Name: Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Keşfedin lipoliz oranlarının ex vivo murin yağ dokusu ve in vitro primer preadipositlerde seri örnekleme ve enzimatik analizlerle ölçülmesi. Bu yöntem metabolik hastalıklarda adipoz doku fonksiyonunu anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından S.M.R.'ye R01DK126944 hibesi ile desteklenmiştir.

Tüm hayvanların kullanımı, Cornell Üniversitesi Weill Cornell Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Tamponların ve toplama plakalarının hazırlanması
<ol><li>5 g BSA'yı 100 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içinde fenol kırmızısı olmadan çözerek% 5 sığır serum albümini (BSA) yapın. BSA'yı çözünmesi için hafifçe karıştırın (sallamak verimsizdir). BSA tamamen çözündükten sonra, ortamı 0,2 μm filtre ile filtreleyerek sterilize edin. BSA ortamını 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Kontrol ve stimülasyon ortamının çalışma konsantrasyonlarını yapın. Kontrol ortamı: Araç kontrollü %5 BSA ortamı. Stimülasyon ortamı: 0,5 μM CL-316.243 ile %5 BSA ortamı. Her deney için yeni stimülasyon ortamı oluşturun.</li>
	<li>Kullanılacak ortamı 37 °C'ye ısıtın. Medya koleksiyonu için 96 delikli bir plakayı etiketleyin.</li>
</ol>2. Numune hazırlama
<ol><li>Hücre kültürünü aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Dış kontaminasyonu en aza indirmek için tüm hücre çalışmalarını steril bir duman davlumbazında üstlenin.<ol><li>Primer preadipositleri 73,74'te olduğu gibi izole edin ve ayırt edin.<ol><li>1 mL/kuyucuklu kültür ortamında 24 delikli bir plakada 1 x 105 hücre/kuyu gibi yüksek yoğunlukta primer preadipositleri plakalayın (DMEM/F12'de fetal sığır serumu (FBS) ve 1x penisilin-streptomisin-glutamin).</li>
			<li>Hücreler% 100 akıcılığa ulaştıktan sonra, 3 gün boyunca kültür ortamında 5 μM deksametazon, 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin, 1 μg / mL insülin ve 1 μM tiazolidinedion (TZD) ile farklılaşır. Daha sonra, lipit damlacıklarını büyütmek için en az 3 gün boyunca 1 μg / mL insülin içeren kültür ortamına geçin. 24 delikli plakada 1 mL/kuyucuklu ortam kullanın.</li>
			<li>Kültür ortamını (1 ml / kuyu) her 2 veya 3 günde bir insülin ile değiştirin. Hücreler 2 haftaya kadar insülin içeren ortamlarda tutulabilir. Bu test için yalnızca farklılaşma oranlarının% 90'ın üzerinde olduğu ve gruplar arasında benzer olduğu kültürleri kullanın, çünkü azaltılmış farklılaşma lipolitik orandaki bir azalma olarak yanlış yorumlanabilir.</li>
			<li>Lipoliz ölçümünden önce 24 saat boyunca insülin içermeyen ortamda hücreleri kültürleyin. NOT: Ortamdaki insülin lipit damlacıklarını korur, ancak aynı zamanda lipolizi de inhibe eder. 24 saat boyunca insülin olmadan inkübasyon, lipit damlacık hacminde bir kayıp olmadan tam lipolitik aktivasyona izin verir. Bazı sistemlerde, insülinsiz kültür süresinin kısaltılması veya uzatılması gerekebilir.</li>
		</ol></li>
		<li>Artık serumu kültür ortamından çıkarmak için hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın. NOT: Bu protokol, lipolizi aktive edebilen serum açlığını içermez. Serum açlığı, araştırmacının takdirine bağlı olarak kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi ex vivo kültürü gerçekleştirin.<ol><li>Her fareden toplanacak her doku için bir kuyucuk içeren 6 kuyucuklu bir plaka hazırlayın. Kullanılacak her bir kuyucuğa 4 mL oda sıcaklığında DMEM yerleştirin. NOT: Koleksiyon ortamında BSA gerekli değildir.</li>
		<li>Lipoliz testi için 48 delikli bir plaka hazırlayın, her çoğaltma için bir kuyucuk hazırlayın. Kullanılacak her bir kuyucuğa 400 μL oda sıcaklığında DMEM yerleştirin. Fare başına doku başına iki ila dört kontrol ve iki ila dört uyarılmış kuyucuk kullanın.</li>
		<li>Bilateral pnömotoraks gibi ikincil bir yöntemle anestezi altında servikal çıkık ile fareyi ötenazi yapın. Burada, 4 ay boyunca% 45 yüksek yağlı bir diyetle beslenen 32 g, 7 aylık dişi bir C57BL / 6J fare kullandık. NOT: Bu protokol erkeklerin yanı sıra diğer suşlar, diyetler ve yaşlar için de kullanılabilir.</li>
		<li>% 70 etanol ile püskürtün ve karın derisinin merkezinde küçük (~ 1 cm) bir lateral kesi yapmak için makas kullanın, her iki tarafı başparmak ve işaret parmağıyla sıkıştırarak cildi ayırın ve posterior subkutan depoları ortaya çıkarmak için alt karın derisini katlayın. Kasık lenf nodunu bulup çıkarın ve forseps kullanarak inguinal lenf nodunun hemen arkasındaki inguinal yağ dokusunu künt diseke edin.</li>
		<li>Gonadal yağ dokusunu toplamak için, periton boşluğuna erişmek için peritonda lateral ve dikey bir kesi yapın. Gonadal yağ yastığını cımbızla tutun ve gonadal yağ dokusunu çıkarmak için uterus boyunca (veya erkekler için epididim) kesin. Toplanan depoları 6 delikli bir plakaya yerleştirin.</li>
