Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi

İndüklenmiş pluripotent kök hücreleri veya IPSC kültür protokollerini 2B'den 3B'ye çevirmek için biyoreaktörlerin kullanılması, yüksek verimli taramalar gibi büyük ölçekli uygulamalar için yüksek sayıda hücre üretilmesini sağlar. Fizyolojik bir 3D ortamdaki bu hızlı nöronal farklılaşma protokolü, başlatıcı hücre etkileşimlerini geliştirir ve düşük bir parti-to=batch varyasyonu ile daha kısa sürede yüksek hücre verimi sağlar, böylece maliyet ve zamanı azaltır. Avrupa İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler Bankası, diğer beyin hücreleri ve kardiyomiyositler de dahil olmak üzere birden fazla soyda farklılaşmış hücrelerin hızlı ve uygun maliyetli üretimi için benzer yaklaşımlar uygulamaktadır.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre veya insan iPSC kültürü% 60 ila% 80 oranında birleştiğinde uygulama öncesi çalışmaya başlayın. Ortamı insan iPSC'lerinden tamamen aspire edin ve hücreleri iki kez 1X DPBS ile hafifçe durulayın. Altı santimetrelik Petri kabına iki mililitre önceden ısıtılmış tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri bir inkübatörde 37 santigrat derecede üç dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için bulaşıklara hafifçe dokunun veya hücreler ayrılmıyorsa bir ila iki dakika daha inkübe edin. Ardından, ROCK inhibitörü ile beş mililitre besleyicisiz IPSC bakım ortamı ekleyerek her çanaktaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik veya 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücre tekilleşmesini sağlamak için pipetleme ile hafifçe karıştırın.

Otomatik bir hücre sayacı kullanarak 100 mikrolitre hücre süspansiyonundaki hücre sayılarını belirleyin ve istenen hacimdeki hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri üç dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin. Daha sonra, süpernatantı aspire edin ve hücreleri ROCK inhibitörü ile iki mililitre besleyicisiz IPSC bakım ortamında yeniden askıya alın.

Her 50 mililitrelik tüpü 18 mililitre ortamla doldurun. Ardından, her bir biyoreaktör tüpüne 20 mililitre hücre süspansiyonu dağıtın. Tüpleri biyoreaktör sistemine yerleştirin ve yetiştirme parametrelerini sınırsız bir süre için ayarlayın.

Ön yetiştirme programını biyoreaktör ekranı aracılığıyla başlatın. Ertesi gün ortamı değiştirmek için, süpernatanı dikkatlice aspire etmeden önce agreganın biyoreaktör tüplerine yaklaşık beş dakika yerleşmesine izin verin. Tüp başına ROCK inhibitörü olmadan 15 mililitre taze besleyicisiz IPSC bakım ortamı ekleyin ve tezgah üstü biyoreaktörde 24 saat boyunca ekime devam edin.

Nöronal farklılaşmayı başlatmak için, agreganın biyoreaktör tüplerine yerleşmesine izin verin ve süpernatantı hücrelerden dikkatlice aspire edin, tüpte yaklaşık beş mililitre süpernatant bırakın. Daha sonra, nörobazal ortamdan ve mililitre doksisiklin başına iki mikrogramdan oluşan 35 mililitre nöral indüksiyon ortamı ekleyin. Tüpleri tezgah üstü biyoreaktöre geri yerleştirin ve ekime devam edin.

Daha önce gösterildiği gibi, iki gün boyunca her gün medya değişiklikleri yapın. Süpernatantı daha önce gösterildiği gibi aspire ettikten sonra, agregaları steril bir 15 mililitre veya 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve agregaları DPBS ile iki kez hafifçe durulayın. Agregaları rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca dikkatlice aspire edin.

Daha sonra, pelet boyutuna bağlı olarak peletlere iki ila beş mililitre önceden ısıtılmış hücre ayrışma enzimi ekleyin ve hücreleri bir su banyosunda 37 santigrat derecede yaklaşık 10 dakika boyunca inkübe edin. Agregalar ayrışana kadar her iki dakikada bir tortullanmış agregaları yavaşça yeniden askıya alın. Daha önce eklenen hücre ayrışma enziminin hacminin üç katı olan önceden ısıtılmış nörobazal ortamı ekleyin ve hücre tekilleşmesini sağlamak için hücreleri dikkatlice yeniden askıya alın.

Hücre sayılarını belirleyin ve kriyoprezervasyon için karşılık gelen hücre süspansiyonu hacmini 15 mililitre veya 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Üç dakika boyunca 300 G'de hücrelere santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve% 10 dimetil sülfoksit içeren donma ortamının karşılık gelen hacminde hücre peletini yavaşça askıya alın.

Kriyoprezervasyon için uygun şişelerde hücre süspansiyonunu aliquot. Şişeleri derhal 2-propanol ile doldurulmuş, önceden soğutulmuş, yavaş hızlı bir dondurma kabına aktarın ve kabı gece boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Uzun süreli depolama için şişeleri ertesi gün eksi 150 santigrat dereceye yerleştirin.

İnsan iPSC'lerinin yapışkan kültürleri ayrıldıktan sonra, tekilleştirildikten ve süspansiyona aktarıldıktan sonra, agregalar 24 saat içinde oluştu ve büyümeye devam etti. İki günlük transgen indüksiyonundan sonra, erken nöronlar sonraki olgunlaşma için kriyokorunabilir. İnsan iPSC'lerinin süspansiyondaki ilk günlerde sürekli çoğalması gözlendi ve hücre kültürü sayısı iki günlük indüksiyondan sonra zirveye ulaştı.

Bununla birlikte, süspansiyonda dört günden fazla süren uzun süreli ekim, agregalar enzimatik tekilleşmeye karşı giderek daha dirençli hale geldiğinden, hücre verimini artırmadı. Ayrıca, sıfır gününe kıyasla, toplam çap ikinci günde% 50 arttı ve beşinci günde neredeyse iki katına çıktı. Artan çap, agregalara besin tedarikini sınırlasa da, hücrelerin canlılığı farklılaşmanın ikinci veya beşinci gününde etkilenmedi.

Nöronal belirteçler beta üç tübülin ve mikrotübül ile ilişkili protein veya MAP2 için temporal gen ekspresyon profili ve immünokimyasal boyama, iki günlük kriyokorunmuş hücrelerin nöronal hücre kimliğini doğruladı. Ek olarak, nöronal kültürler mikrotübül ile ilişkili protein tau transkriptleri veya MAPT'de zenginleştirildi ve transkripsiyon faktörünü düzenleyen pluripotens ekspresyonunda eşzamanlı bir düşüş gösterdi POU5F1 Çözülmeden sonraki ilk hafta içinde yoğun bir nöritik ağ oluştu, bu da nöronal kültürlerin olgunlaşmasının arttığını düşündürdü. Bu protokol, gelecekteki büyük ölçekli uygulamalar için hücre çıkış kapasitesinde daha da önemli bir artış gösteren büyük ölçekli ve tam otomatik biyoreaktörlere çeviri için temel oluşturmaktadır.

Nörojenin 2 ile kanıtlandıktan sonra, farklılaşmayı hızlandırmak için doğrusal belirleyici transkripsiyon faktörlerinin kullanılması, iPSC modellemesini kolaylaştırmak için birçok farklı hücre tipine ve hastalığına uygulanmıştır.