Name: Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Keşfedin, 3D süspansiyon biyoreaktöründe insan iPSC'lerinden hızlı nöron üretimi protokolünü. Bu yöntem yüksek hücre verimi ve düşük parti varyasyonu sağlayarak büyük ölçekli nörobilim araştırmaları için ölçeklenebilir bir temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EBiSC2 projesi, 821362 numaralı hibe anlaşması kapsamında Yenilikçi İlaçlar Girişimi 2 Ortak Girişimi'nden (JU) finansman almıştır. JU, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı ve EFPIA'dan destek almaktadır. Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters ve Vanessa M. Nalewaja'ya immünositokimyasal ve gen ekspresyon analizlerindeki yardımları için ve Heike Arthen'e mükemmel teknik desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca, biyoreaktör programının kurulması için Stephanie Bur'a teşekkür ederiz. Şekil 2A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

NOT: Tüm hücre manipülasyonları, ayrıca kültür yemekleri ve ortam preparatları steril koşullar altında yapılmalıdır. Laminer akış davlumbazı, kullanımdan önce ve işlendikten sonra tüm yüzeyler p etanol ile silinerek iyice temizlenmelidir. Açıklanan protokol, bir CERO 3D İnkübatörü ve Biyoreaktöründeki nöronal farklılaşmalar için optimize edilmiştir (aşağıda tezgah üstü biyoreaktör olarak anılacaktır). Bu tezgah üstü biyoreaktör, her biri maksimum 50 mL kapasiteye sahip özel biyoreaktör tüpleri için dört yuva sunar. Sıcaklık ve CO2 seviyeleri sürekli olarak kontrol edilir ve her tüp için yetiştirme parametreleri (örneğin, dönme hızı ve zamanı) bağımsız olarak düzenlenir. Tüm aspirasyon adımları, aksi belirtilmemişse, bir aspirasyon pipeti ve vakum pompası kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
1. HiPSC'lerin kültürlenmesi ve genişletilmesi
NOT: Bu protokolde mühendislik ürünü doksisiklin ile indüklenebilir NGN2 hiPSC hattı BIONi010-C-13 kullanılmıştır. Burada sağlanan genişletme protokolü 6 cm'lik Petri kapları için optimize edilmiştir, ancak tercih edilirse alternatif kültür formatları kullanılabilir.
<ol><li>Soğuk Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM)/F12 (-/-) ile seyreltilmiş baz membran matrisli 6 cm'lik Petri kaplarını 0,083 mg/mL/10cm2'lik bir nihai konsantrasyonda kaplayın. Kaplanmış bulaşıkları 37 °C'de en az 30 dakika inkübe edin. NOT: Bazal membran matris çözeltisinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol, üreticinin talimatlarında bulunabilir. hiPSC'ler genişleme için alternatif hücre dışı matrisler üzerinde kültürlenebilir.</li>
	<li>EBiSC Hücre hattı Kullanıcı Protokolü21'e göre kriyokorunmuş hiPSC'leri besleyicisiz iPSC bakım ortamında + 10 μM ROCK inhibitöründe (Y-27632) çözün. 60 mm'lik çanak başına 1 × 106 canlı hücrenin tohumlama yoğunluğu önerilir.</li>
	<li>Ertesi gün ortamı ROCK engelleyicisi olmayan besleyicisiz iPSC bakım ortamına değiştirin ve günlük ortam değişiklikleri gerçekleştirin.</li>
	<li>HiPSC kültürleri% 60 -% 80'lik bir birleşime ulaştığında geçmeye başlayın. Farklılaştırılmış alanları kontrol edin ve alan% 5'i aşarsa kolonileri manuel olarak temizleyin. NOT: Farklılaşmamış hiPSC'ler, belirgin bir nükleolus ve daha az sitoplazmaya sahip yuvarlak hücreler olarak görünür. Düz ve sıkıca paketlenmiş koloniler, çözüldükten veya geçtikten sonra erken oluşur. HiPSC kültürlerinin örnek parlak alan görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Daha fazla bilgi EBiSC Hücre hattı Kullanıcı Protokolü21'de verilmiştir. Geçiş için, bodrum membran matris kaplı tabaklar ve besleyicisiz iPSC bakım ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Ortamı hiPSC kültürlerinden aspire edin ve hücreleri 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) Ca 2 + ve Mg 2+ olmadan2 kat durulayın (DPS [-/-], bkz.</li>
	<li>Süpernatantı çıkarın ve 6 cm'lik Petri kaplarına 1x DPBS'de (-/-) 2 mL 0,5 mM EDTA ekleyin. Hücreleri inkübatörde 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>EDTA çözeltisinin 1.5 mL'sini aspire edin ve 3-5 dakika boyunca inkübasyona devam edin.</li>
	<li>Hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için bulaşıklara hafifçe dokunun. NOT: Ayırmayı görsel değerlendirme ile kontrol edin. hiPSC kolonileri 5 dakika sonra ayrılmaya başlamalıdır, ancak daha yüksek akışlı hiPSC kültürleri ile daha uzun bir inkübasyon süresi gerekebilir. Koloniler ayrılmazsa, kuluçka süresini 10 dakikaya kadar artırın, ancak bu zaman dilimini aşmayın.</li>
	<li>6 cm'lik Petri kaplarına 5 mL besleyicisiz iPSC bakım ortamı ekleyin ve 10 mL serolojik pipetle veya geniş delikli pipet uçları kullanarak kolonileri 2 kat hafifçe askıya alın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: hiPSC'ler mekanik strese karşı oldukça hassastır; Bu nedenle, birden fazla yeniden askıya alma işleminden kaçınılmalıdır. Son hücre süspansiyonu küçük koloni parçalarından (50-200 μm) oluşmalıdır.</li>
	<li>Süpernatantı kaplanmış kültür yemeklerinden aspire edin ve 6 cm'lik tabak başına 4 mL besleyicisiz iPSC bakım ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Küçük koloni parçalarını taze hazırlanmış kültür yemeklerine 1:10 ila 1:40 arasında bölünmüş oranlarda aktarın ve günlük medya değişiklikleriyle 37 ° C'de ve% 5 CO2'de yetiştirin. NOT: Küçük koloniler geçişten sonra 1 veya 2 saat içinde bağlanmalıdır.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig01.jpg"> Şekil 1: İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kültürlerinin morfolojisi . (A,B) Homojen morfolojiye ve tanımlanmış kenarlara sahip sıkıştırılmış hiPSC kolonilerini gösteren farklı birleşimlere sahip kaliteli hiPSC kültürleri. (C) koloni kenarları etrafında ortaya çıkan farklılaşmış hücre kümeleri ile hiPSC kültürü (kesikli beyaz çizgi). Ölçek çubuğu = 200 μm. Kısaltma: hiPSC = insan kaynaklı pluripotent kök hücre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Tezgah üstü biyoreaktör sisteminde hiPSC'lerin ön ekimi (gün-2)
<ol><li><li><li><li><li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></ol><ol><li> </li><li> </li><li><li> </li></ol><ol><li><li><li> </li><li><li> </li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><li><li></li><li><li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li></li><li> </li><li><li> </li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li><li><li></li><li><li></li></ol></li></ol>