		<li>Dokuyu iyice çıkarın, silikon bir paspas üzerine yerleştirin ve makasla 5 ila 7 mg'lık parçalar halinde kesin.</li>
		<li>Her bir tahlil kuyusu için 25 ila 30 mg (beş veya altı parça) tartın ve 48 kuyucuklu bir tahlil plakasına yerleştirin. Herhangi bir ortamı çıkarmak için tartmadan önce dokuyu temiz bir havlu üzerinde lekeleyin. Dokuyu çıkardıktan sonra ağırlık teknesini tartın ve geride kalan kalıntıların ağırlığını kaydedin. Numuneler arasında ağırlık teknesini temizleyin ve gerekirse tekrar dara yapın. Her doku için yeni bir ağırlık teknesi kullanın.</li>
		<li>Tüm doku örnekleri tartıldıktan sonra, 48 kuyucuklu tahlil plakasını 15 dakika boyunca 37 ° C,% 10 CO2 inkübatöre yerleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lipoliz tahlili
<ol><li>Medya toplama işlemini gerçekleştirin. Dış kaynaklardan kaynaklanan potansiyel kontaminasyonu en aza indirmek için ortamın transferini ve ardından numunenin steril bir duman davlumbazında toplanmasını üstlenin.<ol><li>T = 0'da, ortamı çıkarın ve kontrol veya stimülasyon ortamının kuyucuğu başına 400 μL ekleyin ve plakayı 37 ° C,% 10 CO2 inkübatöre yerleştirin. Ex vivo doku kültürü için, bir pipet kullanarak ortamı dikkatlice çıkarın; emme asla kullanılmamalıdır. NOT: Alternatif olarak, kontrol ve stimülasyon ortamı ile ikinci bir plaka hazırlayın ve dokuları aktarın.</li>
		<li>t = 1, 2, 3 ve 4 h'de, 200 μL ortam toplayın, uygun kontrol veya stimülasyon ortamının 200 μL'si ile değiştirin ve tahlil plakasını inkübatöre geri getirin. Toplama plakasını 4 °C'de saklayın. BSA ortamının FFA arabelleğe alma kapasitesini belirlemek için, 24 saatte ek bir koleksiyon kullanın. NOT: Deneyler burada durdurulabilir ve toplanan ortam -20 ° C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>4. FFA kolorimetrik tahlil
<ol><li>Reaktifleri oda sıcaklığına ısıtın ve bir şişe renk reaktifi A'yı bir şişe çözücü A ile ve bir şişe renk reaktifi B'yi bir şişe çözücü B ile çözün. Sulandırma tarihinden itibaren, bu reaktifler en iyi 1 hafta içinde kullanılır. Sulandırmadan 1 ay sonra atın.</li>
	<li>Numuneleri çözün ve karıştırın.</li>
	<li>FFA standart eğrisi oluşturun. Standart çözüm 1 mM'dir. Standart eğri için reaktiflerle birlikte şu hacmi kullanın: maksimum aralık için 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 seyreltme), 10 μL (1:4 seyreltme), 10 μL (1:8 seyreltme) ve 10 μL su. Düşük FFA seviyeleri için, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM ve 0,05 mM'lik 10 μL standardı daha uygulanabilir olabilir.</li>
	<li>Pipet standartları ve numuneleri 96 delikli bir tahlil plakasına yerleştirin. Önerilen numune hacmi 10 μL'dir. Arka plan düzeltmesi için numunelerle aynı hacimde BSA ortamına sahip üç kuyucuk ekleyin. NOT: Numune konsantrasyonları standart eğri aralığının dışına düşerse, numune hacmini 2-25 μL'ye ayarlayarak testi tekrarlayın.</li>
	<li>Her bir oyuğa 150 μL reaktif A ekleyin ve karıştırın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının. İnce bir gösterge iğnesi ile herhangi bir kabarcığı patlatın. Tahlil plakasını 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Plakanın emilimini 550 nm ve 660 nm referansta okuyun (Okuma A).</li>
	<li>Her bir oyuğa 75 μL B reaktifi ekleyin ve karıştırın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının. İnce bir gösterge iğnesi ile herhangi bir kabarcığı patlatın. Tahlil plakasını 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Plakanın emilimini 550 nm ve 660 nm referansta tekrar okuyun (Okuma B).</li>
</ol>5. Gliserol kolorimetrik tahlil
<ol><li>Serbest gliserol reaktifini 36 mL ultra saf su ile yeniden oluşturun ve oda sıcaklığına alıştırın. Bu reaktifler en iyi birkaç hafta içinde kullanılır. Sulandırmadan 2 ay sonra atın.</li>
	<li>Numuneleri çözün ve karıştırın.</li>
	<li>Gliserol standart çözeltisinin yedi noktalı, 2 kat seri seyreltilmesini ve bir su boşluğunu yaparak bir gliserol standart eğrisi oluşturun. NOT: Standart eğri, 2,8 mM gliserolün 25 μL'sine kadar nispeten doğrusaldır, ancak daha yüksek konsantrasyonlarda doğrusal değildir.</li>
	<li>Pipet, her biri 25 μL standart ve numuneleri 96 delikli tahlil plakasına yerleştirin. Arka plan düzeltmesi için BSA ortamına üç kuyu ekleyin.</li>
	<li>Her bir oyuğa 175 μL serbest gliserol reaktifi ekleyin ve karıştırın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının. İnce bir gösterge iğnesi ile herhangi bir kabarcığı patlatın. Tahlil plakasını 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Plakanın emilimini 540 nm'de okuyun.</li>
