Monoklonal Antikor Güvenliğinin Tahmini için Sitokin Salınım Testlerinin Sağlamlığını Doğrulamak için Referans Reaktiflerin Kullanılması

Yeni ilaçların güvenlik testi kritik öneme sahiptir ve bu protokol, bir CRS platformunun tekrarlanabilirliğini, sağlamlığını ve potansiyel sınırlamalarını değerlendirmek için doğrulanmış standartların nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik, bu reaktiflerle 11 farklı laboratuvarda doğrulanmıştır ve benzer yanıt kalıplarının gözlemlendiği uluslararası bir ortak çalışma yapılmıştır, bu nedenle uyumlaştırma ve tekrarlanabilirlik çabalarını geliştirmiştir. Bu tekniğin uygulamaları, yeni terapötik antikorların gelişmiş CRS risk testine kadar uzanır ve ayrıca potansiyel yan etkilerin klinik yönetimine hazır olmaya yardımcı olacaktır.

Bu çalışma, tekrarlanabilirliği ve uyumlaştırmayı geliştirmek içindir ve görsel bir gösteri, tekrarlanabilirlik şansını artırır. Referans reaktif ampullerinin içeriğini bir mililitre steril damıtılmış suda yeniden oluşturarak ve 5 ila 10 dakikalık rehidrasyona izin vererek başlayın. Ardından, steril kapaklı bir tüpe aktarmadan önce her bir antikor çözeltisini uygun şekilde karıştırın.

Daha sonra, sulandırılmış her bir antikoru seyreltin ve antikoru steril PBS'de mililitre başına 10 mikrograma test edin. Steril, TC ile muamele edilmemiş, U-tabanlı polipropilen 96 oyuklu bir mikrotitre plakası alın ve plakanın belirlenen oyuklarına 100 mikrolitre istenen seyreltilmiş antikor çözeltisi ekleyin. Ardından, katı faz tahlilini gerçekleştirmeden önce plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

En az 30 mililitre periferik tam kanı heparinize bir tüpe topladıktan sonra, kan örneğinin sodyum heparin ile uygun şekilde karışmasını sağlamak için birkaç kez ters çevirin. Daha sonra sulu faz tam kan tahlilinde kullanmak üzere 15 mililitre tam kan örneğini ayrı bir tüpte bir kenara koyun. Kalan 15 mililitre tam kanı, eşit miktarda PBS veya serumsuz RPMI 1640 ortamı ekleyerek seyreltin.

Seyreltilmiş kanı, 50 mililitrelik bir tüpte 15 mililitre yoğunluk gradyan ortamının üzerine nazikçe katmanlayın. Kanı farklı bileşenlerine ayırmak için frensiz ve 500 G'de ve oda sıcaklığında düşük ivmeli bir rotor kullanarak tüpü 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, yoğunluk gradyanı bir plazma üst tabakası olarak ayrılacak, ardından PBMC'leri içeren ince bir buffy kaplama tabakası ve nötrofiller ve eozinofiller dahil olmak üzere RBC'ler ve polimorfonükleer granülositler içeren bir alt tabaka izleyecektir.

PBMC'leri hasat etmek için üst plazma katmanını ve ardından bir sonraki katmanı dikkatlice çıkarın. Yıkamak için, hasat edilen buffy ceketi 10 mililitre PBS veya serumsuz RPMI 1640 besiyerinde tekrar süspanse edin. Hücreleri peletlemek için tüpü 10 dakika boyunca 500 G'de başlatın.

Süpernatanı atın ve yıkamayı tekrarlayın. Ardından, elde edilen peleti iki mililitre tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve PBMC konsantrasyonunu tam RPMI'de mililitrede 1 milyon hücreye ayarlayın.

Sulu faz tam kan sitokin salınım testi için, daha önce bir kenara bırakılan tam kan örneğini alın, numunenin 190 mikrolitresini 96 oyuklu U-tabanlı polistiren plakanın kuyucuklarına, ısıl işlem antikorlarına ve PBS'de mililitre başına 100 mikrograma önceden seyreltilmiş referans reaktiflere ekleyin ve 190 mikrolitre tam kan içeren belirlenen kuyucuklara 10 mikrolitre istenen seyreltilmiş antikor ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde 48 saat inkübe edin. Katı faz PBMC sitokin salınım testi için önceden hazırlanmış kaplanmış plakaları elde edin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, antikor çözeltisini kaplanmış plakalardan atın. Bir reaktif rezervuarını PBS ile doldurduktan sonra, bağlanmamış monoklonal antikorları çıkarmak için plakayı 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Her kuyucuğa önceden hazırlanmış PBMC süspansiyonundan 200 mikrolitre ekleyin.

Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde 48 saat inkübe edin. Kontrol ve test monoklonal antikorları ile 48 saatlik inkübasyondan sonra, plakaları beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan hücre şartlandırılmış ortamı veya plazmayı toplayın.

Toplanan süpernatanı veya plazmayı eksi 20 santigrat derecede dondurun. PBMC katı faz tahlil sonuçları, pozitif kontrol antikorlarının, eşleşen izotip kontrollerine kıyasla önemli ölçüde yüksek sitokin seviyelerini indüklediğini göstermiştir. Ayrıca, anti-CD28 süperagonistinin, eşleşen izotipine göre interlökin-2 veya IL-2 salınımında önemli ölçüde daha yüksek bir kat değişikliğine neden olduğu, anti-CD3 ve anti-CD52'nin ise hala IL-2 ekspresyonunu indüklerken, daha düşük kat değişikliklerine neden olduğu gözlendi.

Tam kan sulu faz testinde, saptanabilir sitokinlerin seviyesi katı faz testinden nispeten daha düşüktü, ancak anti-CD52 tarafından stimülasyona karşı daha büyük bir duyarlılık ile karakterize edildi.