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Nöronal transkripsiyon faktörü NGN2'nin ektopik ekspresyonunun, nöronal farklılaşmanın erken aşamalarını hızlandırdığı ve ekimden sonraki 1 hafta içinde hiPSC'lerde nöronal soy bağlılığını indüklediği daha önce gösterilmiştir12,13,20. Bu çalışma, gen düzenlenmiş BIONi010-C-13 hiPSC'lerin bir tezgah üstü biyoreaktör kullanılarak iNGN2 nöronlarına farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.
CERO 3D biyoreaktör, her biri maksimum 50 mL kapasiteye sahip özel tüpler için dört yuvaya sahip düşük hacimli bir biyoreaktördür. Sıcaklık ve CO2 seviyeleri sürekli olarak kontrol edilir ve her tüp için yetiştirme parametreleri (örneğin, dönme hızı ve zamanı) düzenlenir, böylece bağımsız olarak kullanıcıların paralel olarak çeşitli farklılaştırma yaklaşımlarını çalıştırmasına olanak tanır. İç boru duvarındaki entegre dalga kırıcılar, ortamın düşük kayma gerilimi ile pertürbasyonuna izin verir ve kontrollü dönüş sırasında süspansiyonda 3D agregaları korur. Besinlere sınırlı erişimin yanı sıra zorla 3D hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris (ECM) etkileşimleri, hücresel farklılaşmayı ve davranışı önemli ölçüde etkileyebilir24,25,26,27.
Hücrelerin süspansiyonda 3D agregalar olarak kültürlenmesi, bu hücre etkileşimlerini arttırır, böylece doku veya organların in vivo ortamını daha yakından taklit eder28. Ortamın eşzamanlı pertürbasyonu, mekanik sürtünme nedeniyle agrega boyutunu düzenler, gaz değişimini iyileştirir ve agregaların içindeki fizyolojik ilgili gradyanları korurken, tüpteki besin maddelerinin ve atıkların gradyanını azaltır 29,30,31,32,33,34. Orta modifikasyonlar manuel olarak yapılsa da, tezgah üstü biyoreaktör statik kültür şişelerine kıyasla işçilik ve işletme maliyetlerini azaltır. Biyoreaktör ayrıca tam otomatik karıştırma tankı biyoreaktörlerine göre çeşitli avantajlar sunar, çünkü pervanesiz tasarım agrega yüzeyindeki hidrodinamik kayma stresini azaltır, böylece sadece hücre sağkalımını iyileştirmekle kalmaz, aynı zamanda kayma stresinin hassas iPSC'ler, hücre farklılaşması ve fonksiyon35,36,37,38 üzerindeki etkilerini de sınırlar.
Hücrelerin büyük bir dikey pervane ile çalkalandığı dikey tekerlek biyoreaktörleri ve motorlu bir platforma bağlı şişirilmiş kültür torbaları kullanan sallanan hareket biyoreaktörleri, alternatif 3D süspansiyon platformlarını temsil eder. HiPSC'lerin yetiştirilmesi için aşırı derecede test edilmesine rağmen, 17,18,19,39,40, nöronal farklılaşma yaklaşımlarında uygulanabilirlikleri hakkında çok az şey bilinmektedir ve raporlar, karıştırma tankı biyoreaktörlerinde memeli ve insan nöral öncü hücrelerinin başarılı bir şekilde genişlemesi ile sınırlıdır41,42,43,44, nadir sayıda çalışma odaklanmaktadır. olgunlaşma44,45. Genel olarak, otomatik 3D süspansiyon platformları, tam otomatik ve bilgisayar kontrollü ortam değişimlerinin avantajını sunar, böylece kullanımdaki farklılıkları azaltır ve kontaminasyon riskini en aza indirir. Ayrıca, laktat ve glikoz konsantrasyonu gibi besin parametreleri sürekli olarak izlenebilir. Bununla birlikte, bu sistemlerin kurulması genellikle önemli bir ilk yatırım, laboratuvar alanı ve nitelikli personelin eğitimini gerektirir. Masaüstü biyoreaktör, süspansiyondaki hücrelerin kültürlenmesi için kompakt ve kullanımı kolay bir alternatifi temsil eder, ancak besin maddelerinin eşzamanlı olarak izlenmesini sağlamaz.
3D süspansiyon platformlarında hücrelerin yetiştirilmesi için kullanılan protokollerin çoğunda olduğu gibi, agregaların ilk oluşumu kritik bir adımı temsil eder. hiPSC'ler yapışkan tek katmanlar olarak kültürlenir ve daha sonra tek hücreli süspansiyonlar olarak 3B ortama aktarılır. Bu aşamada hücre kaybını en aza indirmek için, birkaç yönün göz önünde bulundurulması gerekir. Entegre dalga kırıcılı tüplerin tasarımı, optimum ortam pertürbasyonunu sağlamak için tüp başına minimum 10 mL'lik bir kültür hacminin gerekli olduğu anlamına gelir. Bu nedenle kritik hacim uzun vadede kesilmemelidir. Ayrıca, 10 mL kültür hacmi başına 7,5 milyon hücrelik bir başlangıç tohumlama yoğunluğu ve 60 rpm'lik bir dönme hızı, kısa vadede kararlı agregalar oluşturmak için şiddetle tavsiye edilir, ancak adaptasyonlar hücre hattına bağlı olarak gerekli olabilir.
HiPSC'leri süspansiyona aktardıktan sonra, agregalar 24 saat içinde oluşturulmalıdır. İlk ortam değişikliği kritiktir, çünkü agregalar küçüktür ve düzgün bir şekilde yerleşmeyebilir. Agregaların çökelme süresi uzatılabilir, ancak agregalar kümelenmeye ve heterojen bir şekilde büyümeye başlayabileceğinden, 10 dakikadan fazla olmamalıdır. Aspirasyon sırasında, tüpte minimum 5 mL'lik bir kültür hacmi bırakılmalı ve ortamın herhangi bir şekilde bozulmasından kaçınılmalıdır. Bununla birlikte, ilk aşamalarda hücre ve agrega kaybı beklenir. Hücre sayımları, kültürdeki ilk 2 gün boyunca sabit bir hücre verimini gösterir, bu da hiPSC'lerin yüksek proliferatif kapasitesinin ilk hücre kaybını telafi ettiğini gösterir. Süspansiyona girdikten sonra, nazik ekim ve pertürbasyon, zamanla büyümeye başlayan homojen boyutlu agregalara yol açar.