</ol>6. Lipolitik oranın hesaplanması
<ol><li>Optik yoğunluk (OD) değerleriyle başlayın. Gliserol için, doğrudan A540 OD değerlerini kullanın. FFA testinin OD'sini aşağıdaki formüle göre hesaplayın: OD = (Okuma B: A 550 - A 660) - (Okuma A: A550 - A660)</li>
	<li>Toplanan örneklerdeki FFA ve gliserol seviyelerini hesaplamak için standart eğriyi kullanın. Standart OD değerlerini y ekseninde çizin ve x ekseninde, numune hacmine göre standart konsantrasyonlar kullanın (yani, 10 μL numuneli bir plaka üzerinde 20 μL 1 mM FFA standardına sahip kuyucukların konsantrasyonu 2 mM'ye eşittir). Doğrusal bir eğilim çizgisine uyun: y = mx + b</li>
	<li>Standart eğriyi görsel olarak inceleyin ve testin doğrusal aralığının dışındaki noktaları kaldırın. Denklemi kullanarak numune konsantrasyonlarını hesaplayın: Numune konsantrasyonu: x = (OD - b) ÷ m</li>
	<li>Doğrusal tahlil aralığının dışında kalan numuneleri ayarlayın ve yeniden analiz edin. Son numune konsantrasyonunu elde etmek için, numunelerin konsantrasyonundan sadece BSA ortamı içeren arka plan kuyucuklarının konsantrasyonunu çıkarın.</li>
	<li>Her numune tarafından üretilen FFA ve gliserol mollerini her zaman noktasında, formüle göre hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65106/65106eq01.jpg" style="margin: auto;"> burada C n = t = n zamanındaki konsantrasyon; Vt = kuyudaki toplam hacim; Vs = numune toplama hacmi; ve M n = t = n zamanında üretilen moller (konsantrasyonlar mM cinsinden ve hacimler mL cinsinden olduğunda, çıktı μMol'dür). Örneğin, çeşitli zaman noktalarında: M 1 = C1 × Vt M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3) Vs veya M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × Vs + C1 ×Vs</li>
	<li>μmol/g birimleri elde etmek için her numune için gram cinsinden doku ağırlığına bölerek doku ağırlığına normalleştirin. Kültürlenmiş hücreler için değerler μmol/well olarak sunulur. Hücre sayısının ve farklılaşma verimliliğinin iyiden iyiye karşılaştırılabilir olduğundan emin olun. NOT: Proliferasyon veya farklılaşma verimliliğindeki farklılıklar, sonuçların yorumlanmasını zorlaştıracak ve başka bir normalleştirme yöntemi gerektirecektir (örneğin, proteine normalleştirme; tartışmaya bakınız).</li>
	<li>Her numune için üretilen μmol/g'nin (y ekseni) zamana (x ekseni) karşı eğimini ayrı ayrı hesaplayın.<ol><li>Bir elektronik tabloda, bu =SLOPE(known_ys,known_xs) işlevi kullanılarak yapılabilir. Yeni bir hücreye "=SLOPE" yazın (ardından imleci kullanarak örnek gliserol veya FFA değerlerini μmol/g cinsinden vurgulayın, ardından karşılık gelen zaman değerlerini vurgulayın).</li>
		<li>Verilerin doğrusallığını doğrulayın. R2 değerleri, numunelerin doğrusallığını belirlemenin hızlı bir yoludur. Bir elektronik tabloda bu, adım 6.7.1'de açıklandığı gibi =RSQ(known_ys,known_xs) işlevi kullanılarak yapılabilir, ancak ilk giriş =RSQ'dur. R2 değerlerinin &gt; 0,98 olduğundan emin olun; Düşük değerler doğrusallıktan sapmayı gösterir. Bu, bir ölçüm/örnekleme hatasından veya doğrusallık kaybından kaynaklanabilir.<ol><li>Doğrusallığı test etmenin bir başka yolu da her örnek için doğrusal bir regresyon gerçekleştirmek ve artıkları çizmektir. İstatistiksel bir analiz yazılımında, her zaman noktası için tek bir Y değerine sahip bir XY tablosu oluşturun. Analyze &gt; Simple linear regression (Basit doğrusal regresyonu analiz et) seçeneğini belirleyin ve OK (Tamam) düğmesine basmadan önce Residual Plot (Artık Grafik) kutusunu işaretleyin. Kalan grafik yeni bir grafik olarak görünür.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>İstatistiksel analiz yapmak için her numune için FFA ve gliserol üretim hızını (yani, eğim [(μmol / g / h]) ayrı bir veri noktası olarak kullanın ve farklı lipolitik koşullar karşılaştırılıyorsa değerleri çizin. Lipolitik oranlar genotipler arasında karşılaştırılıyorsa, teknik kopyalar olarak hayvan başına iki veya üç örnek kullanın ve hayvan başına bir veri noktası için ortalamayı kullanın, böylece örneklem büyüklüğü hayvan sayısına eşit olur.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada, adipositlerde ve ex vivo yağ dokusunda lipoliz oranını ölçmek için temel bir protokol sunuyoruz. Lipolizi ölçmek için, doğrusal fazda lipolitik hızı ölçmek önemlidir. Ortamın büyük bir kısmının toplandığı ve düzenli aralıklarla taze ortamlarla değiştirildiği seri örnekleme tekniği kullanıyoruz. Bu yarı konservatif yöntem, FFA tamponlama kapasitesine sahip taze BSA'nın eklenmesine izin verir ve lineer lipoliz süresini uzatarak geri besleme inhibisyonunu geciktirir. Bu deneysel tasarım, yağ dokusunun vaskü...

