Name: H9c2 Miyokard Hücrelerinin Crocetin ile Oksidatif Stresten PINK1 / Parkin Yolu Aracılı Mitopaji ile Korunması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Keşfedin, krosetinin H9C2 kardiyomiyositlerinde oksidatif stres hasarını PINK1/Parkin yolu aracılığıyla mitofaji ile onarma mekanizmasını. Bu yöntem kardiyovasküler araştırmalarda terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 7202119) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82274380) tarafından desteklenmiştir.

Deneyler, Çin'deki Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki Fizyoloji Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. Tüm çalışma yöntemleri, Pekin Üniversitesi'nin ilgili yönergelerine ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hücre kültürü
<ol><li>DMEM komple ortamını hazırlamak için Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) bazik besiyerine (4.5 g / L D-glikoz, 4.g.g / L L-glutamin ve 110 mg / L sodyum piruvat ile; Malzeme Tablosuna bakınız) %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin / streptomisin ekleyin.</li>
	<li>Sıvı azotla dondurulmuş H9c2 miyokard hücrelerini (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de ılık suda, buz eriyene kadar hızlı ve düzgün bir şekilde karıştırarak çözün.</li>
	<li>Hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve DMEM tam ortamının hacminin dört katını ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 358 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipet kullanarak atın.</li>
	<li>Elde edilen hücre süspansiyonunu kültür ortamı ile seyreltin, yavaşça üfleyin ve hücreleri bir kültür şişesinde aşılayın. 37 °C'de bir inkübatörde %5 CO2 ile kültür.</li>
</ol>2. Hücre canlılığının belirlenmesi
<ol><li>Krosetini (bakınız Malzeme Tablosu) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM ve 200 mM konsantrasyonlarında çözün.</li>
	<li>H9c2 miyokard hücrelerini tripsin ile ayırın, ardından karışımı DMEM tam ortamı ile nötralize edin.</li>
	<li>Hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 179 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücreleri DMEM komple ortamında hafifçe üfleyerek karıştırın.</li>
	<li>Bir kan hücresi sayım plakası22 kullanarak hücreleri sayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve DMEM tam ortamı ile 5 × 104 hücre / mL'ye seyreltin.</li>
	<li>Hücreleri dokuz eşit parçaya bölün. Kontrol grubuna DMSO (DMEM tam ortamı ile 1: 1.000 oranında seyreltilmiş) ekleyin ve kalan gruplara 1: 1.000 oranında farklı krosetin konsantrasyonları ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 96 delikli plakalarda kuyucuk başına 100 μL'de tohumlayın. Süpernatantı 24 saat inkübasyondan sonra atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>100 μL DMEM bazal ortamı ekledikten sonra, hücreleri 4 saat boyunca inkübe edin ve 20 μL MTS ekleyin ( bkz.</li>
	<li>Hücreleri 2 saat daha inkübe edin, absorbansı 490 nm dalga boyunda ölçün ve hücre canlılığını hesaplayın. NOT: Hücre canlılığı = (OD ile işlenmiş - OD boş) / (OD kontrolü - OD boş) × 100.</li>
</ol>3. Laktat dehidrogenaz (LDH), kreatin kinaz (CK), malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH Px) ve katalaz (CAT) tayini
<ol><li>H9c2 hücrelerini 6 delikli bir plakada 1 × 105 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Müdahaleden sonra süpernatantı toplayın ve üreticinin talimatlarına göre LDH ve SOD seviyelerini tespit edin (bkz.</li>
	<li>Süpernatantı toplayın ve bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Hücre lizatını kültür kabına ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin. Sıvıyı kültür kabından bir santrifüj tüpüne toplayın.</li>
	<li>CK, MDA, GSH-Px ve CAT düzeylerini üreticinin talimatları23'e göre tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu ve Ek Dosya 1).</li>
	<li>CK, MDA, GSH-Px ve CAT24 konsantrasyonunu düzeltmek için lizisin toplam protein konsantrasyonunu bicinchoninic acid (BCA) yöntemiyle tespit edin (bkz.</li>
</ol>4. ROS tayini
<ol><li>H9c2 hücrelerini 48 delikli bir plakada 5 × 103 hücre yoğunluğunda tohumlayın. DCFH-DA'yı ( bkz. Malzeme Tablosu) serumsuz ortam ile 1:1.000 oranında seyreltin. Hücre süpernatantını atın ve hücreyi serumsuz bir ortamla iki kez yıkayın.</li>
	<li>Her bir oyuğa 150 μL seyreltilmiş DCFH-DA ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hücreleri serumsuz bir ortamla üç kez yıkayın ve floresan mikroskobu altında görüntüler yakalayın (bkz.</li>
</ol>5. Mitokondriyal membran potansiyelinin tespiti
<ol><li>Bir JC-1 mitokondriyal membran potansiyeli tahlil kiti25 kullanarak mitokondriyal membran potansiyelini tespit edin (bakınız Malzeme Tablosu). Kültür ortamını atın ve serumsuz ortamla bir kez yıkayın.</li>
	<li>Her tüpe JC-1 çalışma solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın. 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri JC-1 boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Her bir kuyucuğa tam bir ortam ekleyin ve floresan mikroskobu altında fotoğraf çekin.</li>
</ol>6. TÜNEL boyama testi
<ol><li>Apoptoz oranlarını belirlemek için bir TUNEL apoptoz tahlil kiti kullanın (bakınız Malzeme Tablosu)26. Süpernatantı atın ve peletleri bir kez serumsuz ortamla yıkayın.</li>