Nöronal farklılaşma, doksisiklin kaynaklı NGN2 aşırı ekspresyonu13'e dayanan daha önce yayınlanmış bir protokole göre gerçekleştirildi ve bireysel adımlar 3D yetiştirme için optimize edildi. Nöronal transkripsiyon faktörü NGN2, nöronal farklılaşmada iyi tanımlanmış bir sürücüdür ve nöronal indüksiyonu önemli ölçüde hızlandırır11,13,46. Tanımlanmış büyüme faktörleri ile konvansiyonel modelleme birkaç hafta ilaay 7,8,9 sürerken, NGN2 ekspresyonu günler içinde nöronal hücre kaderini indükler. Kısaltılmış yetiştirme süresine ek olarak, protokol ne pahalı büyüme faktörlerine ne de ilk süspansiyon kültürü için kaplama matrislerine bağlıdır, böylece ekim maliyetlerini ek olarak azaltır.
Dahası, yapışkan ve süspansiyonlu kültürlerde NGN2 güdümlü olgunlaşmamış nöron neslinin doğrudan karşılaştırılması, tezgah üstü biyoreaktör20 kullanılarak kültürde 4 gün sonra hücrelerde 1.36 kat artış olduğunu ortaya koyarken, 1 milyon hücrenin üretimi için gereken ortam hacminin yarıya indirilmesi bekleniyor. Bu nedenle, iNGN2 nöronlarının üretimi için tezgah üstü biyoreaktörün kullanılması faydalı olabilir, çünkü daha düşük bir taşıma süresi ve maliyeti ile daha fazla sayıda hücre üretilebilir. Önceki raporlara paralel olarak, nöronal soy bağlılığı erken dönemde gözlenmiştir. 2 günlük NGN2 indüksiyonundan sonra, TUBB3, MAP2 ve MAPT gibi klasik nöronal belirteçlerin derin bir ekspresyonu belirgindi ve nöronal indüksiyon için tezgah üstü biyoreaktörün uygulanabilirliğini destekledi. Bu protokolü takiben, kültürden sonraki 4 gün içinde 1 milyon hiPSC'den yaklaşık 6.2 milyon olgunlaşmamış iNGN2 nöronu elde edilebilir. Bununla birlikte, çıkış kapasitesi partiler arasında değişebilir ve tohumlamadaki süspansiyon kültürünün hacmine bağlı olabilir.
Verimi daha da artırmak için, ekim süresi 3 gün daha uzatıldı; Bununla birlikte, agregalar daha büyük olmasına rağmen, aynı zamanda oldukça kompakt hale geldiler ve kriyoprezervasyon veya yeniden kaplama için uygun şekilde ayrıştırılamadılar. 3D kültür yaklaşımlarındaki ilerlemelere rağmen, yapışkan 2D nöronal kültürler hala mikroelektrot dizileri veya kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel analizler için altın standarttır. Bu nedenle hücre tekilizasyonu, homojen olarak dağılmış nöronal tek katmanlı ve nöritik ağ için önemli bir ön koşuldur. Tekilleşmeyi sağlamak için hücrelerin daha güçlü mekanik ayrılması veya sert ayrışma reaktifleri kullanılabilir, ancak hücre canlılığı, fizyolojisi ve yeniden bağlanma kapasitesi üzerinde potansiyel etkileri vardır47,48. Daha ileri analizler ve olgunlaşma için tek hücrelere duyulan ihtiyaç ile ilgili olarak, agregalar süspansiyonda 4 gün sonra ayrıştırıldı ve (2. gün) iNGN2 nöronları kriyoprezerve edildi. iNGN2 nöronlarının çözülme sonrası farklılaşması ve karakterizasyonu, nöronal kültürlerin artan olgunluğunu ve yoğun bir nöritik ağın oluşumunu doğruladı.
Sağlanan protokol çok sayıda iNGN2 nöronu verir. Bununla birlikte, birkaç sınırlamanın dikkate alınması gerekir. Çoğu süspansiyon kültürü platformuna gelince, hiPSC'lerin 2B'ye bağlı bir kültürden 3B bir ortama aktarılması kritiktir ve genellikle derin bir hücre kaybıyla ilişkilidir. Medya değişiklikleri sırasında daha da önemli hücre ve toplam kaybı beklenmektedir. Otomatik platformlarla karşılaştırıldığında, orta değişikliklerin manuel olarak yapılması gerektiğinden, tezgah üstü biyoreaktör kullanılarak elleçleme süresi ve kontaminasyon riski artar. Otomasyon eksikliğinin yanı sıra, tezgah üstü biyoreaktör besinleri izleme imkanı sunmaz ve tüp başına maksimum 50 mL kapasite, protokolün yükseltme potansiyelini sınırlar. Son olarak, NGN2'nin nöronal soy bağlılığını hızlandırmasına rağmen, terminal olgunlaşma süresinin kısaltılmadığını ve hala birkaç hafta boyunca uzun süreli kültür gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Nöronal fonksiyon, bağlanma ve hayatta kalma için astrositik desteğin önemi göz önüne alındığında 49,50,51, eş-kültür yaklaşımları göz önünde bulundurulmalıdır ve hatta uzun vadeli uygulama için gerekli olabilir.
Özetle, bir 2D farklılaşma protokolü, bir tezgah üstü biyoreaktör uygulanarak iNGN2 nöronlarının hızlı ve tekrarlanabilir üretimi için 3D bir ortama başarıyla çevrildi. Açıklanan protokol, karmaşık model testleri, yüksek verimli ilaç taramaları ve büyük ölçekli toksisite testleri için bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilecek yüksek miktarlarda iyi kaliteli, iPSC türevli nöronlar verir.

