Name: Ferritinofaji: İnsan Fibroblastlarında Otofaji ile Demirin Seçici Bozunmasının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Keşfedin ferritinofaji yöntemini, insan fibroblastlarında otofaji aracılığıyla demirin seçici bozunmasını değerlendirmek için. Bu teknik, BPAN'da demir homeostazı bozukluğunu anlamak için nicel görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><güçlü>Hücre hatları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Birincil cilt kaynaklı insan fibroblastları&nbsp;</td><td>Deri biyopsisi, sağlıklı insan verici, Biobank Üniversitesi Kliniği T&uuml; bingen, Etik onay 389/2019BO2</td><td>F-CO-60, geçit 9</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Hücre kültürü tedavileri</güçlü></td><td></td><td></td><td><güçlü>Nihai konsantrasyon (bileşik)</güçlü></td></tr><tr><td>Kontrol ortamı</td><td>DMEM %10 FCS</td><td></td> <td>(yalnızca DMSO)</td></tr><tr><td>Kontrol ortamı + bafilomisinA1</td><td>DMEM %10 FCS</td><td></td><td>100 nM bafilomisin A1</td></tr><tr><td>Kontrol ortamı + deferasiox (DFX)</td><td>DMEM% 10 FCS</td><td></td><td>30 ve mikro; M DFX</td></tr><tr><td>Kontrol ortamı + DFX + bafilomisinA1</td><td>DMEM% 10 FCS</td><td></td><td>30 ve mikro; M DFX, 100 nM bafilomisin A1</td></tr><tr><td>Kontrol ortamı + ferrik amonyum sitrat (FAC)</td><td>DMEM% 10 FCS</td><td></td><td>0.05 mg / mL FAC</td></tr><tr><td>Kontrol ortamı + FAC + bafilomisinA1</td><td>DMEM% 10 FCS</td><td></td><td>0.05 mg / mL FAC, 100 nM bafilomisin A1</td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Albümin [BSA] Fraksiyon V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 keçi tavşanı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 keçi a-fare</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-11003</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomisin A1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite Hücre Kültürü ile işlenmiş 10 cm'lik tabaklar</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>Deferasiox (ICL-670)</td> <td>Selleckchem</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS kalsiyum veya magnezyum içermez</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Ferrik amonyum sitrat (FAC)</td><td>Merck</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FERRITIN (İnsan Dalağı)</td><td>Rockland</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18822</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco' s</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.05) fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>ile Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu cam tabanlı # 0 plaka</td><td>Cellvis</td><td>P96-0-N</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 3.7 paraformaldehit (PFA)</td><td></td><td></td> <td>PBS, pH 7.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Bafilomisin A1 100 mM stoğu</td><td></td><td></td> DMSO Ferrik amonyum sitrat (FAC) <td>içinde seyreltilmiş Bafilomisin A1</td></tr><tr><td>100 mg / mL stok</td><td></td><td></td><td>FAC otoklavlanmış çift damıtılmış su</td></tr><tr><td>PBS / T</td><td></td><td></td><td>PBS,% 10 Tween20 ile desteklenmiştir;</td></tr><tr><td>PBS/T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS, %10 Tween20, %1 BSA&nbsp ile desteklenmiş;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad</td><td>Prism Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Sürüm 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ferritinofaji: İnsan fibroblastlarında otofaji ile demirin seçici bozunmasının değerlendirilmesi

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

Sağlıklı donörlerden (Şekil 1A) insan derisinden elde edilen primer fibroblastlar (F-CO-60), baflomisin A1 tedavisi kullanılarak ferritinofaji değerlendirmeleri için hazırlandı, ardından endojen ferritin ve LAMP2'nin immün boyama, otomatik görüntü analizi ve CellProfiler tabanlı analiz yapıldı (Şekil 1B).
Endojen ferritin ve LAMP2'nin kolokalizasyonu, ferritinin lizozomal bozunması, lizozomal V-ATPaz enzimlerini inhibe etme ve dolayısıyla ferritinofaji7'yi bloke etme kabiliyeti ile tutarlı olarak bafilomisin A1 ilavesiyle bloke edildikten sonra artmıştır (Şekil 2). Ek olarak, yazılım tabanlı hücre tanımanın yanı sıra ferritin ve LAMP2 tanıma da örnek olarak gösterilmiştir (Şekil 2).
Bu bağlamda, burada özetlenen CellProfiler boru hattının son derece çok yönlü olduğu ve belirli BPAN mutasyonlarının hücre büyümesi, mitokondri veya fonksiyonel tek hücreli marker sistemleri bağlamında diğer organeller üzerindeki etkilerini değerlendirmek gibi ek ve/veya alternatif okumalara uyarlanabileceği belirtilmelidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> Şekil 1: Deneysel genel bakış. Bu protokolde açıklandığı gibi, (A) ferritinofaji sürecinin ve (B) birincil deri kaynaklı insan fibroblastlarında ferritinofajiyi değerlendirmek için deneysel iş akışının grafiksel gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> Şekil 2: Temsili resimler. Bafilomisin A1'in (A) yokluğunda veya (B) varlığında kontrol ortamında (beslenen koşullarda) birincil deri kaynaklı insan fibroblastları, anti-ferritin ve anti-LAMP2 antikorları kullanılarak dolaylı bir immünofloresan analizine tabi tutulurken, hücre çekirdekleri DAPI ile boyandı. Konfokal lazer taramalı mikroskopi otomasyonu ile elde edilen örnek floresan görüntüler sunulmaktadır (ölçek çubukları: 10 μm). Bafilomisin A1 uygulaması üzerine lizozomal inhibisyon üzerine ferritin ve LAMP2 bolluğu ve kolokalizasyonunda değişiklikler gözlenebilir. Hücre tanıma (mor), çekirdek (mavi), ferritin (yeşil), LAMP2 (kırmızı) ve ferritin/LAMP2 (sarı) punkta'nın yazılımdan türetilmiş görüntü katmanlarını gösteren CellProfiler tabanlı analiz de görüntülenir. (C) Büyütülmüş görüntü bölümleri (ölçek çubuğu = 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan konfokal lazer taramalı mikroskopi ayarları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan sayısal CellProfiler ayarları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Bu çalışmada kullanılan CellProfiler işlem hattı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: CellProfiler işlem hattının ardışık sırayla alınan ekran görüntüleriyle görüntülenmesi (bkz. Ek Dosya 1) (bkz. Tablo 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Ferritinofaji: İnsan Fibroblastlarında Otofaji ile Demirin Seçici Bozunmasının Değerlendirilmesi

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

ferritinophagy-assessing-selective-degradation-iron-autophagy-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kobalt katkılı manyetoferritinin sentezi ve katyizasyonu için bir protokolün yanı sıra kök hücreleri katyonlaştırılmış manyetoferritin ile hızlı bir şekilde manyetize etmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Lipid hidroperoksit içeriği, ferroptotik hücre ölümünün en yaygın kullanılan göstergesini temsil eder. Bu makale, ferroptoz indüksiyonu üzerine hücrelerdeki lipid hidroperoksit içeriğinin adım adım akış sitometrisi analizini göstermektedir.

Medulloblastomun Ferroptotik Fenotipinin Ortaya Çıkarılması

Bu protokol, dokularda, özellikle beyinde demir birikiminin dağılımını ve miktarını değerlendirmek için yöntemler sunar. Protokol, numune hazırlama, Perls/DAB boyama, görüntü yakalama ve veri analizi prosedürlerini detaylandırır.

5xFAD Farelerin Beyinlerinde Demir Birikiminin Perls/DAB Boyama ile Değerlendirilmesi

Bu makale, IMR-90 insan fibroblastlarında yaşlanma sırasında lizozomal yeniden modelleşmeyi ölçmek için canlı hücreli bir LysoTracker protokolünü sunmaktadır.

İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Sıçan karaciğerinden portal fibroblastlar izole etmek için bir yöntem tarif edilmiştir. Karaciğerleri perfüze ve...

Sıçan Portal Fibroblastlar izolasyonu ile<em&gt; Yerinde</em&gt; Karaciğer Perfüzyon

Keşfedin ferritinofaji yöntemini, insan fibroblastlarında otofaji aracılığıyla demirin seçici bozunmasını değerlendirmek için. Bu teknik, BPAN'da demir homeostazı bozukluğunu anlamak için nicel görüntüleme sağlar.

Ferritinofaji: İnsan Fibroblastlarında Otofaji ile Demirin Seçici Bozunmasının Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet