Geni Değiştirilmiş T hücrelerinin Üretimi için GMP Uyumlu Bir Prosedür

Bu protokol, ilgilenilen gen ile insan primer T hücrelerinin dönüştürülmesinin basitleştirilmiş ve GNP uyumlu bir sürecini açıklar. Bu özel teknik, şu anda birçok akademik merkezde bulunan pahalı kapalı sistem üretim platformları kullanılmadan uygun maliyetli ve GNP uyumlu olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu yöntem, hematolojik malignitelerle mücadele etmek için bir paradigma kayması olan CAR T hücreleri dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, gen modifiye hücre tedavilerinin üretilmesine potansiyel olarak uygulanabilir.

Donör kanın lökoferezinden sonra toplanan hücrelerden PBMC'yi izole etmek için, karışımı 800 G'de oda sıcaklığında 30 dakika santrifüjleyerek 1:2'lik bir reaktif/numune oranını koruyarak numunenin polisakkarit bazlı yoğunluk gradyanlı santrifüjlemesini gerçekleştirin. Daha sonra bir mikropipet kullanarak PBMC'leri 50 mililitrelik temiz bir tüpe toplayın. Hücreleri santrifüjleme ile PBS ile iki kez yıkayın.

Yıkanmış hücreleri tam hematopoietik ortamda yeniden süspanse etmeden önce. Her 2 milyon hücre için 10 mikrolitre T hücresi stimülasyon reaktifi ekleyerek elde edilen hücrelerin yaklaşık 20 milyonunu aktive edin. Daha sonra, mililitre başına 20 birimde rekombinant insan interlökin-2 ekledikten sonra, çözeltiyi yavaşça karıştırın ve altı oyuklu bir plakaya aktarın.

Viral transdüksiyon gerçekleştirmeden önce hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 72 saat inkübe edin. Üçüncü günde, hücre kültürünü 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve iyice karıştırın. Aktivasyon reaktifini çıkarmak için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı tamamen atın ve hücreleri saymadan önce peleti bir mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin. 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 0,5 milyon hücrenin kaplanmasına izin veren bir konsantrasyon elde etmek için tam ortam kullanarak hücre süspansiyon hacmini ayarlayın. Uygun konsantrasyonlarda hücrelere rekombinant insan interlökin-7 ve rekombinant insan interlökin-15 ekleyin.

Ayrı bir tüpte, kullanılacak son viral hacmi göz önünde bulundurarak Opti-MEM ortamına istenen miktarda vectofusin-1 ekleyin. Bu karışımı konsantre virüsle bire bir oranında birleştirin ve iyice karıştırın. Daha sonra, virüsü içeren elde edilen karışımı hücrelere ekleyin.

Gerekirse tam ortam kullanarak her bir oyuğun toplam hacmini 400 mikrolitreye ayarlayın. Plakayı bir kapakla kapattıktan sonra, 32 santigrat derecede iki saat boyunca 1000G'de santrifüjlemeden önce bir parafin film kullanarak kapatın. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Ertesi gün, hücreleri her bir kuyudan toplayın ve 50 mililitrelik bir tüpe çekin. Ardından, hücreleri 400G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkardıktan sonra, hücreleri saymadan önce peleti bir mililitre tam ortamda tamamen yeniden süspanse edin.

Daha sonra, mililitrede 1 milyon hücre elde etmek için hücre konsantrasyonunu ortamla ayarlayın ve hücreleri kültürlemeden önce sırasıyla mililitre başına 155 ve 290 birimde insan rekombinant interlökin-7 ve insan rekombinant interlökin-15 ekleyin. İstenilen hücre sayısına ulaşıldığında, hücreleri toplayın ve 50 mililitrelik tüplere aktarın ve santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri saymak için peleti 10 mililitre ortamda yeniden süspanse edin.

Tekrar santrifüjlemeden sonra, süpernatanı tamamen atın ve peleti, kriyo şişesi başına mililitre başına 10 milyon hücre konsantrasyonunda% 50 HSA ve% 40 HBSS'den oluşan bir kriyoprezervasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin. Her biri 0.9 mililitre hücre süspansiyonunu gerekli sayıda kriyo şişesine aktarın ve her bir kriyo şişesine% 10 dimetil sülfoksit ekleyin. Kriyo şişelerini buzun üzerine yerleştirin ve kriyo koruması için hızlı bir şekilde kontrollü oranlı bir dondurucuya kaydırın.

Ardından, dondurularak saklanan numuneleri uzun süreli depolama için izlenen bir sıvı nitrojen tankına aktarın. Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için, floresanla aktive edilmiş bir hücre sınıflandırmasında veya FACS tüpünde numuneye 500 mikrolitre FACS tamponu ekleyin. Numuneyi 400G'de ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı bir pipet kullanarak tamamen atın.

Pelet, FACS tamponunda bir ila beş seyreltilmiş CD3 çözeltisi içinde yeniden süspanse edilir. Numuneyi vorteksleyin ve daha önce gösterildiği gibi santrifüjlemeden önce karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, süpernatanı tamamen attıktan sonra, peleti FACS tamponunda bir ila 20 seyreltilmiş 7-AAD çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

Karanlık bir ortamda buz üzerinde 10 dakika inkübe etmeden önce bu karışımı vorteksleyin. Son olarak, 200 mikrolitre FACS tamponu ekleyin ve bir akış sitometresi kullanarak numuneyi analiz etmeye devam edin. Transdüksiyon hücrelerinin canlılık analizi, 14. günde, hücrelerin% 95'inden fazlasının CD3 pozitif ve 7-AAD pozitif hücreleri dışladıktan sonra canlı olduğunu ortaya koydu, bu da başarılı T hücresi aktivasyonu ve genişlemesini gösteriyor.

CD3 pozitif popülasyondaki transdüksiyon verimliliği, transdüksiyon olmayan hücrelere kıyasla% 58.7 olarak ölçüldü,% 0.51'lik bir transdüksiyon verimliliği sergilediDönüştürülen hücreler dördüncü günden 14. güne kadar genişletildiğinde, her iki günde bir alt kültür ile, hücreler 25 kat genişlemeye uğradı. Ürün çeşitli kalite kontrol testlerinden geçti ve belirlenen tüm kriterleri karşıladı, bu da daha fazla kullanım için uygunluğunu gösteriyor. Tüm prosedür kesinlikle aseptik tekniklerle gerçekleştirilmelidir.

Ve en zor adım, belirli bir toplam hacmi korumak için eklenecek tüm reaktiflerin hesaba katılması gereken transdüksiyon işlemidir.