Nörolojik bozukluklar dünya çapında engelliliğin önde gelen nedenidir1. Altı kişiden biri etkilenir ve insidans artmaya devam eder. Toplumlar ve sağlık sistemleri üzerindeki ilgili mali yük çok büyüktür. 2010 yılında 30 Avrupa ülkesinin değerlendirilmesi, zihinsel ve nörolojik bozukluklarla ilgili tahmini yıllık 800 milyar € maliyettir2. Artan sosyoekonomik yük, etkili tedavi stratejileri gerektirmekte ve hastalık patofizyolojisi konusundaki anlayışımız önemli ölçüde artmış olsa da, kliniklere çeviri çoğu zaman yetersiz kalmaktadır. Genel olarak, farmasötiklerin sadece% 12'si klinik çalışmalara girmektedir, bunların% 80'inden fazlası daha sonraki aşamalarda, esas olarak etkisizlik veya öngörülemeyen toksisite nedeniyle başarısız olmaktadır 3,4. Sebepler çeşitlidir, ancak klinik öncesi aşamalardaki hayvan testlerinden insan deneylerine sınırlı aktarılabilirlik giderek daha fazla ön plana çıkmıştır5. İnsan in vitro hücre ve doku modelleri, türler arası translasyon boşluğunu kapatabilir ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisindeki ilerlemeler bu konuda büyük bir potansiyele sahiptir. hiPSC'ler temel araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır ve embriyonik kök hücrelerle (hESC'ler) neredeyse sınırsız kendini yenileme kapasitesi ve embriyo yıkımı ile ilişkili etik kaygıları aşarken her üç germkatmanına 6 farklılaşma yeteneği gibi temel özellikleri paylaşır.
Nöronal hücrelerin hESC'lerden ve daha sonra hiPSC'lerden türetilmesi, beyin araştırmalarında bir kilometre taşı oldu. İlk farklılaşma protokolleri, embriyogenez sırasında kritik adımları taklit eden büyüme faktörlerinin uygulanmasına dayanıyorduve bunların çoğu, süspansiyonda veya yapışkan kültürlerde ikili SMAD inhibisyonunu içeriyordu 7,8,9. Olgun nöronlar başarıyla üretilmiştir, ancak bu protokollerin çeşitli dezavantajları, üretilen nöronların düşük verimi ve yüksek partiden partiye değişkenliğinin yanı sıra uzun kültür süreleriyle ilgili kapsamlı iş yükü gibi ilaç geliştirmede yaygın kullanımlarını hala engellemektedir. Nörogenezde kritik rol oynayan transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile iyileşmeler sağlanmıştır ve nörojenin (NGN) ailesinin üyeleri, özellikle NGN2, etkili sürücüler olarak tanımlanmıştır10. HiPSC'lerde NGN2'nin lentiviral aracılı ektopik ekspresyonu, nöronal farklılaşmanın erken aşamalarını önemli ölçüde hızlandırdı ve sadece 1 hafta içinde nöronal hücre kaderini indükledi11. Astrositlerle birlikte kültürlerde daha sonraki terminal olgunlaşma, tekrarlanabilir özelliklere sahip yüksek saflıkta ve miktarda fonksiyonel nöronlar verdi. Daha sonra NGN212,13 için stabil ve doksisiklin ile indüklenebilir bir ekspresyon kaseti ile hiPSC hatları oluşturmak için adeno ilişkili virüs entegrasyon bölgesi 1 (AAVS1) güvenli liman lokusunun bölgeye yönelik gen düzenlemesi uygulandı ve böylece lentiviral iletimin istenmeyen yan etkileri en aza indirildi.
Doksisiklin ile indüklenebilir nörojenin 2 (iNGN2) nöronlarının sağlam ve etkili farklılaşması, yüksek verimli fenotipik ilaç taramaları ve toksisite testleri için büyük bir potansiyele sahiptir10,14,15; ve son on yılda ölçeklenebilir bir hücre genişlemesi ve farklılaşması için biyoreaktörlerin uygulanmasında biyoişlemede önemli ilerlemeler kaydedilmiştir16,17,18,19. Bununla birlikte, farklılaşma protokollerinin çoğunluğu bağlı kültürler için optimize edilmiştir ve üç boyutlu (3B) bir ortama çeviri genellikle temel değişiklikler gerektirir. Son zamanlarda, hiPSC'lerin genişlemesi ve hepatositlere, kardiyomiyositlere ve nöronlara tekrarlanabilir farklılaşma için azaltılmış kayma stresi özelliklerine sahip bir tezgah üstü 3D biyoreaktörün başarılı bir şekilde kullanıldığı bildirilmiştir20. Burada, iNGN2 nöronlarının üretimi ve karakterizasyonu için aynı tezgah üstü 3D biyoreaktör kullanılarak ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol 50 mM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11528926</tr><tr><td>60 mm Nunclon Delta Yüzey</td><td>Nunc</td><td>734-2040</td><td></td></tr><tr><td>Anti-beta III Tubulin antikoru [TU-20] (seyreltme 1:1.000)</td><td>Abcam&nbsp; &nbsp;</td><td>ab7751&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler&nbsp; Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10400745</tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530536</td><td>serumsuz Takviye (50x)</td></tr><tr><td>BIONi010-C-13 hiPSC hattı</td><td>İndüklenmiş pluripotent Kök Hücre (EBiSC) için Avrupa Bankası, Depozitör olarak BIONEER</td><td>SAMEA103988285</td><td>Bioneer, EBiSC'de mevduat sahibi ve hiPSC hattının sahibidir.</td></tr><tr><td>Biyorender&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biorender.com</tr><tr><td>BSA Hücre Kültürü sınıfı</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12330023</tr><tr><td>CERO 3D İnkübatör & Biyoreaktör</td><td>OLS OMNI Yaşam Bilimleri</td><td>2800000</td><td></td></tr><tr><td>CEROtüpler Hücre kültürü Tüpleri 50 mL</td><td>OLS OMNI Yaşam Bilimleri</td><td>2800005</td><td></td></tr><tr><td>Citavi 6</td><td>İsviçre Akademik Yazılımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stemcell</td><td>7930</td><td>%10 DMSO</td></tr><tr><td>Cytofix Fiksasyon Çözeltisi</td> içeren dondurma ortamı <td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>%</td><td>4 paraformaldehit içeren 554655 fiksasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>DAPI (NUCBLUE SABİT HÜCRE BOYASI)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12333553</tr><tr><td>Doksisiklin hidroklorür (DOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3447</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve Magnezyum içermeyen DPBS (DPBS -/-)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve Magnezyum ile DPBS (DPBS +/+)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11580456</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-/-)</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Çekirdek Hücre Görüntüleme Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific Keçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX takviyesi&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-038</td><td>stabilize L-alanil-L-glutamin dipeptid</td></tr><tr><td>ImageJ 1.51v&nbsp;</td><td>Ulusal Sağlık</td><td></td><td></td>Enstitüsü</tr><tr><td>İnsülin çözeltisi insan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278l</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analiz Cihazı</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Monoklonal Antikor (seyreltme 1: 300)</td> <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>13-1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme faktörü azaltılmış, fenol-kırmızı içermez&nbsp;</td><td>Corning Yaşam Bilimleri&nbsp;</td><td>356231</td><td>bazal membran matrisi</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11140035</tr><tr><td>MicroAmp Optik Yapışkan Film Kiti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10095714</tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre</td><td>85850</td><td>besleyicisiz iPSC bakım ortamı&nbsp;</td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Bottenstein' bazlı serumsuz takviye s N-1 formülasyonu</td></tr><tr><td>Nörobazal Orta</td><td>Gibco</td><td>11570556</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2</td><td>Nikon Instruments Europe BV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter-NC200</td><td>ChemoMetec A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menşei 2021</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Perma/Yıkama Tamponu&nbsp;</td><td>BD Biyobilimler & nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>Astar deneyi TUBB3(Hs00801390_s1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Astar deneyi GAPDH (Hs99999905_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Astar deneyi GUSB (Hs99999908_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer deneyi HPRT1 (Hs99999909_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Astar tahlili MAP2 (Hs00258900_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer tahlili MAPT (Hs00902194_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer testi POU5F1 (Hs04260367_gH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitin %0,01</td> <td>Merck</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mikro Kiti (50)-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>sütun tabanlı RNA izolasyon kiti</td></tr><tr><td>RLT Tamponu</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>hücre lizis tamponu</td></tr><tr><td>Sodyum Pirüvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>12539059</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>11599686</td><td>hücre ayrışma enzimi</td></tr><tr><td>TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>11380912</td><td>qPCR ana karışımı</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Via1-Kaset</td><td>ChemoMetec A/S</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>Geniş Geçişli Filtreli Pipet Uçları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10088880</td><td></td></tr><tr><td>X20 OPTİK 96WELL HIZLI NET REAKSIYON PLAKALARI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206343</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür, Rho kinaz inhibitörü (ROCK inhibitörü)</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr></tbody></table>

Üç boyutlu süspansiyon biyoreaktöründe İnsan nörojenin 2-İndüklenebilir nöronların Üretimi

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

Nöronal soy hücrelerinin insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilmesi, beyin araştırmalarında bir kilometre taşı oldu. İlk ortaya çıkışlarından bu yana, protokoller sürekli olarak optimize edilmiştir ve şimdi araştırma ve ilaç geliştirmede yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu geleneksel farklılaşma ve olgunlaşma protokollerinin çok uzun sürmesi ve yüksek kaliteli hiPSC'lere ve bunların nöral türevlerine olan talebin artması, bu protokollerin büyük ölçekli üretime benimsenmesi, optimizasyonu ve standardizasyonu ihtiyacını artırmaktadır. Bu çalışma, genetiği modifiye edilmiş, doksisiklin ile indüklenebilir nörojenin 2 (iNGN2) eksprese eden hiPSC'lerin bir tezgah üstü üç boyutlu (3D) süspansiyon biyoreaktörü kullanılarak nöronlara farklılaştırılması için hızlı ve verimli bir protokol sunmaktadır.
Kısacası, iNGN2-hiPSC'lerin tek hücreli süspansiyonlarının 24 saat içinde agrega oluşturmasına izin verildi ve doksisiklin ilavesiyle nöronal soy bağlılığı indüklendi. Agregalar 2 günlük indüksiyondan sonra ayrıştırıldı ve hücreler ya kriyokorundu ya da terminal olgunlaşma için kaplandı. Üretilen iNGN2 nöronları, klasik nöronal belirteçleri erken dönemde eksprese etti ve kaplamadan sonraki 1 hafta içinde karmaşık nöritik ağlar oluşturdu ve bu da nöronal kültürlerin artan bir olgunluğuna işaret etti. Özetle, 3D ortamda hiPSC türevli nöronların hızlı üretimi için ayrıntılı bir adım adım protokol, hastalık modellemesi, fenotipik yüksek verimli ilaç taramaları ve büyük ölçekli toksisite testi için bir başlangıç noktası olarak büyük bir potansiyele sahiptir.

İlk adımlarda, hiPSC'lerin yapışkan kültürleri ayrılır, tekilleştirilir ve süspansiyona aktarılır (Şekil 2). Agregalar 24 saat içinde oluşur ve sürekli olarak büyür. Transgen indüksiyonundan 2 gün sonra, erken nöronlar sonraki deneyler için kriyokorunabilir.
Süspansiyonun ilk günlerinde kalıcı proliferasyon, hücre sayısında bir artışa neden olur ve 2 günlük indüksiyondan sonra zirveye ulaşır (Şekil 3A, B). Çoğalma ile birlikte, agregalar büyümeye başlar. 0. güne kıyasla, çap 2. günde P'lik bir artış gösterir ve 5. günde neredeyse iki katına çıkar (Şekil 3D). Artan bir çap, agregaların içindeki besin arzını sınırlasa da, hücrelerin canlılığı farklılaşmanın 2. gününde veya 5. gününde etkilenmez (Şekil 3C). Bununla birlikte, süspansiyonda 4 günden fazla uzun süreli bir ekim, agregalar enzimatik tekilleşmeye karşı giderek daha dirençli hale geldiğinden, hücre verimini daha da artırmaz (Şekil 3B).
Kriyoprezervasyon üzerine, 2. gün hücreleri çözülür ve terminal olgunlaşması için poli-L-ornitin (PLO)-laminin kaplı tabaklara kaplanır. Genel olarak, hücreler çözüldükten sonra çok iyi bağlanır ve nöritleri erken uzatmaya başlar. Temporal gen ekspresyon profili ve nöronal belirteçler TUBB3 ve MAP2 için immünositokimyasal boyama, nöronal hücre kimliğini doğrulamaktadır (Şekil 4A, B). Yükselen TUBB3 ve MAP2 seviyelerine ek olarak, nöronal kültürler mikrotübül ile ilişkili protein tau transkriptlerinde (MAPT) zenginleştirilir, akson stabilizasyonunda yer alan nöronal bir proteini kodlar ve pluripotensi düzenleyici transkripsiyon faktörü POU5F1'in ekspresyonunda eşzamanlı bir düşüş gösterir. Ayrıca, çözülmeden sonraki ilk hafta içinde yoğun bir nöritik ağ oluşur (Şekil 4C). Bu morfolojik değişiklikler, transkripsiyonel profil ile birlikte, nöronal kültürlerin artan bir olgunlaşmasını göstermektedir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig02.jpg"> Şekil 2: Bir tezgah üstü biyoreaktör kullanılarak hiPSC türevi iNGN2 nöronlarının üretimi. (A) Hücre kültürünün temel adımlarını vurgulayarak farklılaşma paradigmasına şematik genel bakış. (B-F) Parlak alan görüntüleri, (B) hiPSC'leri ve (C,D) tezgah üstü biyoreaktörde agrega oluşumunu görselleştirir. (E,F) iNGN2 nöronları nöritleri genişletir ve farklılaşma sırasında morfolojik değişikliklere uğrar. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: BMM = bazal membran matrisi; iPSC-MM = iPSC bakım ortamı; FKÖ = poli-L-ornitin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig03.jpg"> Şekil 3: Agrega oluşumu ve büyümesi sırasında hücre verimi ve canlılığı. (A) Parlak alan görüntüleri, tezgah üstü biyoreaktörde kültürden sonraki 2 gün içinde agrega oluşumunu ve zaman içinde agrega boyutundaki artışı göstermektedir. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Hücre veriminin nicelleştirilmesi ve (C) farklılaşma seyri boyunca canlılık. Çubuk grafikler, dört bağımsız deneyden elde edilen ortalama + SD'yi temsil eder. (D) Agregaların boyutunu gösteren çap, açık kaynaklı yazılım ImageJ (sürüm 1.53) kullanılarak yarı otomatik olarak belirlenmiştir. İlk olarak, parlak alan görüntüleri ikili görüntülere dönüştürüldü ve daha sonra aşağıdaki parametreleri uygulayarak parçacıkları analiz etme aracı kullanılarak daha fazla değerlendirildi: boyut &gt; 2.500 μm2, dairesellik 0.45-1, kenarları hariç tutma ve delikler içerme. Yatay çizgiler, beş bağımsız farklılaşmanın ortalama ± SD'sini gösterir. Tek noktalar, zaman noktası başına en az 20 toplama ile bireysel farklılaşma deneylerinin ortalamasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig04.jpg"> Şekil 4: HiPSC türevi iNGN2 nöronlarının karakterizasyonu. Nöronal genler TUBB3, MAP2 ve MAPT için zamansal gen ekspresyon profilinin yanı sıra pluripotent kök hücre ile ilişkili gen POU5F1. Göreceli ekspresyon seviyeleri referans genler GAPDH, HPRT1 ve GUSB'ye normalleştirildi. Kalibratör olarak farklılaşmamış hiPSC'ler (gün-2) seçildi. Geometrik semboller, dört bağımsız farklılaşmanın ortalama ± SD'sini gösterir. (B) Çözüldükten sonra 7. günde (gün-2 + 7) iNGN2 nöronlarının temsili görüntüleri, beta-III-tübülin (TUBB3, macenta) ve mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2, camgöbeği) için boyanmıştır. Hücre çekirdekleri DAPI ile boyandı. Ölçek çubukları = 100 μm. (C) Çözüldükten sonra nöronal kültürlerin parlak alan görüntülerinde nöritik ağın değerlendirilmesi. Nöritlerin toplam uzunluğu, ImageJ (versiyon 1.53) kullanılarak 930.82 × 698.11μm2'lik bir alanda belirlendi. Parlaklık ve kontrast ayarlandıktan sonra, görüntüler 8 bit görüntülere dönüştürüldü ve renkler tersine çevrildi. Nöritler daha sonra iskeletleştirildi ve daha sonra sırasıyla ImageJ eklentileri 'Skeletonize' ve 'Analyze Skeleton' kullanılarak analiz edildi. Nöritlerin toplam uzunluğu, ortalama nörit uzunluğunu / hücresini vermek için ilgili bölgedeki soma sayısına bölündü. Çubuk grafikler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama + SD'yi temsil eder. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu makalede, bir tezgah üstü 3D süspansiyon biyoreaktöründe insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronların üretimi için bir protokol açıklanmaktadır.

Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...

İndüklenmiş pluripotent kök hücreleri veya IPSC kültür protokollerini 2B'den 3B'ye çevirmek için biyoreaktörlerin kullanılması, yüksek verimli taramalar gibi büyük ölçekli uygulamalar için yüksek sayıda hücre üretilmesini sağlar. Fizyolojik bir 3D ortamdaki bu hızlı nöronal farklılaşma protokolü, başlatıcı hücre etkileşimlerini geliştirir ve düşük bir parti-to=batch varyasyonu ile daha kısa sürede yüksek hücre verimi sağlar, böylece maliyet ve zamanı azaltır. Avrupa İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler Bankası, diğer beyin hücreleri ve kardiyomiyositler de dahil olmak üzere birden fazla soyda farklılaşmış hücrelerin hızlı ve uygun maliyetli üretimi için benzer yaklaşımlar uygulamaktadır.İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre veya insan iPSC kültürü% 60 ila% 80 oranında birleştiğinde uygulama öncesi çalışmaya başlayın. Ortamı insan iPSC'lerinden tamamen aspire edin ve hücreleri iki kez 1X DPBS ile hafifçe durulayın. Altı santimetrelik Petri kabına iki mililitre önceden ısıtılmış tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri bir inkübatörde 37 santigrat derecede üç dakika boyunca inkübe edin.Ardından, hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için bulaşıklara hafifçe dokunun veya hücreler ayrılmıyorsa bir ila iki dakika daha inkübe edin. Ardından, ROCK inhibitörü ile beş mililitre besleyicisiz IPSC bakım ortamı ekleyerek her çanaktaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik veya 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücre tekilleşmesini sağlamak için pipetleme ile hafifçe karıştırın.Otomatik bir hücre sayacı kullanarak 100 mikrolitre hücre süspansiyonundaki hücre sayılarını belirleyin ve istenen hacimdeki hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri üç dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin. Daha sonra, süpernatantı aspire edin ve hücreleri ROCK inhibitörü ile iki mililitre besleyicisiz IPSC bakım ortamında yeniden askıya alın.Her 50 mililitrelik tüpü 18 mililitre ortamla doldurun. Ardından, her bir biyoreaktör tüpüne 20 mililitre hücre süspansiyonu dağıtın. Tüpleri biyoreaktör sistemine yerleştirin ve yetiştirme parametrelerini sınırsız bir süre için ayarlayın.Ön yetiştirme programını biyoreaktör ekranı aracılığıyla başlatın. Ertesi gün ortamı değiştirmek için, süpernatanı dikkatlice aspire etmeden önce agreganın biyoreaktör tüplerine yaklaşık beş dakika yerleşmesine izin verin. Tüp başına ROCK inhibitörü olmadan 15 mililitre taze besleyicisiz IPSC bakım ortamı ekleyin ve tezgah üstü biyoreaktörde 24 saat boyunca ekime devam edin.Nöronal farklılaşmayı başlatmak için, agreganın biyoreaktör tüplerine yerleşmesine izin verin ve süpernatantı hücrelerden dikkatlice aspire edin, tüpte yaklaşık beş mililitre süpernatant bırakın. Daha sonra, nörobazal ortamdan ve mililitre doksisiklin başına iki mikrogramdan oluşan 35 mililitre nöral indüksiyon ortamı ekleyin. Tüpleri tezgah üstü biyoreaktöre geri yerleştirin ve ekime devam edin.Daha önce gösterildiği gibi, iki gün boyunca her gün medya değişiklikleri yapın. Süpernatantı daha önce gösterildiği gibi aspire ettikten sonra, agregaları steril bir 15 mililitre veya 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve agregaları DPBS ile iki kez hafifçe durulayın. Agregaları rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca dikkatlice aspire edin.Daha sonra, pelet boyutuna bağlı olarak peletlere iki ila beş mililitre önceden ısıtılmış hücre ayrışma enzimi ekleyin ve hücreleri bir su banyosunda 37 santigrat derecede yaklaşık 10 dakika boyunca inkübe edin. Agregalar ayrışana kadar her iki dakikada bir tortullanmış agregaları yavaşça yeniden askıya alın. Daha önce eklenen hücre ayrışma enziminin hacminin üç katı olan önceden ısıtılmış nörobazal ortamı ekleyin ve hücre tekilleşmesini sağlamak için hücreleri dikkatlice yeniden askıya alın.Hücre sayılarını belirleyin ve kriyoprezervasyon için karşılık gelen hücre süspansiyonu hacmini 15 mililitre veya 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Üç dakika boyunca 300 G'de hücrelere santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve% 10 dimetil sülfoksit içeren donma ortamının karşılık gelen hacminde hücre peletini yavaşça askıya alın.Kriyoprezervasyon için uygun şişelerde hücre süspansiyonunu aliquot. Şişeleri derhal 2-propanol ile doldurulmuş, önceden soğutulmuş, yavaş hızlı bir dondurma kabına aktarın ve kabı gece boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Uzun süreli depolama için şişeleri ertesi gün eksi 150 santigrat dereceye yerleştirin.İnsan iPSC'lerinin yapışkan kültürleri ayrıldıktan sonra, tekilleştirildikten ve süspansiyona aktarıldıktan sonra, agregalar 24 saat içinde oluştu ve büyümeye devam etti. İki günlük transgen indüksiyonundan sonra, erken nöronlar sonraki olgunlaşma için kriyokorunabilir. İnsan iPSC'lerinin süspansiyondaki ilk günlerde sürekli çoğalması gözlendi ve hücre kültürü sayısı iki günlük indüksiyondan sonra zirveye ulaştı.Bununla birlikte, süspansiyonda dört günden fazla süren uzun süreli ekim, agregalar enzimatik tekilleşmeye karşı giderek daha dirençli hale geldiğinden, hücre verimini artırmadı. Ayrıca, sıfır gününe kıyasla, toplam çap ikinci günde% 50 arttı ve beşinci günde neredeyse iki katına çıktı. Artan çap, agregalara besin tedarikini sınırlasa da, hücrelerin canlılığı farklılaşmanın ikinci veya beşinci gününde etkilenmedi.Nöronal belirteçler beta üç tübülin ve mikrotübül ile ilişkili protein veya MAP2 için temporal gen ekspresyon profili ve immünokimyasal boyama, iki günlük kriyokorunmuş hücrelerin nöronal hücre kimliğini doğruladı. Ek olarak, nöronal kültürler mikrotübül ile ilişkili protein tau transkriptleri veya MAPT'de zenginleştirildi ve transkripsiyon faktörünü düzenleyen pluripotens ekspresyonunda eşzamanlı bir düşüş gösterdi POU5F1 Çözülmeden sonraki ilk hafta içinde yoğun bir nöritik ağ oluştu, bu da nöronal kültürlerin olgunlaşmasının arttığını düşündürdü. Bu protokol, gelecekteki büyük ölçekli uygulamalar için hücre çıkış kapasitesinde daha da önemli bir artış gösteren büyük ölçekli ve tam otomatik biyoreaktörlere çeviri için temel oluşturmaktadır.Nörojenin 2 ile kanıtlandıktan sonra, farklılaşmayı hızlandırmak için doğrusal belirleyici transkripsiyon faktörlerinin kullanılması, iPSC modellemesini kolaylaştırmak için birçok farklı hücre tipine ve hastalığına uygulanmıştır.

production-human-neurogenin-2-inducible-neurons-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Burada kendi kendine montaj 3-boyutlu iskele kültür insan nöral progenitör hücrelerin kullanımını tanımlamak. Biz flow sitometri ile analiz edilecek daha sonra örneğin iskeleleri hücreleri serbest bırakmak için bir protokol mevcut. Bu protokol detaylı mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için diğer hücre türlerine adapte olabilir.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Bu video, Parkinson hastalığını incelemek için bir model sağlamak üzere insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) dopaminerjik nöronlara farklılaşmasını göstermektedir. hESC'ler, 3D nöroküreler oluşturmak için bir mikro kuyu plakasında bir nöral indüksiyon ortamında kültürlenir. Bunlar daha sonra dopaminerjik progenitör nöronlara farklılaşmayı teşvik etmek için bir nöral indüksiyon ortamında kültürlenir. Nöronların son olgunlaşması, hava-sıvı arayüz koşulları altında bir kültür ekinde...

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Dopaminerjik Nöronal Organoidlerin Üretilmesi

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Doğrudan nöronal yeniden programlama başlangıç somatik hücre çağı korumak neurons oluşturur. Burada, indüklenen nöronlar dermal fibroblastlar yetişkin insan bağış elde oluşturmak için tek bir vektör tabanlı yöntemi açıklanmaktadır.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

Bu çalışmada, iki spesifik insan nöral organoidleri, insan sinirsel organoidlerin içinde sadece insanlarda ve 2) nöron dopaminerjik olarak eğitim için ilgili ve doğru bir model olarak 1) insan glioblastoma gelişimi türetmek için protokoller tanıtır ve açıklanmaktadır üç boyutlu bir organoid üreten farklılaşma.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

Bu protokol, bir doku kültürü çipinde bir sferoidden uzatılan sağlam bir akson demetinin kendiliğinden montajı yoluyla insan iPS hücre türevi motor sinir organoidini imal etmek için kapsamlı bir prosedür sağlar.

Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Burada, iPSC'den türetilen nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültürlerini üretmek için bir protokol sunuyoruz. 96 veya 384 oyuklu formatlarda bir hidrojel iskele içinde üretilen bu kokültür modeli, 7 gün içinde yüksek baskı sonrası canlılık ve nörit büyümesi gösterir ve her iki hücre tipi için olgunluk belirteçlerinin ekspresyonunu gösterir.

Tarama Uygulamaları için İnsan iPSC'den Elde Edilen Nöron-Astrosit Kokültürlerinin Üç Boyutlu Biyobaskısı

Keşfedin, 3D süspansiyon biyoreaktöründe insan iPSC'lerinden hızlı nöron üretimi protokolünü. Bu yöntem yüksek hücre verimi ve düşük parti varyasyonu sağlayarak büyük ölçekli nörobilim araştırmaları için ölçeklenebilir bir temel oluşturur.

Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi

Daha fazla video keşfet