Name: Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Keşfedin, fare kalplerinde çift boyutlu optik haritalama ile katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardinin elektrofizyolojik özelliklerini. Bu yöntem, aritmi mekanizmalarını anlamak için transmembran voltaj ve kalsiyum sinyallerini eşzamanlı kaydetmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81700308'dan XO'ya ve 31871181'dan ML'ye ve 82270334'dan XT'ye), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (CN) (2021YJ0206'dan XO'ya, 23ZYZYTS0433 ve 2022YFS0607'den XT'ye ve 2022NSFSC1602'den TC'ye) ve Tıbbi Kaynakların Kimyası ve Moleküler Mühendisliği için Devlet Anahtar Laboratuvarı (Guangxi Normal Üniversitesi) (CMEMR2017-B08'den XO'ya), MRC (ML02647, G1002082, ML için G10031871181), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford (ML) hibeleri.

Deneyler için 10-14 haftalık erkek vahşi tip fareler veya 20-25 g ağırlığındaki RyR2-R2474S/+ fareler (C57BL/6 arka plan) kullanılmıştır. Tüm prosedürler, Southwest Medical University, Sichuan, Çin'in hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (onay NO:20160930) tarafından, kurumun faaliyet gösterdiği ulusal yönergelere uygun olarak onaylanmıştır.
1. Hazırlık
<ol><li>Stok çözümleri<ol><li>Blebbistatin stok çözeltisi: 10 mM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 2.924 mg (-) blebbistatin tozu içeren orijinal şişeye 1 mL %100 dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.</li>
		<li>Voltaj göstergesi RH237 stok çözeltisi: 2,01 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için orijinal şişeye 1 mg RH237 tozu ile 1 mL %100 DMSO ekleyin.</li>
		<li>Kalsiyum indikatörü Rhod-2 stok çözeltisi: 0.89 mM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 1 mg Rhod-2 tozuna 1 mL %100 DMSO ekleyin.</li>
		<li>Pluronic F127 stok çözeltisi: %20 w/v (0.66 mM) konsantrasyona ulaşmak için 200 mg Pluronic F127'ye 1 mL %100 DMSO ekleyin.</li>
		<li>Tekrarlanan donma ve çözülmeyi önlemek için stok çözeltilerini 21-51 μL'de (21 μL RH237, 31 μL Rhod-2 ve 51 μL blebbistatin) 200 μL'lik PCR tüplerine ayırın. Daha sonra solüsyonları alüminyum folyo ile sarın ve ortam sıcaklığında karanlık bir odaya konulan Pluronic F127 stok solüsyonu hariç -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfüzyon çözeltisi<ol><li>Krebs çözeltisi (mM cinsinden): 1 L Krebs çözeltisi hazırlayın (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 ve glikoz 10).</li>
		<li>Çözeltiyi 0.22 μm aseptik iğneli filtre ile filtreleyin ve %95 O2/5CO2 ile oksijenlendirin.</li>
		<li>40 mL Krebs çözeltisini 50 mL'lik bir santrifüj tüpe alın ve takip eden kalp izolasyonu için 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Langendorff perfüzyon sistemi ve optik haritalama cihazı<ol><li>Langendorff perfüzyon sistemini kurun.<ol><li>Su banyosunu açın ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.</li>
			<li>Langendorff perfüzyon sistemini 1 L deiyonize su ile yıkayın.</li>
			<li>Çözeltiyi giriş kanalından perfüze edin ve çıkış hızını 3.5-4 mL/dk'ya ayarlayın. Daha sonra perfüzatı 37 °C'de O2 / CO2 (% 95 /% 5) gazı ile oksijenlendirin. NOT: Perfüzyon sisteminde kabarcık oluşmasına asla izin verilmez.</li>
		</ol></li>
		<li>Optik haritalama sistemini hazırlayın.<ol><li>Elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz (EMCCD) kamerayı (512 × 512 piksel), lensi (40x büyütme), dalga boyu ayırıcı ışık yayan diyotları (LED'ler), elektrokardiyogram (EKG) monitörünü ve stimülasyon elektrodunu kurun (Şekil 1).</li>
			<li>Lens ile kalp pozisyonu arasındaki uygun çalışma mesafesini ayarlayın.</li>
			<li>Uyarma ışığı üretmek için 530 nm'lik bir dalga boyu sağlayan, eşit aydınlatma için termostatik banyonun diyagonal konumuna iki LED yerleştirin. LED'ler için bant dışı ışığı ortadan kaldırmak için bir ET525/50 püskürtme kaplı filtre kullanın.</li>
			<li>Hedef yüzeyin eşit bir karesini elde etmek için tutamak anahtarını ayarlayın, voltaj ve kalsiyum görüntülerinin alıcı arayüzde yeterince görünmesini sağlayın.</li>
			<li>Voltaj veya kalsiyum sinyallerinin sızmasını önlemek için lensin açıklığını maksimum çapa çevirin.</li>
			<li>Kamera merceğini, termostatik banyoya ince bir çalışma mesafesi sağladığı için uygun bir yüksekliğe ayarlayın, çoğunlukla 10 cm kullanılır.</li>
			<li>-50 °C'de sabit örnekleme sıcaklığı için kamerayı açın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Prosedürler
<ol><li>Fare kalbi hasadı, kanülasyon ve perfüzyon<ol><li>Acı ve ağrı refleksini en aza indirmek ve kan pıhtısı oluşumunu önlemek için hayvanlara intraperitoneal olarak avertin solüsyonu (%1.2, 0.5-0.8 mL) ve heparin (200 ünite) enjekte edilir. 15 dakika sonra hayvanları servikal çıkık ile kurban edin.</li>
		<li>Göğsü makasla açın, kalbi dikkatlice toplayın ve metabolizmayı yavaşlatmak ve kalbi korumak için soğuk Krebs çözeltisine (4 °C,% 95 O 2,% 5 CO2) yerleştirin.</li>
		<li>Aortun çevre dokusunu çıkarın, özel yapım bir kanül iğnesi (dış çap: 0,8 mm, iç çap: 0,6 mm, uzunluk: 27 mm) kullanarak aortu kanül edin ve 4-0 ipek sütür ile sabitleyin.</li>
		<li>Kalbi Langendorff sistemi ile 3,5-4,0 mL/dk sabit hızda perfüze edin ve sıcaklığı 37 ± 1 °C'de tutun. NOT: Sonraki tüm prosedürler bu durumda gerçekleştirilir.</li>
		<li>Aşırı ön yüklemeyi önlemek için haznedeki çözelti tıkanıklığını gidermek için sol ventriküle küçük bir plastik tüp (0,7 mm çapında, 20 mm uzunluğunda) yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Uyarma-büzülme ve çift boya yükleme bağlayıcısı<ol><li>Banyodaki perfüzata iki uç koyun, EKG amplifikatör kutusunun ve elektrik stimülasyon kontrolörünün güçlerini açın ve ardından referans verilen EKG yazılımını başlatın ve EKG'yi sürekli izleyin.</li>
		<li>Kalp kararlı bir duruma ulaştığında (kalp ~ 400 bpm'de ritmik olarak atıyor) karanlıkta sonraki adımları gerçekleştirin.</li>
		<li>10 μM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 50 μL 10 mM blebbistatin stok çözeltisini 50 mL Krebs çözeltisi ile karıştırın. Blebbistatin-Krebs solüsyon karışımını, eksitasyondan kasılmayı ayırmak ve çekim sırasında kasılma artefaktlarını önlemek için 10 dakika boyunca kalbe sürekli olarak perfüze edin.</li>
		<li>Kalp kasılmasının tamamen durup durmadığını kontrol etmek için kırmızı bir el feneri kullanın, çünkü kasılma boya yükleme kalitesini etkileyecektir.</li>
		<li>Uyarma-büzülmeyi ayırdıktan sonra, 0.267 μM Rhod-2 ve 0.198 μM Pluronic F127'nin nihai konsantrasyonlarını elde etmek için 15 μL Rhod-2 stok çözeltisini 15 μL Pluronic F127 stok çözeltisi ile 50 mL Krebs çözeltisinde karıştırın. Ardından, Langendorff perfüzyon sisteminde 15 dakika boyunca Rhod-2 çalışma solüsyonu ile kalbi sürekli olarak perfüze edin.</li>
		<li>Hücre içi kalsiyum boya yüklemesi sırasında oksijen kaynağını koruyun. Pluronic F127'de kabarcıklar kolayca oluştuğundan, koronerlerin gaz embolizasyonunu önlemek için perfüzyon sistemine bir kabarcık tutucu yerleştirin.</li>
		<li>0.402 μM'de nihai konsantrasyona ulaşmak için 10 μL RH237 stok çözeltisini 50 mL perfüzat içine seyreltin ve 10 dakika boyunca yükleme yapın.</li>
		<li>Çift boya yüklemesinin sonunda, hem voltaj hem de kalsiyum sinyallerinin analiz için yeterli olduğundan emin olmak için bir dizi fotoğraf çekin (iki sinyal arasında etkileşim yok).</li>
	</ol></li>
	<li>Optik haritalama ve aritmi indüksiyonu NOT: Optik haritalama, kasılma kesildikten ve uygun bir boya yüklemesinden sonra başlar ve kalp, yukarıda 2.1 (4)'te açıklanan adımlarda olduğu gibi ardışık olarak perfüze edilir.<ol><li>Uyarma ışıkları için iki LED'i açın ve yoğunluklarını uygun bir aralıkta ayarlayın (aydınlatma ve nispeten basit çekim için yeterince güçlü, ancak aşırı pozlama için çok sağlam değil).</li>
		<li>Kalbi algılama cihazının altına koyun, iki LED'in yeterli aydınlatması altında olduğundan emin olun ve ışık noktası çapını 2 cm'ye ayarlayın.</li>
		<li>Lensten kalbe olan çalışma mesafesini 10 cm'ye ayarlayarak yaklaşık 500 Hz'lik bir örnekleme hızı ve piksel başına 120 x 120 μm uzamsal çözünürlük elde edin.</li>
		<li>Voltaj ve kalsiyum sinyallerini aynı anda yakalamak için kamerayı dijital olarak kontrol etmek için sinyal örnekleme yazılımını açın.</li>
		<li>Miyopaker alan stimülatörünü başlatın ve Transistör Transistör Mantığında (TTL), her darbe için 2 ms pacing süresinde ve başlangıç yoğunluğu olarak 0.3 V'ta pacing modelini ayarlayın.</li>
		<li>EKG kayıt yazılımı tarafından yönlendirilen kalbin diyastolik voltaj eşiğini test etmek için 30 ardışık 10 Hz S1 uyaranı kullanın. 1:1 yakalama gerçekleşene kadar voltaj genliğini kademeli olarak artırın (EKG monitöründen QRS dalgasını, aksiyon potansiyelini (AP) ve kalsiyum geçişleri (CaT) sinyallerini kontrol edin).</li>
		<li>Voltaj eşiğini belirledikten sonra, sol ventrikül (LV) apeksin (ELVA) epikardiyaline bağlı bir çift platin elektrot ile kalbi diyastolik voltaj eşiğinin 2 katı yoğunlukta hızlandırın.</li>
		<li>Kalsiyum veya aksiyon potansiyeli alternanslarını ve restitüsyon özelliklerini ölçmek için S1S1 protokolünü uygulayın. Kalbi 100 ms'lik temel döngü uzunluğunda art arda hızlandırın, 50 ms'ye ulaşılana kadar her sekansta döngü uzunluğunu 10 ms azaltın. Her bölüm, 2 ms darbe genişliğine sahip 30 ardışık uyaran içerir. Aynı zamanda, stimülasyondan önce optik haritalamaya başlayın (örnekleme süresi ~ 10 sinüs ritmi ve pacing süresini içerir).</li>
		<li>S1S2 uyaran protokolünü kullanarak ventriküler etkili refrakter periyodunu (ERP) ölçmek için, S2 ektopik QRS kompleksini yakalayamayana kadar 2 ms'lik bir adım azaltma ile 60 ms'de birleştirilmiş bir S2 ile 100 ms'lik bir S1S1 pacing döngüsü uzunluğu ile başlayın.</li>
		<li>Aritmi indüksiyonu için, sürekli 50 Hz patlama pacing (50 ms darbe genişliğine sahip 2 sürekli elektrik stimülasyonu) gerçekleştirin ve 2 sn dinlenme aralığından sonra aynı pacing bölümünü gerçekleştirin.</li>
		<li>İlginç bir aritmik EKG dalgası oluştuğunda eşzamanlı optik haritalama kayıtlarının hemen başlayabilmesi için sürekli yüksek frekanslı pacing süresi boyunca EKG kayıtlarını dikkatlice gözlemleyin (çoğu kardiyak aritmi elektriksel pacing ile indüklendiğinden, optik sinyaller önemli kardiyak olayların kaybedilmesi durumunda patlama pacinginden 2-3 saniye önce örneklenir).</li>
		<li>EMCCD kamera kullanılarak görüntü (örnekleme hızı: 500 Hz, piksel boyutu: 64 x 64).</li>
	</ol></li>
	<li>Veri analizi<ol><li>Görüntü yükleme ve sinyal işleme<ol><li>Daha önce açıklanan kurulum ve protokole göre yarı otomatik olarak büyük video veri analizi için görüntüleri görüntü alma yazılımına yüklemek için Klasör Seç ve Görüntüleri Yükle'ye basın15,16.</li>
			<li>Doğru örnekleme parametrelerini ( Piksel Boyutu ve Kare Hızı gibi) girin.</li>
			<li>Manuel girişle görüntü eşiğini ayarlayın ve ilgilendiğiniz bölgeyi (ROI) seçin.</li>
			<li>3 x 3 piksel Gauss uzamsal filtresi, Savitzky-Goaly filtresi ve silindir şapka taban çizgisi düzeltmesi uygulayın.</li>
			<li>Taban çizgisini kaldırmak ve APD80 ve CaTD50 gibi elektrofizyolojik parametreleri hesaplamak için İşlem Görüntüleri'ne basın.</li>
		</ol></li>
		<li>Elektrofizyolojik parametrelerin analizi<ol><li>APD80'in hesaplanması için APD'nin başlama zamanını tepe noktasında ve bitiş noktasını %80 repolarizasyonda (APD80) ayarlayın. Benzer şekilde, CaTD başlangıç zamanı tepe noktası olarak tanımlanır ve son nokta %80 gevşeme olarak tanımlanır.</li>
			<li>İletim hızının (CV) ölçümü, piksel boyutuna ve iki veya daha fazla piksel arasındaki aksiyon potansiyeli iletim süresine bağlıdır. Seçilen tüm piksellerden ortalama hızı hesaplayın - bu, seçilen bölgenin ortalama iletim hızıdır. İletim yönünün net bir görünümü için aynı anda ilgili eşzamanlı haritalar oluşturun. NOT: O'Shea ve ark.15 CV ölçümünü ayrıntılı olarak bildirmiştir.</li>
			<li>Alternanlar ve aritmi analizi için, kalsiyum alternans, alternatif olarak ortaya çıkan sürekli büyük ve küçük bir pik genliği olarak tanımlanır. Frekansa bağlı alternansların (1-A2/A1) şiddetini değerlendirmek için tepe genlik oranını kullanın. Ventriküler taşikardi (VT) gibi karmaşık aritmileri analiz etmek için faz haritaları uygulayın. Rotorlar yer değiştirirken rotorların belirli bir bölgede belirgin bir şekilde görünüp görünmediğine bakın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+handling+and+arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li>
<li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+%28RyR2%29+gene+in+genetically+modified+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li>
<li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Ca2%2B+homeostasis%2C+atrial+arrhythmogenesis%2C+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).</li>
<li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li>
<li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+%28hRyR2%29+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li>
<li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CACNA1C-related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22GeneReviews%22%5BJournal%5D)">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).</li>
<li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li>
<li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+%28CALM3-A103V%29+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%2C+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li>
<li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li>
<li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2%2B+release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li>
<li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na%28%2B%29-Ca%282%2B%29+exchanger%3A+molecular+partners+in+pacemaker+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ElectroMap%3A+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).</li>
<li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool%2C+%28-%29-blebbistatin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li>
<li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li>
<li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314(2021).</li>
<li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmogenesis%3A+a+tale+of+two+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li>
<li>Mal Baudot,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+%CE%B11D+and+T-type+Cav3.1+%CE%B11G+Ca2%2B+channels+disrupts+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge%3A+Modulation+by+p21-activated+kinase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li>
<li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
<li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Deneyimlerimize dayanarak, bir fare kalbinin başarılı bir çift boyutlu optik haritalamasının anahtarları, iyi hazırlanmış bir çözüm ve kalp, boya yüklemesi, en iyi sinyal-gürültü oranının elde edilmesi ve hareket artefaktının azaltılmasını içerir.
Çözeltinin hazırlanması Başarılı bir kalp deneyi için Krebs çözümü şarttır. MgCl 2 ve CaCl2 stok çözeltileri (1 mol/L) su emilimleri göz önünde bulundurularak önceden hazırlanır ve diğer tüm bileşenler saf su...

Kalıtsal kardiyak bozukluk katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi (CPVT), fiziksel aktivite, stres veya katekolamin zorluğunu takiben polimorfik ventriküler taşikardi (PVT) atakları olarak kendini gösterirve potansiyel olarak ölümcül ventriküler fibrilasyona dönüşebilir 1,2,3,4 . 1995 yılında klinik bir sendrom olarak ilk raporunu takip eden son kanıtlar, tümü bu durumda sarkoplazmik retiküler (SR) deposu Ca 2+ salınımında yer alan yedi gende mutasyonları içermiştir: en sık bildirilen RYR2 kodlayan ryR2 kodlayan Ca2+ salım kanalları5,6, FKBP12.67, kardiyak kalsekestrin8, TRDN'yi kodlayan CASQ2 kavşaksal SR proteini triadin 9 ve CALM1 9, CALM2 10 ve CALM3'ü aynı şekilde kodlayan kalmodulin11,12'yi kodlar. Bu genotipik paternler, aritmik olayları SR deposu Ca2 + 12'nin düzensiz patolojik salınımına bağlar.
SR'den spontan Ca 2+ salınımı, Na + / Ca2 + değiştiriciyi (NCX) aktive eden Ca 2+ kıvılcımları veya Ca2+ dalgaları olarak tespit edilebilir. Üç Na + için birCa2+ değiştirici, diyastolik depolarizasyonu hızlandıran ve membran voltajını aksiyon potansiyeli eşiğine (AP) yönlendiren bir içe doğru akım üretir. RyR2 knock-in farelerde, RyR2R4496C'nin sinoatriyal düğümdeki (SAN) artan aktivitesi, diyastol sırasında I Ca, L ve SR Ca2+ tükenmesinin Ca2 + 'ya bağlı azalmasıyla SAN otomatikliğinde beklenmedik bir azalmaya yol açar ve CPVT hastalarında SAN disfonksiyonuna katkıda bulunan hücre altı patofizyolojik değişiklikleri tanımlar13,14. İlgili kardiyomiyosit sitozolik Ca2+ dalgalarının ortaya çıkması, izoproterenol (ISO) dahil olmak üzere katekolamin ile RyR duyarlılığını takiben arka plan sitozolik [Ca2+] artışları takiben daha olasıdır.
Sağlam kardiyak CPVT modellerinde gözlenen ventriküler aritmilerin nedeni olabilecek aksiyon potansiyeli (AP) aktivasyonuna yanıt olarak RyR2 aracılı Ca2+ salınımını takiben Ca2+ sinyalindeki ayrıntılı kinetik değişiklikler, bildirilen RyR2 genotiplerinin tamamı için belirlenmeye devam etmektedir12. Bu makale, izoproterenol mücadelesinden önce ve sonra programlanmış elektrik pacing ile birlikte, murin vahşi tip (WT) ve heterozigot RyR2-R2474S/+ kalplerinde Ca2+ sinyallerinin ve transmembran potansiyellerinin (V m) yüksek verimli haritalanması için enstrümantasyon kurulumunu ve deneysel prosedürü sunmaktadır. Bu protokol, izole fare kalplerinde CPVT hastalığının mekanik çalışması için bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mu; m şırınga filtresi</td><td>Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Şangay, Çin'in tıbbi ekipman fabrikası</td><td>N/A</td><td>Çözeltiyi filtrelemek için</td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpü</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Çin</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pastör pipeti</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. Çin</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Şırınga</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L PCR tüpü</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. Şangay. Çin</td><td>F611541-0010</td><td>Aliquote 50 mL santrifüj tüpünün tekrarlanan donmasını ve çözülmesini önlemek için stok çözümleri&nbsp</td></tr>; <tr><td></td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td><td>CFT011500</td><td>Store Tyrode'un çözümünü 4 &° C'de; Takip kalp izolasyonu için C</td></tr><tr><td>585/40 nm filtre</td><td>Chroma Technology</td><td>N/A</td><td>Kalsiyum sinyali için filtre</td></tr><tr><td>630 nm uzun geçiren filtre</td><td>Chroma Technology</td><td>G15604AJ</td><td>Voltaj sinyali için filtre</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoetanol)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Birleşik Krallık</td><td>T48402-100G</td><td>Acı ve ağrı refleksini en aza indirmek için</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>SLBV5564</td><td>Haritalama sırasında hareket artefaktını ortadan kaldırmak için uyarma-kasılma unkuplörü</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>SLBK1794V</td><td>Tyrode'un çözümü için</td></tr><tr><td>Özel yapım termostatik banyo</td><td>MappingLab, Birleşik Krallık</td><td>TBC-2.1</td><td>Perfüzyon çözeltisinin</td></tr> <tr><td>sıcaklığını korumak içinDimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td> <td>(RNBT7442)</td> <td>Boyalar için çözücü</td></tr><tr><td>Dumont forseps</td><td>Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Şangay, Çin'in tıbbi ekipman fabrikası</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMap yazılımı</td><td>Birmingham Üniversitesi</td><td>N/A</td><td>Elektriksel parametrelerin ölçülmesi</td></tr><tr><td>EMCCD kamera</td><td>Evolve 512 Delta, Fotometri, Tucson, AZ, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>A18G150001</td><td>Optik sinyaller için görüntü elde edin</td></tr><tr><td>ET525/36 püskürtme kaplı filtre</td><td>Chroma Technology</td><td>319106</td><td>Uyarma filtresi</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>SLBT4811V</td><td>Tyrode çözeltisi için</td></tr><tr><td>Heparin Sodyum</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, Çin</td><td>(H51021209)</td><td>Koroner arterde kan pıhtılarını önlemek için</td></tr><tr><td>&nbsp; İris forseps</td><td>Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Şangay, Çin tıbbi ekipman fabrikası</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>HY-B0468 / CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>SLBS5003</td><td>Tyrode'un çözümü için</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Birleşik Krallık</td><td>7355/7356</td><td>Floresan problarının uyarma ışığı</td></tr><tr><td>MacroLED ışık kaynağı</td><td>Cairn Research, Faversham, Birleşik Krallık</td><td>7352</td><td>LED'leri kontrol edin</td></tr><tr><td>Mayo makas</td><td>Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Şangay, Çin'in tıbbi ekipman fabrikası</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td>Optik sinyal örnekleme</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>BCBS6841V</td><td>Tyrode'un çözümü için</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Birleşik Krallık</td><td>M5337</td><td>Elektrik stimülatörünü ve Spike2 yazılımını bağlayın</td></tr><tr><td>MyoPacer EP alan stimülatörü</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>S006152</td><td>Elektrik stimülatörü</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>SLBS2340V</td><td>Tyrode çözümü için</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>BCBW9042</td><td>Tyrode'un çözümü için</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>SLBX3605</td><td>Tyrode'un çözümü için</td></tr><tr><td>NeuroLog System Digitimer</td><td></td><td>NL905-229</td><td>EKG amplifikatörü</td></tr><tr><td>için OmapScope5 MappingLab</td><td>, Birleşik Krallık</td><td>N/A</td><td>Kalsiyum alternans ve aritmi analizi</td></tr><tr><td>Oftalmik makas</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, Çin</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, Birleşik Krallık</td><td>6970</td><td>Ca2+ ve Vm&nbsp; aynı anda algılamak için emisyon ışığını ayırın</td></tr><tr><td>Peristalik pompa</td><td>Daha Uzun Hassas Pompa Co., Ltd., Baoding, Çin, </td><td>BT100-2J</td><td>Çözeltiyi pompalamak için</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>1899021</td><td>Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>ile</td> yüklemeyi geliştirmek için 1971387 <td>Gerilime duyarlı boya</td></tr><tr><td>Rhod-2</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>1890519</td><td>Kalsiyum indikatörü</td></tr><tr><td>Silika jel tüp</td><td>Daha Uzun Hassas Pompa Co, Ltd, Baoding, Çin,</td> <td>96402-16</td><td>Peristaltik pompa ile bağlanın</td></tr><tr><td>İpek sütür</td><td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, Çin</td><td>20172650032</td><td>Aortu düzeltmek için</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Birleşik Krallık</td><td>N/A</td><td>EKG verilerini kaydetmek ve analiz etmek için</td></tr><tr><td>Stimülasyon elektrot</td><td>MappingLab, Birleşik Krallık</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>Işık kaynağı için</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>321343</td><td>Işık kaynağı için</td></tr></tbody></table>

katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi ryr2r2474s knock-in farelerinden kalplerin Çift boyutlu optik haritalaması

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Proaritmik kardiyak bozukluk katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi (CPVT), fiziksel aktivite, stres veya katekolamin zorluğunu takiben polimorfik ventriküler taşikardi atakları olarak ortaya çıkar ve potansiyel olarak ölümcül ventriküler fibrilasyona dönüşebilir. Fare kalbi, CPVT dahil kalıtsal kardiyak aritmik hastalıkları modellemek için yaygın bir türdür. Langendorff perfüze fare kalplerinden transmembran potansiyelinin (Vm) ve kalsiyum geçişlerinin (CaT) eşzamanlı optik haritalanması, aritmogenezin altında yatan mekanizmaları aydınlatma potansiyeline sahiptir. Hücresel seviye araştırması ile karşılaştırıldığında, optik haritalama tekniği, aktivasyonun belirlenmesi, iletim hızı, aksiyon potansiyeli süresi ve CaT süresi gibi bazı elektrofizyolojik parametreleri test edebilir. Bu makale, izoproterenol mücadelesi öncesinde ve sırasında programlanmış elektrik pacing ile birlikte murin vahşi tip ve heterozigot RyR2-R2474S/+ kalplerinde CaT ve V m'nin yüksek verimli optik haritalaması için enstrümantasyon kurulumunu ve deneysel prosedürü sunmaktadır. Bu yaklaşım, bir ex vivo fare kalp preparatında CPVT hastalığını mekanik olarak incelemek için uygulanabilir ve güvenilir bir yöntem göstermiştir.

Optik haritalama, son on yılda karmaşık kardiyak aritmilerin incelenmesinde popüler bir yaklaşım olmuştur. Optik haritalama kurulumu, 1.000 Hz'e kadar örnekleme hızı ve her piksel için 74 x 74 μm uzamsal çözünürlük sağlayan bir EMCCD kameradan oluşur. Sinyal örneklemesi sırasında oldukça yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlar (Şekil 1). Langendorff perfüze edilmiş kalp stabil bir duruma ulaştığında ve boya yüklemesi bittiğinde, kalp, RH237 ve Ca2+ göstergesi Rhod-2'nin uyarılması ...

Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Bu yöntem, katekolaminerjik, polimorfik ventriküler taşikardi gibi hastalıklarla ilişkili ventriküler arrest yaymalarının elektrofizyolojik özelliklerini ve mekanizmalarını ortaya koymamıza yardımcı olacaktır. Bu tekniği kullanarak, özellikle CPVT gibi kardiyak aritmik hastalığın altında yatan mekanizmaları ve dinamikleri keşfetmek için uygun olan çeşitli programlanmış elektriksel pacing protokolleri altında membran potansiyelini ve hücreler arası kalsiyum sinyallerini aynı anda elde edebiliriz. Bu deneyi başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için, iyi perfüze edilmiş bir kalbe, uygun boya yüklemesine, uyarma-kasılma ayırma ve dikkatli kamera ayarlarına sahip olduğunuzdan emin olun.Başlamak için optik haritalama sistemini kurun ve eksi 50 santigrat derecede sabit örnekleme sıcaklığı için kamerayı açın. Metabolizmayı yavaşlatmak ve kalbi korumak için hasat edilen fare kalbini soğuk CREB solüsyonuna yerleştirin. Aortun çevresindeki dokuyu çıkarın.Kanül yapmak için özel yapım bir kanül iğnesi kullanın ve 4-0 ipek sütürle sabitleyin. Şimdi kalbi Langendorff sistemi ile dakikada 3,5 ila 4,0 mililitre sabit bir hızda perfüze edin. Aşırı ön yüklemeyi önlemek için haznedeki çözelti tıkanıklığını gidermek için sol ventriküle küçük bir plastik tüp yerleştirin ve plastik tüpü kanülasyon iğnesine sabitleyin.Ardından banyodaki perfüzata iki uç yerleştirin ve elektrokardiyogram amplifikatör kutusu ve elektrik stimülasyon kontrolörü için güçleri açın. Ardından, referans verilen elektrokardiyogramı veya EKG yazılımını başlatın ve EKG'yi sürekli izleyin. Kalp kararlı bir duruma ulaştığında karanlıkta sonraki adımları gerçekleştirin.Blöbbistatin CREBs solüsyon karışımını, eksitasyondan kasılmayı ayırmak ve filme alma sırasında kasılma artefaktlarını önlemek için 10 dakika boyunca sürekli olarak kalbe perfüze edin. Daha sonra kırmızı bir el feneri kullanarak, kasılmaların tamamen durduğunu doğrulamak için kalbi inceleyin. Uyarma kasılması çözüldükten sonra kalbi Rhod-2 çalışma solüsyonu ile Langendorff perfüzyon sisteminde 15 dakika boyunca perfüze edin.Hücre içi kalsiyum boya yüklemesi sırasında oksijen beslemesini koruyun. Pluronik F-127'den kabarcık oluşumunu önlemek için, perfüzyon sistemine bir kabarcık tutucu yerleştirin. 10 mikrolitre RH 237 stok çözeltisini 50 mililitre perfüzata seyreltin ve 10 dakika boyunca yükleyin.Çift boya yüklemesini tamamladıktan sonra, bir dizi fotoğraf çekin. Voltaj ve kalsiyum sinyallerinin analiz için yeterli olduğunu onaylayın. Uyarma ışıkları için iki LED'i açın ve yoğunluklarını uygun bir aralığa ayarlayın.Kalbi algılama cihazının altına yerleştirin ve ışık noktası çapını iki santimetreye ayarlayan iki LED ile iyi aydınlatıldığından emin olun. İstenen örnekleme hızını ve uzamsal çözünürlüğü elde etmek için lens ile kalp arasındaki çalışma mesafesini 10 santimetre olarak ayarlayın. Kamerayı aynı anda kontrol etmek ve voltaj ve kalsiyum sinyallerini yakalamak için sinyal örnekleme yazılımını açın.MyoPacer Alan Stimülatörünü başlatın ve darbe başına iki milisaniye ilerleme hızı süresi ile ilerleme hızı modelini transistör transistör mantığına ayarlayın. Başlangıç yoğunluğunu 0,3 volt olarak ayarlayın. Sol ventrikül tepesinin epikardiyaline bağlı bir çift platin elektrot yerleştirin.EKG kayıt yazılımını kullanarak kalbin diyastolik voltaj eşiğini test etmek için 30 ardışık 10 hertz S1 uyaranı uygulayın. Bire bir yakalama elde edilene kadar voltaj genliğini kademeli olarak artırın. Kalsiyum veya aksiyon potansiyeli alternatiflerini ve restitüsyon özelliklerini ölçmek için S1-S1 protokolünü uygulayın.Kalbi 100 milisaniyelik temel bir döngü uzunluğundan başlayarak art arda hızlandırın. 50 milisaniyeye ulaşana kadar sonraki her sekansta döngü uzunluğunu 10 milisaniye azaltın. Stimülasyondan önce optik haritalamayı aynı anda başlatın.S1-S2 uyaran protokolünü kullanarak ventriküler etkili refrakter periyodunu ölçmek için, 100 milisaniyelik bir S1-S1 pacing döngüsü uzunluğu ile başlayın. S2'yi 60 milisaniyede birleştirin ve S2 ektopik QRS kompleksini yakalayamayana kadar iki milisaniyelik adımlık bir azalma ile azaltın. Aritmi indüksiyonu için, sürekli 50 hertz burst pacing uygulayın ve iki saniyelik bir dinlenme aralığı bekledikten sonra aynı pacing bölümünü gerçekleştirin.İlginç bir aritmik dalga oluştuğunda eşzamanlı optik haritalama kayıtlarına hemen başlamak için sürekli yüksek frekanslı pacing süresi boyunca elektrokardiyogram kayıtlarını dikkatlice izleyin. Elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz kamerasını kullanarak görüntü yakalamaya devam edin. Görüntü alma yazılımında, Klasör Seç'e basın ve yarı otomatik büyük video veri analizi sürecini başlatmak için görüntüleri yükleyin.Analiz için doğru örnekleme parametrelerini girin. Görüntü eşiğini manuel olarak ayarlayın ve ilgilendiğiniz bölgeyi seçin. Üçe üç piksel Gauss uzamsal filtresi, Savitzky-Golay filtresi ve silindir şapka taban çizgisi düzeltmesi uygulayın.Ardından, taban çizgisini kaldırmak ve APD-80 ve CATD-50 gibi elektrofizyolojik parametreleri hesaplamak için Process Images'a basın. APD-80'i hesaplamak için aksiyon potansiyeli süresinin başlama zamanını tepe noktasına ve bitiş noktasını %80 repolarizasyona ayarlayın. Benzer şekilde, kalsiyum geçici süresinin başlangıç zamanını, son noktası %80 gevşeme olacak şekilde tepe noktası olarak tanımlayın.APD-80 ve CATD-80'in ısı haritalarındaki tipik izler gösterilmektedir. İzoproterenol, APD-80 ve vahşi tip ve katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi veya CPVT farelerini kısaltır, ancak izoproterenol zorluğundan sonra hiçbir fark bulunmadı. CATD-80 ve CPVT fareleri, izoproterenol zorluğundan sonra vahşi tipe göre daha uzunken, tedaviden önce anlamlı değildi.Voltaj sinyallerine göre, vahşi tip ve CPVT kalpleri, başlangıçta ve izoproterenol müdahalesinden sonra epikard boyunca aynı iletim kabiliyetine sahipti. Isı haritaları, CPVT farelerinin, izoproterenol mücadelesinden önce ve sonra vahşi tip farelerle aynı iletim yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Kalsiyum genliği alternatifleri analizi, vahşi tip kalplerdeki kalsiyum sinyallerinin 14.29 ve 16.67 hertz'de ardışık S1-S1 pacing sırasında başlangıçta sabit kaldığını, CPVT kalplerinin ise frekansa bağlı alternatifler gösterdiğini gösterdi.İzoproterenol mücadelesinden sonra, CPVT kalpleri S1-S1 pacing sırasında frekansa bağlı alternatifler ve kalsiyum sinyali sergilerken, vahşi tip kalpler etkilenmedi. Taşi aritmi analizi, hem vahşi tip hem de CPVT kalplerinin başlangıçta 50 hertz patlama hızı sırasında normal iletim sergilediğini göstermiştir. İzoproterenol ile bolluktan sonra, CPVT kalpleri 50 hertz patlama hızından sonra yüksek frekanslı rotorlar gösterirken, vahşi tip kalpler normal iletimi korudu.Bu prosedürü takiben, bu modellerde veya farmasötiklerin icadında elektrofizyolojik ve fonksiyonel özellikleri göstermek için adogen türleri ve vahşi tip fareler kullanılır. Optik haritalama, kardiyak aritmileri incelemek için güçlü bir araçtır, ancak uyarma kasılma ayırma bağlantısı altında floresan boyadaki sınırlama nedeniyle klinik olarak kullanılamaz. Yüksek devirli hesaplama teknolojisinin geliştirilmesi altında farklı hedef moleküller için uygun floresan geliştirilmesiyle, kardiyak optik haritalama tekniği sadece uygulamaları başarmak zorundadır.

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, potansiyometrik boya kullanarak (di-8-ANEPPS) Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde optik görüntü aksiyon potansiyeli hareketi yüksek bir zamansal ve mekansal çözünürlükte tekniği açıklar.

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Bu rapor, streç bağlı atriyal fibrilasyon sırasında Langendorff perfüze koyun kalp bozulmamış sol atrium elektriksel uyarım eşzamanlı endokardiyal ve epikardiyal optik haritalama metodolojisi ve sonuçları ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.

Stretch Bağlı Atriyal Fibrilasyon Koyun Modelinde Yüksek Çözünürlüklü Endokardial ve Epikardiyal Optik Haritalama

Bu makale, panoramik görüntüleme sistemi kullanılarak Langendorff perfüze tavşan kalbinde, optik haritalama deneylerini için temel prosedürleri ve ikili (voltaj ve kalsiyum) görüntüleme yöntemidir.

Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Burada, bir yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte, farenin sağ atrium ve özellikle Çin-atriyal düğümden elektriksel aktivitenin optik haritalama için bir protokol mevcut.

Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Bu çalışma, transgenik channelrhodopsin-2 (ChR2) farelerinin bozulmamış murin kalplerinin kardiyak ritmini, bir mikro-LED dizisi ile lokal fotostimülasyon ve epikardiyal membran potansiyelinin eşzamanlı optik haritalamasını kullanarak kontrol etmek için bir yöntem bildirmektedir.

Murin Kalplerde Optogenetik Çok Bölgeli Fotostimülasyon Uygulayarak İleri Kardiyak Ritim Yönetimi

Keşfedin, fare kalplerinde çift boyutlu optik haritalama ile katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardinin elektrofizyolojik özelliklerini. Bu yöntem, aritmi mekanizmalarını anlamak için transmembran voltaj ve kalsiyum sinyallerini eşzamanlı kaydetmenizi sağlar.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2^R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

Daha fazla video keşfet