Tavuk Embriyolarında İntralomik Transplantasyon Yoluyla Böbrek Organoidlerinin Etkin Vaskülarizasyonu

İn vitro kültüre alınan böbrek organoidleri olgunlaşmamış kalır ve uygulanabilirliklerini sınırlar. Ve bu intrakoelomik transplantasyon yöntemi vaskülarizasyonu indükler ve organoidlerin olgunlaşmasını arttırır. Prosedür çok etkilidir ve tek bir deneyde çok sayıda organoidin transplantasyonuna ve analizine izin verir.

HIPSC türevi böbrek organoidlerini hazırladıktan ve döllenmiş bacak boynuzu yumurtalarını inkübe ettikten sonra, inkübasyonun üçüncü gününde yumurta kabuğunda bir pencere oluşturur. Yumurtanın sivri ucuna küçük bir şeffaf bant parçası yerleştirin. Şeffaf bandın ortasındaki yumurta kabuğunda, bir çift diseksiyon makasın keskin ucuyla dokunarak küçük bir delik açın.

Ardından, beş mililitrelik bir şırınga üzerine 19 derecelik bir iğneyi 45 derecelik bir açıyla deliğe yerleştirin. Yumurtanın içindeki embriyoyu düşürmek için yumurtadan iki ila üç mililitre albümin aspire edin. Deliği ikinci bir şeffaf bant parçasıyla gizleyin, ardından yumurtanın yukarı bakan tarafına işaretlenmiş kalemin üzerine büyük bir şeffaf bant parçası yerleştirin.

Şeffaf bandın ortasındaki yumurta kabuğunda, bir çift diseksiyon makasın keskin ucuyla dokunarak bir delik açın. Kavisli disseksiyon makası kullanarak yumurta kabuğundaki küçük bir dairesel pencereyi bu delikten kesin. Embriyoyu bulmak için bu pencereden bakın.

Ardından, embriyoya erişimi optimize etmek için pencereyi genişletin. Forseps kullanarak embriyonun üstüne düşmüş olabilecek büyük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın. Plastik bir transfer pipeti ile embriyonun üzerine kalsiyum ve magnezyum içeren birkaç damla DPBS yerleştirerek daha küçük parçaları çıkarın, ardından DPBS'yi yumurta kabuğu ile pipete aspire edin.

Plastik bir transfer pipeti kullanarak, yumurtaya% 0.5 penisilin streptomisin ile desteklenmiş üç damla DPBS ekleyin. Yumurtayı inkübasyonun dördüncü gününe kadar inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencereyi büyük bir şeffaf bant parçasıyla dikkatlice kapatın. Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin.

Yumurtayı bir lastik tutucu veya yumurta kartonu üzerine diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Tavuk embriyosu şu anda Hamburger-Hamilton Aşama 23 ila 24'te ve sağ tarafı izleyiciye bakacak şekilde sol tarafında uzanıyor. Embriyonun sağ kanadını ve bacak tomurcuğunu bulun, çünkü koelom bu iki uzuv tomurcuğu arasında değerlendirilecektir.

Sağ kanat ve bacak tomurcuğu arasındaki alanda, vitelin zarında, koryonda ve amniyonda, iki çift disseksiyon forseps ile tutarak ve yavaşça zıt yönlere çekerek ardışık olarak bir açıklık oluşturun. Koelomik boşluğa engelsiz erişim olup olmadığını kontrol edin. Bir çift disseksiyon forseps ile kanat ve uzuv tomurcuğu arasındaki vücut duvarının kenarını yavaşça tutun ve izleyiciye doğru hafifçe çekin.

Koelomik boşluk açıkça görülebilmelidir. Koelomik boşluğa künt ama ince bir aleti dikkatlice yerleştirin. Bir dura dissektörü kullanarak allantozun üzerine yumurtanın içine yarım organoid yerleştirin.

Diseksiyon forsepslerini kullanarak, vücut duvarının kenarını dikkatlice tutun ve kolumun açıklığını görünür kılmak için izleyiciye doğru hafifçe çekin. Organoidi vücut duvarındaki açıklığa doğru ve içinden yavaşça künt bir tungsten tel ve bir mikro neşter tutucu ile coelum'a doğru hareket ettirin. Organoidi kolumun içine yerleştirmek için hafifçe kraniyal olarak itin.

Artık kanat tomurcuğunun hemen arkasında görülebilir. Plastik bir transfer pipeti kullanarak yumurtaya üç damla DPBS ekleyin. Yumurtayı inkübasyonun 12. gününe kadar inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencereyi büyük bir şeffaf bant parçasıyla dikkatlice kapatın.

Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin. Yumurtayı bir lastik tutucuda diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Vaskülatürü değerlendirin ve arterlerden biraz daha parlak kırmızı renkleriyle ayırt edilebilen damarları bulun.

Vaskülatüre erişimi iyileştirmek için, pencereyi kavisli diseksiyon makası ile keserek dikkatlice büyütün. Damarı seçtikten sonra, mikro kılcal iğnenin ucunu sıfır ila 20 derecelik bir açıyla damarın içine yerleştirin. Ucu yavaşça bir yandan diğer yana hareket ettirerek iğnenin damarda olduğundan emin olun.

Lens culinaris agglutinin enjekte etmek için enjeksiyon sistemine nazikçe ve istikrarlı bir şekilde üfleyin. Ve yumurtayı dolaşımına izin vermek için 10 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Yumurtayı banktaki lastik bir tutucuya yerleştirin.

Ardından, embriyoyu çevreleyen zarları kavisli diseksiyon makası ile kesin. Embriyoyu delikli bir kaşıkla yumurtadan çıkarın ve hemen makas kullanarak embriyonun kafasını kesin. Diseksiyon mikroskobu altında, embriyonun vücudunu bir Petri kabına yerleştirin.

Embriyoyu Petri kabına sırt üstü yerleştirin ve uzuvlarını yayın. Forseps kullanarak embriyonun karın duvarını uzunlamasına eksen boyunca dikkatlice açın. Embriyonun içindeki organoidi bulun.

Organoid en sık sağ karaciğer lobuna ya coddle ucunda ya da kraniyal olarak, göğüs kafesinin hemen altında bağlanır. Bu nedenle, bu konumlara bakarak başlamanız önerilir. Organoid yerleştirildikten sonra, mikro makasla etrafını keserek embriyodan çıkarın.

Organoidi, diseksiyon mikroskobu altında kaçınılmaz olarak bir Petri kabına tutturulmuş tavuk dokusuna yerleştirin. İki ucu keskin paslanmaz çelik tıraş bıçağı ile mümkün olduğunca fazla tavuk dokusunu çıkarın. Transplante edilmemiş bir böbrek organoidinin ve nakledilen bir böbrek organoidinin immünofloresan görüntüleri, glomerüler ve tübüler yapılar içerir.

Nakledilmemiş organoidlerde, bazı insan endotel hücreleri bulunur. Nakledilen organoidde, organoid boyunca perfüze edilmiş bir vasküler ağ görülebilir. Kutulu alanların büyütülmüş görüntüleri, nakledilen organoidlerde ayırt edilebilen üç tip endotel hücresini göstermektedir: perfüze edilmiş insan endotel hücreleri, perfüze edilmemiş insan endotel hücreleri ve perfüze edilmiş tavuk türevi endotel hücreleri.

Nakledilmemiş organoidlerde, endotel hücreleri glomerüler yapıları çevreler, ancak onları istila etmez. Bununla birlikte, transplante edilen organoidlerde, glomerüler yapılar perfüze kılcal damarlar tarafından vaskülarize edilir. Nakledilen organoidler, deneyin amacına bağlı olarak farklı teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Nakil yapılmamış kontrollerle doğrudan karşılaştırma, vaskülarizasyon ve olgunlaşma süreci hakkında fikir verebilir.