Fazla besinler, lipit damlacıklarının nötr lipit çekirdeğinde trigliseritler şeklinde beyaz yağ dokusunda depolanır. Trigliserit depoları, yağ asidi yan zincirlerinin yağ dokusu trigliserit lipaz (ATGL), hormona duyarlı lipaz (HSL) ve monogliserit lipaz (MGL) tarafından sırayla bölündüğü ve serbest yağ asitlerinin (FFA'lar) ve gliserol omurgasının 1,2 salınımına neden olan bir süreç olan lipoliz yoluyla mobilize edilir. Lipoliz, yağ dokusunda katekolamin sinyalizasyonu ile aktive edilir. Sempatik sinir terminalleri, adiposit plazma zarındaki β-adrenerjik reseptörlere bağlanan katekolaminleri lokal olarak serbest bırakır. Ligand bağlanması üzerine, bu G-protein kuplajlı reseptörler (GPCR'ler), Gαs yoluyla adenil siklazı aktive eder. Daha sonra protein kinaz A'nın (PKA) cAMP ile aktivasyonu, hem ATGL hem de HSL'nin yukarı regülasyonuna neden olur. Perilipin-1'in PKA tarafından fosforilasyonu, ATGL3'ü bağlayan ve birlikte aktive eden ABHD5'in (CGI-58 olarak da bilinir) ayrışmasına neden olur. PKA, HSL'yi doğrudan fosforile eder, sitosolden lipit damlacığına translokasyonunu teşvik eder, burada fosforile perilipin-1 ile etkileşim, lipaz aktivitesini daha da arttırır 4,5,6,7. Lipolizde yer alan üçüncü lipaz, MGL, katekolamin sinyalizasyonu8 ile düzenlenmiyor gibi görünmektedir. Önemli olarak, adipositlerde trigliserit sentezine, bir ara madde olarak monogliserit oluşumunu içermeyen gliserol lipid sentez yolu aracılık eder; Bunun yerine, gliserol-3-fosfat açil transferazlar, fosfatidik asit oluşturmak için başka bir yağ açil-CoA ile birleştirilen ve daha sonra trigliseritlerin son sentezinden önce digliseritlere izomerize edilen lizofosfatidik asit oluşumunu katalize eder (Şekil 1) 9,10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65106/65106fig01.jpg"> Resim 1: Lipoliz ve gliserol lipid sentez yolakları. Üst: Lipolitik yolak; kırmızı renkle gösterilen enzimler: yağ dokusu trigliserit lipaz (ATGL), hormona duyarlı lipaz (HSL) ve monogliserit lipaz (MGL). Alt: gliserol lipid sentez yolu; yeşil renkte gösterilen enzimler: digliserit asiltransferaz (DGAT), fosfatidik asit fosfataz (PAP), lizofosfatidik asit asiltransferaz (LPAT, LPAAT olarak da bilinir) ve gliserol-3-fosfat asiltransferaz (GPAT). Lipitler: trigliserit (TG), digliserit (DG), monogliserit (MG), serbest yağ asidi (FFA), yağ açil-CoA (FA-CoA), lizofosfatidik asit (LPA) ve fosfatidik asit (PA). Diğer metabolitler: inorganik fosfat (Pi) ve gliserol 3-fosfat (G3P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65106/65106fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hücre dışı adenozin, adenil siklaz aktivitesini etkilemek için Gs ve G i-kuplajlı GPCR'ler aracılığıyla çalışan lipolizin bir başka önemli düzenleyicisidir. Adipositlerdeki baskın adenozin reseptörü ADORA1, adenilil siklazı ve böylece Gi12'nin aktivasyonu yoluyla lipolizi inhibe eder. Daha düşük seviyelerde ve öncelikle kahverengi adipositlerde eksprese edilen ADORA2A,13 sinyalleme yoluyla lipolizi aktive eder. ADORA1 hem bazal lipolizi hem de adrenerjik agonistlere yanıtı etkiler. Adenozinin lipoliz üzerindeki etkisi, adenozini nötralize etmek için adenozin deaminaz ve ADORA1'e özgü agonist fenilizopropiladenozin14,15 eklenerek kontrol edilebilir. G q-kuplajlı GPCR'lerin hormonal aktivasyonu, fosfolipaz C ve protein kinaz C 16,17,18,19'un aktivasyonu yoluyla lipolizi de etkileyebilir. Enflamatuar sinyaller ayrıca lipolitik oranları da etkiler. LPS (ve diğer endotoksinler) ile TLR4 aktivasyonu, perilipin-1 ve HSL20'yi fosforile eden ERK'yi aktive ederek lipolitik hızı arttırır. TNF-α ayrıca ERK ve NF-κB aktivasyonu yoluyla lipolizi aktive eder, ayrıca fosfodiesteraz PDE-3B ve CIDEC21,22,23'ün transkripsiyonel downregülasyonu. IL-6 ayrıca, özellikle FFA salınımı hepatik steatoz ve glukoneogenezi etkileyen mezenterik yağ dokusunda artmış adiposit lipoliz ile ilişkilendirilmiştir24,25,26.
Lipoliz, beslenen durum sırasında insülin tarafından bastırılır. AKT, cAMP sinyalini bastırmak ve PKA aktivasyonunu önlemek için PDE-3B'yi fosforile eder ve aktive eder27. İnsülin ayrıca ATGL28'i transkripsiyonel olarak aşağı regüle eder. Obezite, adipositlerde β-adrenerjik reseptörlerin aşağı regülasyonu da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla katekolamin direncini arttırır 29,30,31,32,33. Adipositler üç β-adrenerjik reseptörün tümünü eksprese eder (β-1, β-2 ve β-3). β-1 ve β-2 adrenerjik reseptörleri her yerde eksprese edilirken, β-3 adrenerjik reseptör ağırlıklı olarak farelerde adipositlerde eksprese edilir34,35. Adrb3 ekspresyonu, adipogenez36 sırasında C / EBPα tarafından indüklenir. β-3 adrenerjik reseptör olgun adipositlerde yüksek oranda eksprese edilir. β-1 ve β-2 adrenerjik reseptörlerin aktivasyonu, β-arrestin37 ile geri besleme inhibisyonu nedeniyle kendi kendini sınırlar. β-3 adrenerjik reseptörün geri besleme inhibisyonuna, Adrb3 ekspresyonunu 33,38,39 azaltan diğer sinyal yolları aracılık eder.
Adiposit lipolizi aktive etmek için çok sayıda bileşik kullanılabilir. Katekolaminler lipolizin başlıca fizyolojik aktivatörleridir. Norepinefrin (veya noradrenalin) ve epinefrin (veya adrenalin) üç β-adrenerjik reseptörün hepsini aktive eder40. Norepinefrin ve epinefrin ayrıca α-adrenerjik reseptör sinyalinin aktivasyonu yoluyla lipolizi etkiler41. Yaygın olarak kullanılan β-adrenerjik reseptör agonistleri, seçici olmayan bir β-adrenerjik reseptör agonisti olan izoproterenol ve β-3 adrenerjik reseptör agonistleri CL-316,243 ve mirabegron42'yi içerir. Adipositlerin ağırlıklı olarak β-3 adrenerjik reseptörü ifade ettiği göz önüne alındığında, burada örnek olarak CL-316,243 kullanıyoruz. β-3 adrenerjik reseptör için özgüllüğü, onu in vivo olarak güvenle kullanılabilen adiposit katekolamin sinyallemesinin nispeten spesifik bir aktivatörü yapar. Hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan 10 μM CL-316,243 konsantrasyonunun, maksimum yanıt33'e ulaşmak için gereken ~ 0.1 μM dozundan daha yüksek büyüklük sıraları olduğunu unutmayın. Forskolin, adrenerjik reseptörü atlayarak adenil siklaz ve aşağı akış lipolitik sinyallemesini doğrudan aktive eder. Lipolizin baskılayıcılarının yanı sıra daha birçok aktivatör vardır. Lipolizi uyarmak için bir bileşik seçerken, reseptör özgüllüğü ve aşağı akış sinyal yolları deneysel tasarım içinde dikkatlice düşünülmelidir.
Beyaz yağ dokusunda lipoliz oranı, açlık veya egzersiz sırasında soğuk toleransını ve besin mevcudiyetini etkileyen önemli bir metabolik faktördür43,44,45,46. Bu protokolün amacı, adiposit metabolizmasının anlaşılmasını ve çeşitli murin modellerinin metabolik fenotipini nasıl etkileyebileceğini kolaylaştıracak adiposit ve yağ dokusundaki lipoliz oranını ölçmektir. Lipolitik oranı ölçmek için, lipolitik ürünlerin medyadaki görünümünü (yani, FFA'lar ve gliserol) ölçüyoruz. Yöntem, lipolitik ürünlerin adipositten medyaya salınmasına dayanır. Beyaz adipositler düşük gliserol kinaz seviyelerini eksprese ettiğinden, gliserol geri alım oranları düşüktür47. Tersine, FFA'ların ve gliserolün lipoliz dışındaki metabolik yollarla üretimi de göz önünde bulundurulmalıdır. Adipositler, gliserol-3 fosfata karşı aktiviteye sahip bir fosfatazı eksprese ediyor gibi görünmektedir ve glikoz 48,49,50'den türetilen gliserol-3-fosfattan gliserol üretimini sağlar. Glikoliz, beyaz adipositlerde FFA reesterifikasyonu için kullanılan bir gliserol-3-fosfat kaynağıdır. Glikoz seviyeleri sınırlı olduğunda, gliseroneogenez, laktat ve piruvat51 gibi diğer 3 karbonlu kaynakları gerektirir. Lipoliz ile salınan FFA'ların hücre içinde kanalize edilmesi ve metabolik kaderleri tam olarak anlaşılamamıştır; Lipoliz tarafından salınan FFA'lar, yeniden esterleştirilmeden veya β-oksidasyona uğramadan önce yağlı açil-CoA'ya dönüştürülmelidir. Lipoliz tarafından salınan FFA'ların muhtemelen geri alınmadan ve yağlı açil-CoA'ya dönüştürülmeden önce hücreden çıktığı görülmektedir 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA'lar albümin ile hücrenin dışında tutulabilir. Önemli olarak, uzun zincirli FFA'ların, albümin63,64,65,66,67 tarafından tutulmazlarsa lipolizi geri besleme-inhibe ettiği bilinmektedir. Bu nedenle, lipoliz testi sırasında ortamın FFA tamponlama kapasitesinin optimize edilmesi kritik öneme sahiptir. Burada açıklanan prosedür, farelerden ve insanlardan adipositlerde ve ex vivo yağ dokusunda lipolitik oranı ölçmek için daha önce yayınlanmış yöntemlere benzer 15,68,69,70,71. Bu protokol, seri örnekleme kullanımına göre farklılık gösterir; Seri örnekleme yaparak, lipolizin doğrusal fazda ölçüldüğünü dahili olarak doğrulayabilir ve lipoliz oranını hesaplamak için birden fazla ölçüm kullanabilir, böylece nihai hesaplanan değere olan güveni artırmak için ölçüm hatasını azaltabiliriz. Seri örneklemenin dezavantajı, tahlilin daha fazla zaman ve reaktif gerektirmesidir; Bununla birlikte, daha uzun zaman dilimi, ölçüm hatasının oran tahminlerinin standart hatası üzerindeki etkisini azaltır. Ek olarak, bu protokol hem FFA hem de gliserol salınımını ölçer ve FFA: gliserol salınımının oranını, tam lipoliz ve lipolitik ürünlerin medyaya salınmasından beklendiği gibi 3: 1 oranına ulaşmak amacıyla dikkate alır72.

<table><tbody><tr><td>24-Kuyucuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş plaka</td><td>Corning Inc</td><td>3527</td><td>Adiposit farklılaşması için doku kültürü ile tedavi edilmelidir</td></tr><tr><td>48-Kapaklı düz tabanlı plaka</td><td>Corning Inc</td><td>353078</td><td>Doku kültürü ile tedavi edilebilir</td></tr><tr><td>6-Kapaklı düz tabanlı plaka</td><td>Corning Inc</td><td>353046</td><td>Doku kültürü ile tedavi edilebilir</td></tr><tr><td>96 Kuyulu PCR Plakası</td><td>ABD sceintific</td><td>1402-9100</td><td>Herhangi bir konik 0.2 mL PCR plakası uygun olacaktır&nbsp;</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>FFA içermeyen BSA, örneğin A8806 da yaygın olarak kullanılmaktadır. BSA'nın tespit edilebilir FFA'sı olmamalıdır, ayrıca BSA'daki lottan partiye varyasyonlar gözlemlenen lipoliz oranını etkileyebilir</td></tr><tr><td>CL-316,243</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5976</td><td>CAS #: 138908-40-4 diğer tedarikçilerden temin edilebilir</td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVH</td><td>CO2 ideal olarak yağ dokusu için %10'a ayarlanmalıdır, ancak %5 CO2 de işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>DMEM, düşük glikoz, fenol kırmızısı</td><td>Thermofischer</td><td>11054020</td><td>Herhangi bir fenol kırmızısı içermeyen ortam çalışmalı, DMEM / F12, RPMI, ancak uçucu tamponlama kapasitesi, yani biyokarbonat</td></tr><tr><td>FFA içermeyen Sığır serum albümini</td><td>Equitech-Bio, Inc, &nbsp;</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Serbest Gliserol Reaktifi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol Standart Çözelti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7793&nbsp;</td><td>Bu, gliserolün istenen konsantrasyona seyreltilmesiyle de yapılabilir</td></tr><tr><td>HR Serisi NEFA Standart Çözüm</td><td>Fujifilm</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>HR Serisi NEFA-HR (2) Renk Reaktifi A</td><td>Fujifilm</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR Serisi NEFA-HR (2) Renk Reaktifi B</td><td>Fujifilm</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR Serisi NEFA-HR (2) Solvent A&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR Serisi NEFA-HR (2) Solvent B&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiyolojik İnkübatör</td><td>Fischer Scientific</td><td>S28668</td><td>37C'de herhangi bir inkübatör kullanılabilir</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 Kuyulu Plakalar</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>Optik olarak şeffaf, düz tabanlı 96 oyuklu plaka çalışır</td></tr><tr><td>Silikon Laboratuvar Tezgah Üstü Mat</td><td>VWR</td><td>76045-300</td><td>Cam plaka da kullanılabilir. Emici yüzeyler önerilmez</td></tr><tr><td>Spektrofotometre/Mikroplaka Okuyucu</td><td>Moleküler cihazlar</td><td>SpectraMax i3x&nbsp;</td><td>540, 550 ve 660 mm'de okuyabilen herhangi bir plaka okuyucu çalışacaktır</td></tr><tr><td>V Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810531</td><td></td></tr><tr><td>WypAll X70 Silecekler</td><td>Kimberly-Clark</td><td>41200</td><td>Herhangi bir yüksek kaliteli kağıt havlu işe yarayacaktır</td></tr></tbody></table>

lipoliz oranının ex vivo murin yağ dokusu ve İn vitro diferansiye primer preadipositlerin Ölçülmesi

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipositler, lipit damlacıklarında trigliseritler şeklinde enerji depolar. Bu enerji, yağ asidi yan zincirlerinin gliserol omurgasından sırayla ayrıldığı ve serbest yağ asitlerinin ve gliserolün salınmasına neden olan lipoliz yoluyla harekete geçirilebilir. Beyaz adipositlerde gliserol kinazın düşük ekspresyonu nedeniyle, gliserol geri alım oranları ihmal edilebilirken, yağ asidi geri alımı, albümin gibi medya bileşenlerinin yağ asidi bağlama kapasitesi tarafından belirlenir. Hem gliserol hem de yağ asidinin ortama salınımı, lipolitik oranı belirlemek için kolorimetrik testlerle ölçülebilir. Bu faktörleri birden fazla zaman noktasında ölçerek, lipolizin doğrusal oranını yüksek güvenle belirleyebilirsiniz. Burada, farelerden in vitro diferansiye adipositlerin ve ex vivo yağ dokusunun lipoliz ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol ayrıca diğer preadiposit hücre hatları veya diğer organizmalardan yağ dokusu için optimize edilebilir; Dikkat edilmesi gereken noktalar ve optimizasyon parametreleri ele alınmıştır. Bu protokol, fare modelleri ve tedavileri arasındaki adiposit lipoliz oranını belirlemede ve karşılaştırmada yararlı olacak şekilde tasarlanmıştır.