	<li>Hücre fiksasyon çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra bir kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa% 0.3 triton-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. TUNEL algılama çalışma solüsyonunu ekleyin ve karanlıkta 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>4′,6-diamidino-2-fenilindol içeren bir anti-floresan söndürme sızdırmazlık tableti ekleyin (DAPI; Malzeme Tablosuna bakınız) ve floresan mikroskobu altında fotoğraf çekin.</li>
</ol>7. mCherry GFP-LC3B adenovirüsünün transfeksiyonu ile otofajik akışın izlenmesi
<ol><li>Her bir kuyucuktaki ortamın yarısını taze ortamla değiştirin. Kültür ortamına Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirüsü (2'nin enfeksiyon çokluğu [MOI]) ekleyin ve enfeksiyon verimliliğini artırmak için 5 μg / mL polibren ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Taze ortamı 24 saat sonra değiştirin ve floresan proteininin ekspresyonunu konfokal mikroskop altında gözlemleyin.</li>
	<li>Başarılı virüs enfeksiyonunu doğruladıktan sonra hücreleri bölüm 1 ile aynı koşullarda kültürleyin ve konfokal mikroskop altında görüntü yakalayın27. NOT: Hücrelerin% 20'sinden fazlası, başarılı bir enfeksiyonu gösteren yeşil floresan protein (GFP) floresansı gösterdi.</li>
</ol>8. Batı leke analizi
<ol><li>Tüm protein ekstraksiyonu için hücreleri toplayın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde lize edin (RIPA, proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü = 100: 1: 1; Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Protein miktarından sonra protein numunesine 5x protein yükleme tamponu ekleyin ve numuneleri 10 dakika kaynatın.</li>
	<li>Elektrofor, eşit miktarda protein içeren numunelerde sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jelleri28. Daha sonra, numuneleri poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.</li>
	<li>PVDF membranlarını %5 yağsız süt tozu ile 1 saat bloke edin ve gece boyunca 4 °C'de birincil antikor (PINK1, Parkin; bakınız Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında ikincil antikor ile 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Gelişmiş kemilüminesans (ECL) çözeltisini ve kemilüminesans algılama sistemini kullanarak hedef bantları tespit edin. Dansitometri28 ile bantları ölçmek için Image J yazılımını kullanın.</li>
</ol>9. Parkin'in mitokondriyal translokasyonunun immünofloresan ile saptanması
<ol><li>Parkin'in mitokondri ile çift immünofloresan boyama ile kolokalizasyonunu gözlemleyin. Hücre süpernatantını her gruptan atın ve PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin ve PBS'de% 0.1 triton-100 ekleyin.</li>
	<li>Proteinler ve antikorlar arasında spesifik olmayan bağlanmayı önlemek ve floresan arka planını azaltmak için 1 saat boyunca hayvansız blok çözeltisi ile blok yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Bir gecede 4 ° C'de birincil bir antikor (Parkin ve Tom20; Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.</li>
	<li>Bir floresan ikincil antikor ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>DAPI içeren anti-floresan söndürme tabletlerini ekleyin ve konfokal mikroskop altında görüntüler yakalayın.</li>
</ol>10. İstatistiksel analiz
<ol><li>Grafik ve analiz yazılımı kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin (bkz.</li>
	<li>Tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasındaki sürekli değişkenleri karşılaştırın. p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bulundu.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Samsky, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiogenic+shock+after+acute+myocardial+infarction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review.</a> JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).</li>
<li>Abbate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+cardiac+remodeling+benefits+in+patients+undergoing+late+percutaneous+coronary+intervention+of+the+infarct-related+artery%3A+evidence+from+a+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).</li>
<li>Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+heart+failure+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+treated+with+primary+percutaneous+coronary+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.</a> European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).</li>
<li>Dhruva, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+use+of+an+intravascular+microaxial+left+ventricular+assist+device+vs+intra-aortic+balloon+pump+with+in-hospital+mortality+and+major+bleeding+among+patients+with+acute+myocardial+infarction+complicated+by+cardiogenic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock.</a> JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+associated+with+major+cardiovascular+events+1+year+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction.</a> JAMA Network Open. 1 (4), e181079(2018).</li>
<li>Jou, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+protects+against+common+deletion+of+mitochondrial+DNA-augmented+mitochondrial+oxidative+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pineal+Research%22%5BJournal%5D)">Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis.</a> Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).</li>
<li>La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+supported+by+exogenous+cytochrome+c+oxidation+mimics+the+early+stages+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).</li>
<li>De Filippo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+secondary+prevention+medical+therapies+on+outcomes+of+patients+suffering+from+Myocardial+Infarction+with+NonObstructive+Coronary+Artery+disease+%28MINOCA%29%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis.</a> International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).</li>
<li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multitarget+strategies+to+reduce+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury%3A+JACC+review+topic+of+the+week%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).</li>
<li>Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+pharmacological+and+non-pharmacological+strategies+of+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002(2019).</li>
<li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development%2C+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748(2023).</li>
<li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749(2023).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis%3A+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515(2022).</li>
<li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction%3A+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3%2C659+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394(2021).</li>
<li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease%3A+evidence+and+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li>
<li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Echocardiography%22%5BJournal%5D)">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li>
<li>Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+trends+in+traditional+Chinese+medicine+for+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction.</a> Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010(2019).</li>
<li>Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+on+outcome+of+5284+patients+with+coronary+artery+disease%3A+the+role+of+integrative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crocetin+ester+improves+myocardial+ischemia+via+Rho%2FROCK%2FNF-kappaB+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway.</a> International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).</li>
<li>Zeng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+potential+value+and+mechanism+of+Kaji-Ichigoside+F1+on+arsenite-induced+skin+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473(2022).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+mitochondria+with+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li>
<li>Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+by+TUNEL+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis by TUNEL assay.</a> Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+impairs+the+autophagic+flux+to+induce+p62-dependent+apoptosis+through+the+upregulation+of+CYLD+in+NRCMs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs.</a> Toxicology. 465, 153032(2022).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+restore+the+MMP%2FTIMP+balance+in+models+of+osteoarthritis+by+inhibiting+the+activation+of+the+NF-%CE%BAB+and+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837(2021).</li>
<li>Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saffron%3A+a+potential+candidate+for+a+novel+anticancer+drug+against+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).</li>
<li>Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+effects+of+saffron%3A+an+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Tehran+Heart+Center%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review.</a> The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).</li>
<li>Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+perspective+and+opportunities+in+pharmacologically+important+safflower%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower.</a> Metabolites. 10 (6), 253(2020).</li>
<li>Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+saffron+supplementation%3A+current+clinical+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+protective+effect+of+salidroside+against+H2O2-induced+injury+in+H9C2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271(2021).</li>
<li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+rhizoma+drynariae+targets+in+the+treatment+of+osteoarthritis+based+on+network+pharmacology+and+experimental+verification%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462(2021).</li>
<li>Reers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+monitored+by+JC-1+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye.</a> Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).</li>
<li>Radovits, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibition+improves+endothelial+dysfunction+induced+by+reactive+oxidant+hydrogen+peroxide+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+parkin-mediated+mitophagy+and+mitochondrial+fission+in+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts.</a> Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).</li>
<li>Gan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+PINK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li>
<li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1%2FParkin+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li>
<li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SQSTM1%2Fp62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN%2Fparkin+in+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%284th+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1(2021).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

İleri teknoloji ile doğal ilaçların karmaşık bileşiklerinden etkili bileşenlerin araştırılması, TCM araştırmasının29 sıcak noktası olmuştur ve doğrulamadan sonra gelecekteki ilaç gelişimi için laboratuvar kanıtları sağlayabilir. Aspir, "kan dolaşımını teşvik etmek ve kan durağanlığını en aza indirmek" tedavisinde temsili bir ilaçtır ve miyokard enfarktüsü tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır30,31. Safranın aspir ile benzer etkilere s...

Akut miyokard enfarktüsü (), koroner arterlere şiddetli ve inatçı iskemi ve hipoksi sonucu ortaya çıkan, hayatı tehdit eden bir miyokard nekrozudur 1,2. Perkütan koroner girişim (PKG), için birinci basamak terapötik stratejilerden biridir ve genellikle kardiyomiyositleri iskemik hasardan korur 3,4. Distal miyokard, sonrası derhal ve etkili bir şekilde tedavi edilmezse kan ve oksijen kaynağından yoksun kalacaktır, bu da iskemik nekroza ve daha ileri kardiyovasküler komplikasyonlara yol açacaktır 5,6. Kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek ve PCI cerrahi fırsatını kaçırdıktan sonra geri dönüşümsüz miyokard hasarını en aza indirmek bir araştırma noktası olmuştur. AMI'den sonra, kardiyomiyositler iskemi ve hipoksi durumundadır, bu da mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun inhibisyonu, NAD + 'nın NADPH'ye indirgenmesi ve tek elektron redüksiyonunun artmasıile sonuçlanır 7. Sonuç olarak, oksijenin eksik indirgeme reaksiyonu, aşırı miktarda reaktif oksijen türü (ROS) üretir ve sonuçta kardiyomiyositlerde oksidatif stres hasarına yol açar8. Aşırı ROS birikimi, lipit peroksidasyonunu tetikleyerek mitokondriyal membranların yapısını ve işlevini daha da bozar. Sonuç, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin sürekli açılması ve mitokondriyal membran potansiyelinde bir azalma, apoptoz ve nekrozu indüklemesidir.
Anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörleri, anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB'ler), β-adrenoseptörlerin inhibitörleri, aldosteron antagonistleri ve'deki diğer standart ilaçlar, miyokard enfarktüsünden sonra kalp fonksiyonlarını iyileştirmeye yardımcı olabilir ve aritmiler ve sol ventrikül yeniden şekillenmesi gibi malign olayların ortaya çıkmasını önleyebilir9. Bununla birlikte, enfarktüs sonrası sağkalım ve prognoz enfarktüs boyutundan büyük ölçüde etkilenmektedir ve kardiyomiyosit apoptozunu azaltmada tatmin edici sonuçlar elde edilememiştir10,11. Bu nedenle, miyokard enfarktüsünden sonra kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek için ilaçların geliştirilmesi acil bir konu haline gelmiştir.
Geleneksel tıp, uzun yıllardır modern farmasötik araştırmalar için bir ilham kaynağı olmuştur12,13,14,15. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), tedavisinde uzun bir geçmişe sahiptir ve son yıllarda yapılan bir dizi randomize kontrol çalışması, TCM'nin hastaların prognozunu gerçekten iyileştirebileceğini doğrulamıştır16,17. TCM teorisine göre,'ye kan stazı18,19 neden olur, bu nedenle kan dolaşımını teşvik eden ilaçlar genellikle akut faz20'de tedavisi için kullanılır. Bunlar arasında safranın kan aktivasyonu ve stazı üzerinde güçlü bir etkisi olduğuna inanılmaktadır ve sıklıkla'nin akut tedavisinde kullanılmaktadır. Safranın önemli bir bileşeni olan krosetin, kardiyomiyositlerin korunmasında önemli bir rol oynayabilir21.
Bu çalışmada, H9c2 miyokard hücreleri,'nin kardiyomiyosit hasarına neden olan miyokard iskemisi / reperfüzyonunu simüle etmek için H2O2tarafından indüklendi ve oksidatif strese bağlı miyokard hasarına karşı koruyucu etkisini araştırmak için bir müdahale olarak krosetin kullanıldı. Krosetinin kardiyomiyositleri koruma mekanizması mitopaji ile daha da araştırıldı. Daha da önemlisi, bu makale mitopaji çalışmasına teknik yaklaşım için bir referans sağlar ve tüm deneysel prosedürü ayrıntılı olarak açıklar.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 tripsin</td><td>Gibco</td><td>2323363</td><td></td></tr><tr><td>% 1 Penisilin-streptomisin</td><td>Sigma</td><td>V900929</td><td></td></tr><tr><td>5x protein yükleme tamponu</td><td>Beijing Pulilai Gen Teknolojisi</td><td>B1030-5</td><td></td></tr><tr><td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirüs</td><td>Beyotime</td><td>C3011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjuge keçi anti-tavşan IgG (H + L)&nbsp;</td><td>Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Co, Ltd</td><td>ZF-0514</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 konjuge keçi anti-fare IgG (H + L)</td> <td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ZF-0513</td><td></td></tr><tr><td>Hayvansız engelleme çözümü</td><td>CST</td><td>15019s</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parkin antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32282</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PINK1 antikoru</td><td>ABklonal</td><td>A11435</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TOM20 antikoru</td><td>ABklonal</td><td>A19403</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-aktin&nbsp; antikoru</td><td>ABklonal</td><td>AC026</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein tahlil kiti</td><td>KeyGEN Biotech</td><td>KGP902</td><td></td></tr><tr><td>Kan hücresi sayma plakası</td><td>Servicebio</td><td>WG607</td><td></td></tr><tr><td>CAT tahlil kitleri</td><td>Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>A007-1-1</td><td></td></tr><tr><td>Kemilüminesans tespit sistemi</td><td>Şangay Qinxiang Bilimsel Alet Fabrikası</td><td>ChemiScope 6100</td><td></td></tr><tr><td>CK tahlil kitleri</td><td>Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>A032-1-1</td><td></td></tr><tr><td>Koenzim Q10 (CoQ 10)</td> <td>Macklin</td><td>C6129</td><td></td></tr><tr><td>Crocetin</td><td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>RFS-Z01802006012</td><td></td></tr><tr><td>DAPI içeren antifloresan söndürme tabletleri</td><td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ZLI-9557</td><td></td></tr><tr><td>DCFH-DA</td><td>Beyotime</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>8122091</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş Kemilüminesans (ECL) çözümü</td><td>NCM Biotech</td><td>P10100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Corning-Cellgro</td><td>35-081-CV</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prizma 7.0&nbsp;</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GSH-Px tahlil kitleri</td><td>Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>A005-1-2</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 miyokard hücreleri</td><td>Pekin Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td><td>CS0062</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-keçi IgG (H + L) &nbsp;</td><td>Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Co, Ltd</td><td>ZB-2305</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-fare IgG (H + L) & nbsp;</td><td>Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Co, Ltd</td><td>ZB-2301</td><td></td></tr><tr><td>JC-1 mitokondriyal membran potansiyel tahlil kiti</td><td>LABLEAD</td><td>J22202</td><td></td></tr><tr><td>LDH tahlil kitleri</td><td>Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>A020-2-2</td><td></td></tr><tr><td>MDA tahlil kitleri</td><td>Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>A003-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Aladdin</td><td>A2114057</td><td></td></tr><tr><td>MTS tahlili</td><td>Promega</td><td>G3581</td><td></td></tr><tr><td>Perhidrol</td><td>G-klonu</td><td>CS7730</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz inhibitörü</td><td>CWBIO</td><td>CW2383</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Beyotime</td><td>C0351</td><td></td></tr><tr><td>Poliviniliden diflorür (PVDF) membranları</td><td>Milipore</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Radyoimmünopresipitasyon deneyi (RIPA) lizis tamponu</td><td>Solarbio</td><td>R0010</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE jelleri</td><td>Şangay Epizyme Biyomedikal Teknolojisi</td><td>PG112</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE çalışan tampon tozu</td><td>Servicebio</td><td>G2018-1L</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE transfer tamponu tozu</td><td>Servicebio</td><td>G2017-1L</td><td></td></tr><tr><td>SOD test kitleri</td><td>Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>A001-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Tris-tamponlu tuzlu su tozu</td><td>Servicebio</td><td>G0001-2L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SLCC9172</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL apoptoz test kiti</td><td>Beyotime</td><td>C1086</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Solarbio</td><td>T8220</td><td></td></tr></tbody></table>

h9c2 miyokard hücrelerinin crocetin ile oksidatif stresten pink1 / parkin yolu aracılı mitopaji ile korunması

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Bu çalışma, krosetininH2O2 aracılı H9c2miyokard hücreleri üzerindeki oksidatif stresten koruyucu etkisini in vitro deneylerle araştırmayı ve mekanizmasının mitopajinin etkisiyle ilişkili olup olmadığını araştırmayı amaçlamıştır. Bu çalışmada ayrıca aspir asidinin kardiyomiyositlerde oksidatif stres üzerine terapötik etkisinin gösterilmesi ve mekanizmasının mitopajinin etkisi ile ilişkili olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Burada, birH2O2bazlı oksidatif stres modeli oluşturulmuş ve laktat dehidrogenaz (LDH), kreatin kinaz (CK), malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH Px) seviyelerini tespit ederek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarının derecesini değerlendirmiştir. Mitokondriyal hasarı ve apoptozu değerlendirmek için reaktif oksijen türleri (ROS) tespit eden floresan boya DCFH-DA, JC-1 boyası ve TUNEL boyası kullanıldı. Otofajik akı Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirüs transfekte edilerek ölçüldü. Mitopaji ile ilişkili proteinler daha sonra batı lekelenmesi ve immünofloresan yoluyla tespit edildi. Bununla birlikte, krosetin (0.1-10 μM) hücre canlılığını önemli ölçüde artırabilir veH2O2'nin neden olduğu apoptozve oksidatif stres hasarını azaltabilir. Aşırı otofajik aktivasyonu olan hücrelerde, krosetin ayrıca otofaji akışını ve mitopaji ile ilişkili proteinler PINK1 ve Parkin'in ekspresyonunu azaltabilir ve Parkin'in mitokondriye transferini tersine çevirebilir. Krosetin,H2O2aracılı oksidatif stres hasarını ve H9c2 hücrelerinin apoptozunu azaltabilir ve mekanizması mitopaji ile yakından ilişkiliydi.

Krosetinin hücre canlılığı üzerine etkileri 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM ve 100 μM'deki krosetin, hücreler üzerinde önemli bir proliferatif etkiye sahipken, 200 μM'nin üzerindeki konsantrasyonlarda krosetin, H9c2 hücrelerinin proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe etmiştir (Şekil 1A). 400 μM H2O2 ile 4 saatlik tedaviden sonra, hücre canlılığı önemli ölçüde azaldı ve krosetin bu değişikliği belirli bir dereceye kadar tersine çevirebildi (<s...

İn vitro deneylere dayanarak, bu çalışma, PINK1 / Parkin sinyal yolunun önemli bir rol oynadığı mitopajiyi etkileyerek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarını onarmada krosetinin mekanizmasını ortaya koymuştur.

H9c2 Miyokard Hücrelerinin Crocetin ile Oksidatif Stresten PINK1 / Parkin Yolu Aracılı Mitopaji ile Korunması

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Bu protokol, otofaj çalışmasına teknik yaklaşım için bir referans sağlar ve tüm deneysel prosedürleri ayrıntılı olarak açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, otofajik akıdaki değişimin uzunluk gözlemine izin vermesidir. Deneye başlamadan önce, etkili enfeksiyon konsantrasyonunu belirleyin ve gerekli güvenlik önlemlerini alın.Nötralize edilmiş H9C2 miyokard hücrelerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 179G'de santrifüj ederek başlayın. Süpernatantı atın ve hücreleri DMEM komple ortamında hafifçe üfleyerek karıştırın. Hücreleri dokuz eşit orana bölün.Kontrol grubuna dimetil sülfoksit ekleyin. Ardından, kalan gruplara değişen konsantrasyonlarda krosetin ekleyin. 96 delikli bir plakada kuyu başına 100 mikrolitre hücre tohumlayın.24 saat boyunca inkübe edildikten sonra, süpernatanı atın. Ardından, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Her bir oyuğa 100 mikrolitre DMEM bazal ortamı ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.Şimdi, 20 mikrolitre MTS ekleyin ve gösterildiği gibi iki saat daha inkübe edin. Son olarak, absorbansı 490 nanometrede ölçün ve hücre canlılığını hesaplayın. ROS'u belirlemek için, DCFH-DA'yı serumsuz ortam ile 1:1000 oranında seyreltin.Hüc

protection-h9c2-myocardial-cells-from-oxidative-stress-crocetin-via

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Parkinson hastalığı yol açan genlerde mutasyon taşıyan hastaların Fibroblastlar kolay erişilebilir bir...

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Burada, hasarlı mitokondrinin seçici olarak uzaklaştırılması sırasında EYFP-Parkin'in zamansal alımını ölçmek için hızlandırılmış bir video mikroskobu yaklaşımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Hasarlı mitokondrinin EYFP-Parkin'e bağlı olarak uzaklaştırılmasının bu dinamik süreci, farklı deneysel koşullar altında hücresel sağlığın bir göstergesi olarak kullanılabilir.

Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi

Burada, hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra hücreleri mitokondrial membran potansiyelini değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut.

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Bir protokol unilateral 6-OHDA lezyonlar, farelerde medyal önbeyin demet gerçekleştirmek için tarif edilmektedir. Bu yöntem, striatal dopamin ve 90,63&gt;% 95 kaybı gösteren hayatta kalan hayvanların% 89 ile düşük mortalite oranı (% 13.3) ±% -4,02, lezyonun tarafa doğru ipsiversive dönme önyargı vardır.

Parkinson Hastalığının tek taraflı lezyonlanmıştır 6-OHDA Mouse Model Geliştirme

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Biz dobutamin ile tetiklenen ve normal farelerde kalp kateterizasyonu tarafından izlenen bir kardiyak stres testi gerçekleştirmek için protokol açıklar. Ayrıca yüksek yağlı diyet bağlı obez farelerde subklinik kardiyak hastalık meydana çıkarmak için uygulama göstermektedir.

Kardiyak Stres Testi Dobutamin İndüklemiş ve Farelerde Kalp Kateterizasyonu tarafından İzlenen

Ekokardiyografi genellikle kardiyak yapı ve fonksiyondaki değişiklikleri noninvaziv olarak karakterize etmek ve ölçmek için kullanılır. Miyokard mikro yapısının gelişmiş bir vekil ölçüsünü sunan ve açık erişimli görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilen ultrason tabanlı bir görüntüleme algoritmasını açıklıyoruz.

Miyokard Mikroyapısının Ultrasonik Değerlendirmesi

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Keşfedin, krosetinin H9C2 kardiyomiyositlerinde oksidatif stres hasarını PINK1/Parkin yolu aracılığıyla mitofaji ile onarma mekanizmasını. Bu yöntem kardiyovasküler araştırmalarda terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

H9c2 Miyokard Hücrelerinin Crocetin ile Oksidatif Stresten PINK1 / Parkin Yolu Aracılı Mitopaji ile Korunması

Daha fazla video keşfet