çevresel risk faktörlerinin hücresel işlevi değiştirmek ve davranışsal bozukluklar üretmek için nasıl bir araya geldiğini anlamaya odaklanıyoruz. Bu protokol, izole mikrogliadaki histon modifikasyonlarının yüksek verimli taranması için yöntemler içerir ve yüksek verimli dizileme ve fonksiyonel takip çalışmalarına başlamadan önce düzinelerce farklı epigenetik modifikasyonu taramamıza olanak tanır.Protokolümüz, Batı komplosuna benzer küresel tarih değişikliklerinin ölçümlerini sağlar. Bununla birlikte, tekniğimiz hem daha hızlıdır, hem daha az giriş hücresi gerektirir, hem daha niceldir hem de çoğullanabilir.

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, embriyonik fare beyninden birincil hipokampal nöronları kültleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Kültürlü nöronların hücre dışı yüzeyinde majör histocompatibility complex class I'in ekspresyolü daha sonra akış sitometrik analizi ile değerlendirilir.

Birincil Murine Hipokampal Nöronlarda Majör Histocompatibility Complex Class I'in Akış Sitometrisi ile İfadesinin Değerlendirilmesi

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Bu protokol, erken doğum sonrası fare beyinlerinin beyinciklerindeki mikroglial hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini birleştirir. Mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarmak ve serebellar gelişim ve hastalıktaki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için enzimatik ayrışma, Percoll santrifüjleme ve immün boyama kullanır.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi

Akış sitometrisi, spesifik hücre popülasyonlarının izole edilmesine ve incelenmesine olanak tanıyan güçlü bir araçtır. Bu protokol, neonatal transgenik farelerin koklear dokularından LacZ eksprese eden hücrelerin izole edilme adımlarını açıklamaktadır. Dissosiye edilmiş koklear hücreler, akış sitometrisi ile ayrılmadan önce β-galaktosidazın floresan konjuge substratları kullanılarak işaretlenmiştir.

Yalıtımlı LacZ ifade Sitometrisi kullanarak Fare İç Kulak Dokular Hücreler

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Fare beyninin damar bölmesinin saflaştırılmasına izin veren bir protokol tarif ediyoruz. İzole beyin damarları, sıkı bağlantılarla bağlanmış ve sürekli bir bazal lamina, perisitler, vasküler düz kas hücreleri ve ayrıca perivasküler astroglial membranlarla çevrili endotel hücrelerini içerir.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Kantitatif analiz fare siyatik sinir içinde hücre içeriğinin doku kıtlığı nedeniyle zordur. Bu iletişim kuralı doku sindirim ve sinir bağışıklık hücre gruplarından bireysel farelerin Akış Sitometresi Analizi için yeterli hücre sağlar hazırlık için bir yöntemi açıklar.

Bağışıklık hücreleri tek siyatik sinirleri ve Dorsal kök gangliyon üzerinden tek bir fare kullanarak Akış Sitometresi Analizi

Biz nöronlar, makrofajlar ve microglia larva Zebra balığı beyin fizyolojik ve patolojik şartlar altında gelen izole etmek için bir protokol mevcut. Yalıtım, RNA gen ifade profillerini analiz etmek için bu hücrelerden elde edilir. Bu iletişim kuralı için yüksek kaliteli RNA koleksiyonu aşağı akım analizi qPCR ve transcriptomics gibi gerçekleştirmek için izin verir.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

Bu makalenin amacı, bir kapsamlı, sistematik rehber histon H3 ve H4 etkili arınma ve miktar acetylated histon kalıntılarının sağlamaktır.

Arıtma H3 ve H4 histon proteinleri ve Acetylated histon işaretleri hücrelerinde ve beyin dokusu miktar

Öğrenin, fare beyninden izole edilen mikroglia hücrelerinde intranükleer akış sitometrisi ile global histon modifikasyonlarını nicel olarak nasıl tayin edebilirsiniz. Bu yüksek verimli yöntem, nörogelişimsel bozuklukların epigenetik mekanizmalarını hızla taramanıza olanak tanır.

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini (Video) | JoVE Journal

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Daha fazla video keşfet