İn vitro diferansiye adipositlerin bazal ve uyarılmış lipolitik oranlarını ölçtük. Kasık beyaz yağ dokusundan primer preadipositler, 5 μM deksametazon, 0.5 mM IBMX, 1 μg / mL insülin ve 1 μM troglitazon ile 4 gün boyunca konfluent hücrelerin tedavisi ile adipositlere farklılaştırıldı ve ardından 1 μg / mL insülin ile 3 günlük ek bir tedavi uygulandı. Hücreler lipoliz tahlilinden önce 24 saat boyunca insülinsülsüz ortamda inkübe edildi. Zaman = 0h'de, hücreler bir kez PBS ile yıkandı, daha sonra 10 μM CL-316,243 ...

Adipositlerde trigliserit lipoliz, serbest yağ asitlerinin ve gliserolün serbest bırakılmasıyla sonuçlanan önemli bir metabolik süreçtir. Burada, adipositlerde bazal ve uyarılmış lipolizi ve farelerden ex vivo yağ dokusunu ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Bu protokol, kültürlü adipositlerde veya ex vivo yağ dokusunda adiposit lipoliz oranının belirlenmesini detaylandırarak, murin modelleri veya tedavileri arasında lipolitik oranların karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu protokol, lipolizin doğrusal fazda ölçüldüğünü dahili olarak doğrulamaya izin veren ve ölçüm hatasını azaltan seri örnekleme kullanır. Optimizasyon ile, bu protokol kahverengi yağ dokusunda, diğer organizmalardan yağ dokusunda veya adipojenik hücre hatlarında lipolizi ölçmek için kullanılabilir.Ex vivo dokular, salınan serbest yağ asitlerinin BSA tarafından ortamda tutulmasına izin vermek için tutarlı boyut ve şekildeki küçük parçalar halinde doğranmalıdır. Başlamak için, beş gram Sığır Serum Albümini veya BSA'yı, 100 mililitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM'de fenol kırmızısı olmadan çözerek% 5 BSA ortamını hazırlayın. BSA'yı çözmek için çözeltiyi yavaşça karıştırın.Daha sonra kontrol ve stimülasyon ortamının çalışma konsantrasyonlarını hazırlayın. Kullanmadan önce, medyayı 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Medya koleksiyonu için 96 delikli bir plakayı etiketleyin.Steril bir duman davlumbazının içinde,% 100 birleşen primer preadipositlerin izolasyon

measuring-rate-lipolysis-ex-vivo-murine-adipose-tissue-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yağ dokusu (AT) tüm vücut homeostazını etkileyebilir, bu nedenle adiposit farklılaşması ve fonksiyonunun moleküler mekanizmalarını anlamak önemlidir. İndüklenmiş adiposit apoptozu için bir model olarak adiposit homeostazı, farklılaşması ve hipoksi maruziyetini analiz ederek bu süreçlere yeni bakış açıları kazandırmak için bir protokol sunuyoruz.

Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması

Bu protokol, normal yem diyetinden (NCD) veya yüksek yağlı diyetten (HFD) ± kapsaisin ile beslenen vahşi tipli farelerde elde edilen kasık yağ tabletlerinde bazal ve forkolinin uyardığı lipoliz belirleme metodunu açıklamaktadır. Lipoliz için bir indeks olarak, inguinal yağlı yağ pedlerinden gliserol salınımı ölçülmüştür.

İnguinal Yağ Yastıklarında Basal ve Forskolin ile uyarılmış Lipoliz Ölçümleri

Bu makale, farelerde lipid metabolizmasını değerlendirmek için üç kolay ve erişilebilir test sağlar.

Farelerde Tüm Vücut Lipid Taşıma Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Preadipositler, yenidoğan farelerden alınan interskapular kahverengi yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir ve lipid damlacıkları biriktiren, moleküler belirteçleri eksprese eden ve olgun kahverengi adipositlerin mitokondriyal morfolojisini gösteren hücrelere farklılaşır. Bu hücreler ayrıca immünofloresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilir.

Yenidoğan Farelerden İnterskapular Yağ Dokusunun Stromal Vasküler Fraksiyonundan Kahverengi Adipositlerin Farklılaşması ve Görüntülenmesi

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, insan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC'ler) mikrovasküler endotel hücrelerinin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modelini açıklıyoruz.

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Olgun adipositlerin büyüklüğü ve kırılganlığı, çalışmaları ve izolasyonları için mevcut teknik ve araçları sınırlamıştır. Burada, farklı yağ depoları ve fare diyetleri için kolayca uyarlanabilen olgun murin adipositlerinin izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Ex vivo explant modeli kullanılarak, yağsız farelerden alınan visseral beyaz yağ dokusunun rostral kısmının küçük parçaları 7–10 gün boyunca kültürlenir; bu da yüksek yağlı diyet sırasında meydana gelen yağ dokusu iltihabının indüksiyonu ve incelenmesini mümkün kılar.

Yüksek Yağlı Diyet Benzeri Yağ Dokusu İltihaplanması için Deneyimli Fare Modeli

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Fallop tüpü (FT), seröz over kanseri (SOC) kökenli bir alternatif site olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol izolasyon için yeni bir yöntem açıklanır...

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Keşfedin lipoliz oranlarının ex vivo murin yağ dokusu ve in vitro primer preadipositlerde seri örnekleme ve enzimatik analizlerle ölçülmesi. Bu yöntem metabolik hastalıklarda adipoz doku fonksiyonunu anlamak için kritik öneme sahiptir.

Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet