Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

Bu yöntem, katekolaminerjik, polimorfik ventriküler taşikardi gibi hastalıklarla ilişkili ventriküler arrest yaymalarının elektrofizyolojik özelliklerini ve mekanizmalarını ortaya koymamıza yardımcı olacaktır. Bu tekniği kullanarak, özellikle CPVT gibi kardiyak aritmik hastalığın altında yatan mekanizmaları ve dinamikleri keşfetmek için uygun olan çeşitli programlanmış elektriksel pacing protokolleri altında membran potansiyelini ve hücreler arası kalsiyum sinyallerini aynı anda elde edebiliriz. Bu deneyi başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için, iyi perfüze edilmiş bir kalbe, uygun boya yüklemesine, uyarma-kasılma ayırma ve dikkatli kamera ayarlarına sahip olduğunuzdan emin olun.

Başlamak için optik haritalama sistemini kurun ve eksi 50 santigrat derecede sabit örnekleme sıcaklığı için kamerayı açın. Metabolizmayı yavaşlatmak ve kalbi korumak için hasat edilen fare kalbini soğuk CREB solüsyonuna yerleştirin. Aortun çevresindeki dokuyu çıkarın.

Kanül yapmak için özel yapım bir kanül iğnesi kullanın ve 4-0 ipek sütürle sabitleyin. Şimdi kalbi Langendorff sistemi ile dakikada 3,5 ila 4,0 mililitre sabit bir hızda perfüze edin. Aşırı ön yüklemeyi önlemek için haznedeki çözelti tıkanıklığını gidermek için sol ventriküle küçük bir plastik tüp yerleştirin ve plastik tüpü kanülasyon iğnesine sabitleyin.

Ardından banyodaki perfüzata iki uç yerleştirin ve elektrokardiyogram amplifikatör kutusu ve elektrik stimülasyon kontrolörü için güçleri açın. Ardından, referans verilen elektrokardiyogramı veya EKG yazılımını başlatın ve EKG'yi sürekli izleyin. Kalp kararlı bir duruma ulaştığında karanlıkta sonraki adımları gerçekleştirin.

Blöbbistatin CREBs solüsyon karışımını, eksitasyondan kasılmayı ayırmak ve filme alma sırasında kasılma artefaktlarını önlemek için 10 dakika boyunca sürekli olarak kalbe perfüze edin. Daha sonra kırmızı bir el feneri kullanarak, kasılmaların tamamen durduğunu doğrulamak için kalbi inceleyin. Uyarma kasılması çözüldükten sonra kalbi Rhod-2 çalışma solüsyonu ile Langendorff perfüzyon sisteminde 15 dakika boyunca perfüze edin.

Hücre içi kalsiyum boya yüklemesi sırasında oksijen beslemesini koruyun. Pluronik F-127'den kabarcık oluşumunu önlemek için, perfüzyon sistemine bir kabarcık tutucu yerleştirin. 10 mikrolitre RH 237 stok çözeltisini 50 mililitre perfüzata seyreltin ve 10 dakika boyunca yükleyin.

Çift boya yüklemesini tamamladıktan sonra, bir dizi fotoğraf çekin. Voltaj ve kalsiyum sinyallerinin analiz için yeterli olduğunu onaylayın. Uyarma ışıkları için iki LED'i açın ve yoğunluklarını uygun bir aralığa ayarlayın.

Kalbi algılama cihazının altına yerleştirin ve ışık noktası çapını iki santimetreye ayarlayan iki LED ile iyi aydınlatıldığından emin olun. İstenen örnekleme hızını ve uzamsal çözünürlüğü elde etmek için lens ile kalp arasındaki çalışma mesafesini 10 santimetre olarak ayarlayın. Kamerayı aynı anda kontrol etmek ve voltaj ve kalsiyum sinyallerini yakalamak için sinyal örnekleme yazılımını açın.

MyoPacer Alan Stimülatörünü başlatın ve darbe başına iki milisaniye ilerleme hızı süresi ile ilerleme hızı modelini transistör transistör mantığına ayarlayın. Başlangıç yoğunluğunu 0,3 volt olarak ayarlayın. Sol ventrikül tepesinin epikardiyaline bağlı bir çift platin elektrot yerleştirin.

EKG kayıt yazılımını kullanarak kalbin diyastolik voltaj eşiğini test etmek için 30 ardışık 10 hertz S1 uyaranı uygulayın. Bire bir yakalama elde edilene kadar voltaj genliğini kademeli olarak artırın. Kalsiyum veya aksiyon potansiyeli alternatiflerini ve restitüsyon özelliklerini ölçmek için S1-S1 protokolünü uygulayın.

Kalbi 100 milisaniyelik temel bir döngü uzunluğundan başlayarak art arda hızlandırın. 50 milisaniyeye ulaşana kadar sonraki her sekansta döngü uzunluğunu 10 milisaniye azaltın. Stimülasyondan önce optik haritalamayı aynı anda başlatın.

S1-S2 uyaran protokolünü kullanarak ventriküler etkili refrakter periyodunu ölçmek için, 100 milisaniyelik bir S1-S1 pacing döngüsü uzunluğu ile başlayın. S2'yi 60 milisaniyede birleştirin ve S2 ektopik QRS kompleksini yakalayamayana kadar iki milisaniyelik adımlık bir azalma ile azaltın. Aritmi indüksiyonu için, sürekli 50 hertz burst pacing uygulayın ve iki saniyelik bir dinlenme aralığı bekledikten sonra aynı pacing bölümünü gerçekleştirin.

İlginç bir aritmik dalga oluştuğunda eşzamanlı optik haritalama kayıtlarına hemen başlamak için sürekli yüksek frekanslı pacing süresi boyunca elektrokardiyogram kayıtlarını dikkatlice izleyin. Elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz kamerasını kullanarak görüntü yakalamaya devam edin. Görüntü alma yazılımında, Klasör Seç'e basın ve yarı otomatik büyük video veri analizi sürecini başlatmak için görüntüleri yükleyin.

Analiz için doğru örnekleme parametrelerini girin. Görüntü eşiğini manuel olarak ayarlayın ve ilgilendiğiniz bölgeyi seçin. Üçe üç piksel Gauss uzamsal filtresi, Savitzky-Golay filtresi ve silindir şapka taban çizgisi düzeltmesi uygulayın.

Ardından, taban çizgisini kaldırmak ve APD-80 ve CATD-50 gibi elektrofizyolojik parametreleri hesaplamak için Process Images'a basın. APD-80'i hesaplamak için aksiyon potansiyeli süresinin başlama zamanını tepe noktasına ve bitiş noktasını %80 repolarizasyona ayarlayın. Benzer şekilde, kalsiyum geçici süresinin başlangıç zamanını, son noktası %80 gevşeme olacak şekilde tepe noktası olarak tanımlayın.

APD-80 ve CATD-80'in ısı haritalarındaki tipik izler gösterilmektedir. İzoproterenol, APD-80 ve vahşi tip ve katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi veya CPVT farelerini kısaltır, ancak izoproterenol zorluğundan sonra hiçbir fark bulunmadı. CATD-80 ve CPVT fareleri, izoproterenol zorluğundan sonra vahşi tipe göre daha uzunken, tedaviden önce anlamlı değildi.

Voltaj sinyallerine göre, vahşi tip ve CPVT kalpleri, başlangıçta ve izoproterenol müdahalesinden sonra epikard boyunca aynı iletim kabiliyetine sahipti. Isı haritaları, CPVT farelerinin, izoproterenol mücadelesinden önce ve sonra vahşi tip farelerle aynı iletim yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Kalsiyum genliği alternatifleri analizi, vahşi tip kalplerdeki kalsiyum sinyallerinin 14.29 ve 16.67 hertz'de ardışık S1-S1 pacing sırasında başlangıçta sabit kaldığını, CPVT kalplerinin ise frekansa bağlı alternatifler gösterdiğini gösterdi.

İzoproterenol mücadelesinden sonra, CPVT kalpleri S1-S1 pacing sırasında frekansa bağlı alternatifler ve kalsiyum sinyali sergilerken, vahşi tip kalpler etkilenmedi. Taşi aritmi analizi, hem vahşi tip hem de CPVT kalplerinin başlangıçta 50 hertz patlama hızı sırasında normal iletim sergilediğini göstermiştir. İzoproterenol ile bolluktan sonra, CPVT kalpleri 50 hertz patlama hızından sonra yüksek frekanslı rotorlar gösterirken, vahşi tip kalpler normal iletimi korudu.

Bu prosedürü takiben, bu modellerde veya farmasötiklerin icadında elektrofizyolojik ve fonksiyonel özellikleri göstermek için adogen türleri ve vahşi tip fareler kullanılır. Optik haritalama, kardiyak aritmileri incelemek için güçlü bir araçtır, ancak uyarma kasılma ayırma bağlantısı altında floresan boyadaki sınırlama nedeniyle klinik olarak kullanılamaz. Yüksek devirli hesaplama teknolojisinin geliştirilmesi altında farklı hedef moleküller için uygun floresan geliştirilmesiyle, kardiyak optik haritalama tekniği sadece uygulamaları başarmak zorundadır.