Name: Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Keşfedin: Aromatik amino asitler tarafından düzenlenen hücre metabolizmasını, uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ve iki foton floresans mikroskobu kullanarak canlı hücrelerde yüksek kimyasal özgüllük ve hücre içi çözünürlükle görüntüleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik destekleri için Dr. Yajuan Li ve Anthony Fung'a ve hücre hattı için Fraley laboratuvarına teşekkür ederiz. UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 ve Hellman Fellow Award'dan gelen başlangıç fonlarını kabul ediyoruz.

1. Medya hazırlığı
<ol><li>Dulbecco'nun %50D2O içeren modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) 10 mL kontrol ve fazla AAA hazırlayın.<ol><li>Kontrol ortamı için, 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mg DMEM tozunu 4.7 mL çift damıtılmış su (ddH2O) ile ölçün ve karıştırın. DMEM tozu, standart konsantrasyonlarda tüm amino asitleri içerir. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. 4.7 mLD2O, 0.5 mL fetal sığır serumu (% 5 FBS) ve 0.1 mL penisilin / streptomisin (% 1) ekleyin. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin.</li>
		<li>15x Phe tedavi ortamı için, 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mg DMEM tozunu 4.7 mLddH2O, 0.5 mL FBS (% 5) ve 0.1 mL penisilin / streptomisin (% 1) ile ölçün ve karıştırın. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. Ortama 924 mg/L konsantrasyonda fazla fenilalanin tozu ekleyin. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin.</li>
		<li>15x Tryp tedavi ortamı için, 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mg DMEM tozunu 4.7 mLddH2O, 0.5 mL FBS (% 5) ve 0.1 mL penisilin / streptomisin (% 1) ile ölçün ve karıştırın. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. Ortama 224 mg/L konsantrasyonda fazla Tryp tozu ekleyin. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin.</li>
		<li>Önceki adımların tüm konik tüplerine sırasıyla 30.0 mg / mL ve 95.0 mg / mL'de metiyonin ve treonin ekleyin. Tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. Kültür ortamına sodyum piruvat eklenmesi gerekli değildir.</li>
		<li>Kontrol ve arıtma ortamını 0,22 μm polietersülfon membran filtreli 25 mm'lik bir şırınga filtresi ile filtreleyin.</li>
		<li>Ortam içeren tüm konik tüpleri parafilm ile kapatın ve 4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın. Hücreleri besiyeri ile işlemden önce, tüm besiyerini 37°C'ye ısıtın. NOT: Toz ve sıvı reaktifler, toplam arıtma ve kontrol ortamı hacmine göre ölçülmeli ve birleştirilmelidir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hücre numunesi hazırlama
<ol><li>Rahim ağzı kanseri (HeLa) hücrelerini bir kültür şişesinde (yani, T10, T25, vb.), 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ve% 5 karbondioksit (CO2) ile desteklenmiş standart DMEM kullanarak.</li>
	<li>HeLa hücrelerini% 80 veya daha yüksek hücre canlılığına ulaşana kadar 1:10'luk bir bölünme oranında alt kültürleyin.</li>
	<li>Hücreler% 80 veya daha yüksek birleşme elde ettiğinde,% 0.5 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanarak 24 oyuklu bir plaka üzerine oyuk başına 2 x 105 hücre tohumlamaya devam edin.<ol><li>Hücre tohumlamadan önce, sterilize edilmiş, poli-d-lizin, laminin kaplı, yuvarlak lameller, 12 mm çapında 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Lamelleri %70 etanole batırın ve tüy bırakmayan mendiller kullanarak nazikçe kurulayın. Temiz lamelleri plakanın uygun kuyularına yerleştirin.</li>
		<li>Hücreler adım 2.2'de% 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri bir kez magnezyum ve kalsiyum iyonları içermeyen 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
		<li>Yapışan hücreleri şişeden ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 3 dakika inkübe edin.</li>
		<li>%10 FBS ve %1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM ekleyin, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri 3 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) 300 x g'da santrifüjleme ile toplayın.</li>
		<li>% 0.5 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Bir hemositometre, ışık mikroskobu ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın ve 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 x 105 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Alternatif olarak, hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanılabilir.</li>
		<li>Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre geri koyun ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın.</li>
	</ol></li>
	<li>8 saat sonra, eski kültür ortamını %50 D2O/fazla Phe veya %50D2O/fazla Tryp besiyeri ile değiştirin. Hücreleri 36 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübatöre geri koyun.</li>
	<li>36 saat sonra, hücreleri mikroskop slaytlarına sabitleyin.<ol><li>Sabitlemeden önce, 9 mm çapında görüntüleme ara parçalarına sahip mikroskop slaytları hazırlayın ve kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 15 μL 1x PBS yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 1x PBS ile durulayın.</li>
		<li>0,5 mL %4 metanol içermeyen paraformaldehit (PFA) çözeltisi ekleyin ve plakayı yaklaşık 15 dakika biyogüvenlik başlığının altında bırakın.</li>
		<li>PFA solüsyonunu aspire edin ve iki kez kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 1x PBS ile durulayın.</li>
		<li>Her oyuğa kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 1.5 mL 1x PBS ekleyin.</li>
		<li>Lamelleri her bir kuyucuktan nazikçe çıkarmak için steril cımbız kullanın. Adım 2.5.1'de hazırlanan PBS ile temas etmek için lamellerin hücre içeren tarafını ters çevirin ve görüntüleme ara parçalarına yerleştirin. Hücre içermeyen tarafın havaya maruz kaldığından emin olun.</li>
		<li>Şeffaf oje kullanarak, lamel dış tabakasını görüntüleme ara parçasıyla kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroskop slaytlarını görüntüleme yapmadığınız zamanlarda 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. Spontan Raman spektroskopisi ölçümü (Şekil 2)
<ol><li>Spontan Raman spektrumları elde etmek için konfokal Raman mikroskobu kullanın (Şekil 2A).</li>
	<li>Anahtarı AÇIK konuma çevirerek lazeri açın.</li>
	<li>Edinme yazılımını açmak için LabSpec6 yazılım simgesine çift tıklayın.</li>
	<li>Biyolojik numuneyi doğrudan objektif merceğin altındaki numune tutucuya yükleyin.</li>
	<li>Yazılımda, Kamera Video kamerayı açmak için simge .</li>
	<li>50x objektif lens ile ilgilenilen bir bölgeyi belirlemek için odak düzlemini ayarlayın. XY aşamasının planya çevirisini kontrol etmek için joystick'i hareket ettirin ve odak derinliğini değiştirmek için joystick'i döndürün.</li>
	<li>Ölçüm konumunu seçtikten sonra, 40 mW uyarma gücüne sahip 100x objektif merceğe geçin. Video kamerayı kapatmak için kırmızı Durdur simgesine tıklayın.</li>
	<li>1800 satır/mm'lik bir ızgara seçin ve alım aralığını 400 cm-1 ila 3.150 cm-1 arasında ayarlayın.</li>
	<li>En az gürültü ve en doğru spektrum için Alım Süresini 90 s'ye, Biriktirmeyi 3'e ve Binning'i 4'e ayarlayın. NOT: Bu görüntüleme parametreleri, deneye uyacak şekilde optimize edilebilir.</li>
	<li>Gerçek zamanlı ekranı açmak için Ok simgesine tıklayın.</li>
	<li>Netleme düzleminde ince ayar yapmak için Raman kaymasını (cm-1) tercih ettiğiniz bir değere ayarlayın. NOT: Bu deneyde, Raman lazeri, yüksek konsantrasyondaCH2 bağı içeren lipid damlacıklarına odaklandı. Bu nedenle, amaç içinCH2 bağının germe modlarına uyan 2.850 cm-1'lik bir Raman kayması seçilmiştir.</li>
	<li>En iyi sinyal-gürültü oranını optimize etmek için odak düzlemini joystick ile ayarlayın.</li>
	<li>Odak düzlemini seçtikten sonra, gerçek zamanlı bir görüntü için kırmızı Durdur simgesine tıklayın.</li>
	<li>Spektrum alımını başlatmak için Daire simgesini seçin.</li>
	<li>Hücresel bölge alındıktan sonra, PBS ile arka planı ölçmek için aynı odak düzlemini kullanın. Origin gibi ayrı bir bilgisayar yazılımı uygulaması kullanarak her bir hücre altı hedef spektrumundan arka plan spektrumunu çıkarın (Şekil 1B).</li>
</ol>4. 2PEF ve SRS ile görüntüleme deneyleri
NOT: SRS lazer hizalamasının ayrıntılı açıklamaları önceki bir rapordabulunabilir 28. Bu protokol, multimodal bir SRS ve 2PEF görüntüleme sisteminin çalışmasına odaklanır (Şekil 2C, D).
<ol><li>Lazeri ısıtmak için Başlat'a tıklayın.</li>
	<li>Kontrol ünitesinin ve monitörün ana anahtarlarını açık konuma getirmek için sırayı izleyin: 1) IX3-CBH kontrol kutusunun ana şalterini Açık konumuna getirin, 2) dokunmatik panel denetleyicisinin ana şalterini Açık konumuna getirin, 3) ana lazer birleştirici FV31-SCOMB'a bağlı LD OBIS 6 Lazer Uzaktan Kumanda için güç kaynağının AC adaptörünün ana şalterine basınve 4) alt lazer birleştirici FV6-SCOMB'a bağlı LD OBIS 31 Lazer Uzaktan Kumanda güç kaynağının AC adaptörünün ana şalterini Açık konumuna getirin.</li>
	<li>Si fotodiyot dedektörünün ana anahtarlarına basın ve kilitlenin amplifier Açık.</li>
	<li>Stokes Işınını 1,031 nm'ye, Darbe Genişliğini 6 ps'ye ve Tekrarlama Hızını 80 MHz'e ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskoba bağlandığında, senkronize pompa ışını ile birlikte verilen picoEmerald sistemini 720-990 nm arasında Ayarlanabilir Dalga Boyu , 5-6 ps Darbe Genişliği ve 80 MHz Tekrarlama Hızı ile ayarlayın. Hem pompanın hem de Stokes'un ortalama uyarma gücü 450 mW'dir. Numune için fotohasarı en aza indirmek için uyarma gücünü optimize edin.</li>
	<li>Kondansatör üzerine birkaç damla yayarak numunenin monte edildiği Stokes ve pompa kirişlerini toplamak için yüksek sayısal açıklıklı (NA) bir yağ kondansatörü (yani 1.4 NA) kullanın.</li>
	<li>Numuneyi yağın üzerine monte edin ve numunenin sabitlendiği mikroskop lamının üzerine büyük bir su damlası yerleştirin. Bu, suya daldırma objektif lensi içindir.</li>
	<li>Kilitli amplifikatörü 20 MHz'e ayarlayın. Süper çözünürlüklü yazılım modülünü kullanarak görüntüyü şimdi işleyin.</li>
	<li>Bekleme süresi için 512 piksel x 512 piksel ve 80 μs/piksel seçin.</li>
	<li>İstenen hücresel bölge düzgün bir şekilde odaklandıktan sonra görüntüyü elde edin. Mikroskobun toplama yazılımını kullanarak görüntüleri bir Olympus .oir grafik dosyası olarak kaydedin.</li>
	<li>1.900 cm-1'de bir arka plan görüntüsü elde edin ve bunu tüm hücresel görüntülerden çıkarın.</li>
	<li>2PEF görüntüleme yapmak için aynı ayarlanabilir pikosaniye lazeri kullanın ve Flavin ve NADH'nin etiketsiz otofloresansını sırasıyla 800 nm ve 780 nm'ye ayarlayın.</li>
	<li>Flavin ve NADH otofloresan geri saçılan emisyonu toplamak için 460 nm/515 nm filtre küpü kullanın.</li>
	<li>Bekleme süresini 8 μs/piksel ve piksel boyutunu 512 piksel x 512 piksel olarak ayarlayın. Lazer deklanşör gücü parametresini 150 mW olarak ayarlayın.</li>
	<li>3D görüntü rekonstrüksiyonu için, uyarılmış Raman kaybını 2.850 cm-1 (797 nm) olarak ayarlayın.</li>
	<li>İstenen tek hücreler tanımlandıktan sonra, bu hücrelerin üst ve alt katmanlarını tespit etmek için üst odak düzleminden taramak için lazeri kaydedin. NOT: 3B modeller .oir dosyaları olarak oluşturulur ve kaydedilir.</li>
</ol>5. Spektrum ve görüntü analizi
<ol><li>Spektrum analizi<ol><li>Arka plan spektrumunu tüm hücre altı hedef spektrumlarından çıkarmak için Origin yazılımını veya diğer ilgili uygulamaları kullanın.</li>
		<li>Yazılımın yerleşik işlevleriyle Raman spektrumlarını işlemek için MATLAB'ın matematiksel modelleme işlemlerini kullanın. Python, spektrum işleme için de kullanılabilir.<ol><li>Spektral ön işleme, dosyaların bir diziye dönüştürülmesiyle başlar. Spektrumlar her karşılıklı santimetrede enterpolasyonludur.</li>
			<li>Doğrulama için ham verilerin grafiğini oluşturun. MATLAB'daki yerleşik msbackadj işlevini kullanarak ham spektrumlar üzerinde taban çizgisi düzeltmesini gerçekleştirin. Kısaca, yerleşik işlev, kullanıcılar tarafından tanımlanan ayırma birimi değerlerinde temel noktaları tahmin eder ve bitişik pencereler arasındaki mesafeyi döndürür. Taban çizgisi noktalarından bir regresyon çizgisi tahmin edin ve çizin. Taban çizgisini her bir ham spektrumdan çıkarmak için regresyon çizgisini yumuşatmak için Yumuşatma uygulayın.</li>
			<li>Proteinin 2.930 cm'deki Raman yoğunluğunu bölerek min-maks normalizasyonu gerçekleştirin.-1 her Raman kaymasının yoğunluğuna. 2.930 cm-1 sinyali tipik olarak Raman spektrumundaki en yüksek yoğunluktur. Bu normalleştirme ile maksimum değer 1'e, minimum değer ise 0'a dönüştürülür. Diğer tüm değerler 0 ile 1 arasında bir ondalık sayıya dönüştürülür.</li>
			<li>Gürültüyü azaltmak için aynı koşulun bireysel spektrumlarını tek bir spektrumda ortalamasını alın.</li>
		</ol></li>
		<li>İşlendikten sonra, tüm spektrumları aynı anda görüntülemek için Origin gibi uygulamaları kullanın. Spektrumlarda görüntülenen tepe noktaları, belirli bir kimyasal bağı veya fonksiyonel grubu temsil eder.</li>
	</ol></li>
	<li>Lipid damlacıklarının 3D görüntü analizi<ol><li>Tüm 3D görüntüleri işlemek için FIJI-ImageJ yazılımını kullanın</li>
		<li>3D görüntü yığınları için Bant Geçiren Filtreler ve Yumuşatma işlevlerini gerçekleştirin.</li>
		<li>3D görüntü analizi için, her bir lipit damlacığını, kütle merkezi ile yüzey arasındaki mesafeyi ölçerek hesaplanan küresel bir puana atayın. Her küresel puanı, aynı Öklid planındaki mükemmel bir kürenin küresel puanıyla karşılaştırın. Düşük küresel puanlara sahip lipid damlacıklarını atın ve kalan lipid damlacıklarını hacimleri ve sayıları açısından değerlendirin.</li>
		<li>Uygun bir istatistiksel yazılım uygulamasında istatistiksel anlamlılık için farklı tedaviler arasındaki lipit damlacıklarının hacmini ve sayısını analiz edin. Burada GraphPad Prism kullanılmıştır.</li>
	</ol></li>
	<li>2D hiperspektral görüntü analizi<ol><li>Tüm 2D hiperspektral görüntüleri işlemek için FIJI-ImageJ yazılımını kullanın.</li>
		<li>0 ve 1 değerlerini içeren bir maske görüntüsü oluşturmak için 2.930 cm-1 kanalını seçin. Arka planı 0'a ve hücresel bölgeyi 1'e atayın.</li>
		<li>Floresan etkilerini ortadan kaldırmak için döteryum etiketli protein kanalını (2,175 cm-1) arka plan kanalına (1,900 cm-1) çıkarın.</li>
		<li>Elde edilen döteryum etiketli protein kanalını protein kanalına (2,930 cm-1) bölün ve protein devir hızı oranı metrik görüntüleri elde edin.</li>
		<li>Ardından, kalan arka plan seslerini gidermek için adım 5.3.2'de yapılan maske görüntüsünü oran görüntüleriyle çarpın. Sonuç olarak, her oran görüntüsünde koyu bir arka plan oluşturulur.</li>
		<li>Tek hücrelerde görüntülenen piksel yoğunluklarını manuel olarak segmentlere ayırmak ve hesaplamak için FIJI-ImageJ'deki Serbest El Seçimi aracını kullanın. Piksel yoğunlukları, görselleştirilen kimyasal bağın konsantrasyonlarına karşılık gelir.</li>
		<li>Uygun bir istatistiksel yazılım uygulamasında istatistiksel anlamlılık için piksel yoğunluklarını analiz edin. Burada GraphPad Prism kullanılmıştır. Bu analizi kalan oran analizi ile tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amino+acids+in+nutrition+and+health%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Functional amino acids in nutrition and health.</a> Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).</li>
<li>Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+amino+acids+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of amino acids in cancer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).</li>
<li>Parthasarathy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-ring+circus%3A+Metabolism+of+the+three+proteogenic+aromatic+amino+acids+and+their+role+in+the+health+of+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l-tryptophan+activates+mammalian+target+of+rapamycin+and+enhances+expression+of+tight+junction+proteins+in+intestinal+porcine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells.</a> The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
<li>Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signalling+and+cellular+metabolism+are+mutual+determinants+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).</li>
<li>Kimura, T., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+protects+hepatocytes+against+reactive+oxygen+species-dependent+cell+death+via+multiple+pathways+including+Nrf2-dependent+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction.</a> Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+supplementation+with+aromatic+amino+acids+decreased+triglycerides+and+alleviated+hepatic+steatosis+by+stimulating+bile+acid+synthesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Function%22%5BJournal%5D)">Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice.</a> Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+implications+of+natural+compounds+targeting+lipid+metabolism+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%2C+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).</li>
<li>Lubes, G., Goodarzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+based+metabolomics+used+for+the+identification+of+cancer+volatile+organic+compounds+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).</li>
<li>Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+metabolic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">The potential of metabolic imaging.</a> Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).</li>
<li>Bowman, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lipid+coverage+and+high+spatial+resolution+MALDI-imaging+capabilities+of+oversampling+combined+with+laser+post-ionisation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).</li>
<li>Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+lipid+species+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry.</a> Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).</li>
<li>Pirman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cancer+cell+metabolism+revealed+by+direct+sample+analysis+with+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), e61379(2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lipidomics+with+high+structural+specificity+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry.</a> Nature Communications. 12 (1), 2869(2021).</li>
<li>Miyagi, M., Kasumov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+synthesis+of+biomolecules+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions.+Series+A%2C+Mathematical%2C+Physical+and+Engineering+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry.</a> Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378(2016).</li>
<li>Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+recognition+of+sphingomyelin-rich+membrane+domains+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).</li>
<li>Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+and+tissue+imaging+using+Raman+and+coherent+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501(2020).</li>
<li>Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stimulated+Raman+scattering+imaging+for+tissues+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Imaging+in+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals.</a> Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).</li>
<li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+EdU%2C+an+alkyne-tagged+cell+proliferation+probe%2C+by+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+metabolic+dynamics+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of metabolic dynamics in animals.</a> Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).</li>
<li>Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cancer+cell+metabolic+dynamics+regulated+with+aromatic+amino+acids+using+DO-SRS+and+2PEF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702(2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+lipid+metabolic+changes+in+drosophila+ovary+during+aging+using+DO-SRS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy.</a> Frontiers in Aging. 2, 819903(2022).</li>
<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+metabolic+dynamics+in+aging+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila.</a> Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Fung, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+sub-cellular+methionine+and+insulin+interplay+in+triple+negative+breast+cancer+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism.</a> Frontiers in Oncology. 12, 858017(2022).</li>
<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+diet+regulated+metabolic+activities+in+Drosophila+during+aging+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes.</a> Aging Cell. 21 (4), e13586(2022).</li>
<li>Shi, L., Wei, M., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-multiplexed+tissue+imaging+with+raman+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).</li>
<li>Rysman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+lipogenesis+protects+cancer+cells+from+free+radicals+and+chemotherapeutics+by+promoting+membrane+lipid+saturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation.</a> Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).</li>
<li>Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lipid+class+homeostasis+is+altered+under+nutrient-deprivation+but+stable+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia.</a> BMC Cancer. 19 (1), 501(2019).</li>
<li>Thiam, A. R., Dugail, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-membrane+contact+sites+-+from+protein+binding+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function.</a> Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).</li>
<li>Schott, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+size+directs+lipolysis+and+lipophagy+catabolism+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).</li>
<li>Hoang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+resolution+DO-SRS+and+2PEF+imaging+of+metabolic+dynamics+regulated+by+L-methionine+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Biopsy+XXI%3A+Toward+Real-Time+Spectroscopic+Imaging+and+Diagnosis.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+A-PoD%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+metabolic+imaging+uncovers+sex-+and+diet-dependent+lipid+changes+in+aging+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-molecular+hyperspectral+PRM-SRS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Chang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+cell+metabolism+and+lipid+production+in+3D+engineered+human+adipose+tissues+using+label-free+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy.</a> Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).</li>
<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

DO-SRS ve 2PEF görüntüleme, Drosophila ve insan dokuları 21,22,23,24,26,27,33 dahil olmak üzere çeşitli ex vivo modellerde metabolik dinamikleri araştırmak için uygulanmıştır. Bu çalışmada kullanılan görüntüleme yöntemi, molekül ekstraksiyonu veya sitotoksik reaktiflerle etiketleme ...

Esansiyel aromatik amino asitler (AAA'lar), fenilalanin (Phe) ve triptofan (Trip), normal biyolojik fonksiyonları sürdürmek için yeni moleküller sentezlemek üzere insan vücudu tarafından emilebilir1. Fenilalan, proteinler, melanin ve tirozin sentezi için gereklidir, Tryp ise melatonin, serotonin ve niasin 2,3 sentezi için gereklidir. Bununla birlikte, bu AAA'ların aşırı tüketimi, rapamisin (mTOR) yolunun memeli hedefini yukarı regüle edebilir, AMP ile aktive olan protein kinazını inhibe edebilir ve mitokondriyal metabolizmaya müdahale ederek makromolekül biyosentezini toplu olarak değiştirebilir ve sağlıklı hücrelerde reaktif oksijen türleri (ROS) gibi malign öncüllerin üretimine yol açabilir 4,5,6. Aşırı AAA düzenlemesi altında değişen metabolik dinamiklerin doğrudan görselleştirilmesi, AAA'ların kanser gelişimini ve sağlıklı hücrelerin büyümesini teşvik etmedeki rollerini anlamak için gereklidir 7,8,9.
Geleneksel AAA çalışmaları gaz kromatografisine (GC)10 dayanır. Manyetik rezonans görüntüleme (MRI) gibi diğer yöntemler, sınırlı uzamsal çözünürlüklere sahiptir ve bu da biyolojik örneklerin hücresel ve hücre altı analizini gerçekleştirmeyi zorlaştırır11. Son zamanlarda, noninvaziv biyobelirteçler12,13,14 ile kanser proliferasyonunda lipid ve protein sentezlerinde AAA'ların rolünü aydınlatmak için matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu teknik hala sığ görüntüleme derinliklerinden, zayıf uzamsal çözünürlükten ve kapsamlı numune hazırlığından muzdariptir. Hücresel düzeyde, nitrojen-15 ve karbon-13 gibi toksik olmayan kararlı izotoplar, makromoleküllere dahil edilmelerini anlamak için çoklu izotop görüntüleme ve nano ölçekli ikincil iyon kütle spektrometrisi ile izlenebilir. Ancak bu yöntemler canlı biyolojik örneklere zarar vermektedir15,16. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), metabolik dinamikleri görselleştirebilen bir başka güçlü tekniktir17. Öte yandan, AFM görüntüleme sırasında yavaş tarama hızı, termal sapmadan kaynaklanan görüntünün bozulmasına neden olabilir.
Döteryum-oksit (D2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu ve etiketsiz iki foton uyarma floresan mikroskobunun (2PEF) birleştirilmesiyle noninvaziv bir biortogonal görüntüleme modalitesi geliştirdik. Bu modalite, biyolojik numunelerigörüntülerken yüksek bir uzamsal çözünürlük ve kimyasal özgüllük sağlar 18,19,20,21,22,23,24. Bu protokol, kanser ilerlemeleri sırasında lipitlerin, proteinlerin ve redoks oranı değişikliklerinin metabolik dinamiklerini incelemek için DO-SRS ve 2PEF uygulamalarını tanıtmaktadır. D2O'nun kararlı bir izotop su formu olmasıyla, hücresel biyomoleküller, hücrelerdeki toplam vücut suyu ile hızlı bir şekilde dengelenmesi nedeniyle döteryum (D) ile etiketlenebilir ve enzimatik değişim yoluyla karbon-döteryum (C-D) bağları oluşturur21. Lipitler, proteinler, DNA/RNA ve karbonhidratlar dahil olmak üzere yeni sentezlenen makromoleküllerdeki C-D bağları, Raman spektrumunun hücre sessiz bölgesinde 20,21,22,25,26,27 tespit edilebilir. İki senkronize lazer darbesiyle, yeni sentezlenen lipitlerin ve proteinlerin C-D bağları, sitotoksik ajanlarla ekstrakte edilmeden veya etiketlenmeden hiperspektral görüntüleme (HSI) yoluyla tek hücreler üzerinde görüntülenebilir. Ek olarak, SRS mikroskobu, bir dizi kesit görüntüsünü yakalayarak ve birleştirerek biyolojik örneklerde seçilen ilgi alanlarının üç boyutlu (3D) modellerini oluşturma yeteneğine sahiptir22,26. Hiperspektral ve 3D hacimsel görüntüleme ile DO-SRS, AAA düzenlemesi22 kapsamında kanser büyümesini teşvik etme sürecini kolaylaştıran organel türleri ile birlikte tek hücrelerde yeni sentezlenen makromoleküllerin uzamsal dağılımlarını elde edebilir. Ayrıca, 2PEF kullanarak, biyolojik örneklerde yüksek çözünürlüklü, derin penetrasyon derinliği ve düşük seviyeli hasara sahip Flavin ve nikotinamid adenin dinükleotidinin (NADH) otofloresan sinyallerini elde edebiliriz21,23,24. Flavin ve NADH otofloresan sinyalleri, kanser hücrelerinde redoks homeostazını ve lipid peroksidasyonunu karakterize etmek için kullanılmıştır22,26. Bu nedenle, DO-SRS ve 2PEF'in birleştirilmesi, yüksek uzamsal dağılım, kimyasal özgüllük bilgisi ve minimum numune hazırlığı ile kanser hücrelerinde AAA tarafından düzenlenen metabolik dinamiklerin hücre altı analizini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda endojen moleküllerin toksik reaktiflerle ekstrakte edilmesi veya etiketlenmesi ihtiyacını da azaltır. Bu protokolde ilk olarakD2Ove amino asit hazırlama prosedürlerinin yanı sıra kanser hücre kültürü de sunulmaktadır. Daha sonra DO-SRS görüntüleme ve 2PEF görüntüleme protokollerini gösteriyoruz. Son olarak, lipid ve proteinin AAA tarafından düzenlenen metabolik değişikliklerini ve kanser hücrelerinde redoks oranı değişikliklerini gösteren SRS ve 2PEF görüntülemenin temsili sonuçlarını sunuyoruz. İşlemin ayrıntılı bir gösterimi Şekil 1'de vurgulanmıştır.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serolojik Pipetler&nbsp;</td><td>Avantor (VWR tarafından)</td><td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>15 mL Konik Santrifüj Tüpü</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 %16 Formaldehit, Metanol içermez</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 24 kuyulu plaka</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0112929</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929</td></tr><tr><td>25 mm Şırınga Filtresi, 2 &mu; m PES</td><td>Foxx Yaşam Bilimleri</td><td>381-2216-OEM</td><td></td></tr><tr><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 460 nm Filtre Küpü</td><td>Olympus</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>LD OBIS 6 Lazer Uzaktan Kumanda için Güç Kaynağı AC Adaptörleri</td><td>Olympus</td><td></td><td>Lazere güç sağlayın</td></tr><tr><td>Bant Geçiren Filtre</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>BNC 50 Ohm Sonlandırıcı&nbsp;</td><td>Mini Devreler</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNC Kablosu</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>Koaksiyel Kablo, BNC Erkek/Erkek</td></tr><tr><td>Geniş Bant Dielektrik Ayna</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kondenser</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı</td><td>Corning</td><td>2850-25</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25</td></tr><tr><td>DC güç kaynağı</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik Dağı</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit Hücre Kültürü Reaktifi</td><td>mpbio&nbsp;</td><td>196055</td><td>https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartalı' Metiyonin, Treonin ve Sodyum Piruvat İçermeyen Ortam</td><td>MilliporeSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Sodyum Bikarbonat ile ve Metiyonin, Treonin ve Sodyum Pirüvat içermez&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta Corning</td><td></td><td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>Sürüm 1.53t 24 Ağustos 2022</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Ağır Su (Döteryum Oksit)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>Hela Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2</td></tr><tr><td>Hemosimetre</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>Yüksek OD Bant Geçiren Filtre</td><td>Renk Teknolojisi</td><td>ET890/220m</td><td>Stokes ışınını filtreleyin ve pompa ışınını iletin</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone Tripsin% 0.25 (1x) Çözüm</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445</td></tr><tr><td>Entegre SRS Lazer Sistemi</td><td>Uygulamalı Fizik & Elektronik A.Ş.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD, 6 ps darbe genişliği ve 80 MHz tekrarlama oranı ile 1031 nm'de bir çıkış darbesi sağlar ve bu da Stokes ışını olarak işlev görür. 532 nm'de frekans iki katına çıkarılan ışın, beş ~ 6 ps darbe genişliğine sahip mod kilitli bir darbe dizisi üretmek için bir pikosaniye optik parametrik osilatörü (OPO) eşzamanlı olarak tohumlamak için kullanılır (OPO'nun avara ışını bir, interferometrik filtre ile bloke edilir). OPO'nun çıkış dalga boyu 720&ndash arasında ayarlanabilir; Pompa ışını olarak görev yapan 950 nm. 1031 nm Stokes ışınının yoğunluğu, %90'dan fazla modülasyon derinliği ile 8 MHz'de yerleşik bir EOM tarafından sinüzoidal olarak modüle edilir. Pompa ışını, picoEMERALD içinde dikroik bir ayna kullanılarak Stokes ışını ile uzamsal olarak üst üste bindirilir. Pompa ve Stokes darbeleri arasındaki zamansal örtüşme, yerleşik bir gecikme aşaması ile elde edilir ve mikroskopta saf D2O'nun SRS sinyali ile optimize edilir.</td></tr><tr><td>Ters Çevrilmiş Lazer Tarama Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>IX3-CBH Kontrol kutusu</td><td>Olympus</td><td></td><td>Lazer tarama mikroskobunu kontrol</td></tr> edin <tr><td>Kinematik Ayna Montajı</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 Düşük Profilli Altıgen Ayarlayıcı</td></tr><tr><td>L-Phenalynine</td><td>Sigma</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-Triptofan</td><td>Sigma</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/</td></tr> <tr><td>Kilitli Amplifier</td><td>Zürih Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier</td></tr><tr><td>Uzun Geçişli Dikroik Işın Ayırıcı</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm lazer BrightLine tek kenarlı lazer-düz dikroik ışın ayırıcı</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Sürüm: R2022b</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html</td></tr><tr><td>Mikroskobu Slaytları</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-003</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003</td></tr><tr><td>Mikroskopi Görüntüleme Yazılımı</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>MPLN 100x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364</td></tr><tr><td>MPLN 50x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON&nbsp;</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[odak]=cmsContent11363</td></tr><tr><td>NA Yağ Kondenseri</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>6-U130</td><td>https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser</td></tr><tr><td>Oje</td><td>Islak n Vahşi</td><td>B01EO2G5O4</td><td>https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0</td></tr><tr><td>Menşei</td><td>OriginLab</td><td>Menşei 2022b (9.95)</td><td>https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782</td></tr><tr><td>PBS 1x (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu)</td><td>Thermofischer - Gibco</td><td>14040117</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Termofischer - Gibco</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Periskop Montajı</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>Üst ve alt üniteleri içerir, & Oslash; 1 "direk ve sıkıştırma çatalı.</td></tr><tr><td>picoEmerald System</td><td>A.P.E</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ <tr><td>BNC Konnektörlü Korumalı Kutu</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>Kapaklı Alüminyum Kutu, BNC Dişi/Dişi</td></tr><tr><td>Si Fotodiyot Dedektörü</td><td>Ev Yapımı</td><td>N/A</td><td>DYI serisi</td></tr><tr><td>Silikon Gofret</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ara Parçaları</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/</td></tr> <tr><td>Spontan Raman spektroskopisi</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/</td></tr> <tr><td>Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobu</td><td>Ev Yapımı</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Dokunma&nbsp; Panel Kontrol Cihazı</td><td>Olympus</td><td></td><td>Lazer tarama mikroskobunun XY yönünü kontrol</td></tr> edin <tr><td>Tripan Mavisi %0,4 (%0,85 NaCl)&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Kaverme - Amazon</td><td>B07RNVXXV1</td><td>https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"</td></tr><tr><td>İki Foton Uyarma Floresan Mikroskobu</td><td>Ev Yapımı</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Tartı Kağıdı&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper</td></tr><tr><td>Zürih LabOneQ Yazılımı</td><td>Zürih Aletleri</td><td></td><td>Zürih kilitli amplifikatörü kontrol edin</td></tr></tbody></table>

aromatik amino asitler tarafından düzenlenen hücre metabolizmasının biyoortogonal kimyasal görüntülenmesi

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Esansiyel aromatik amino asitler (AAA'lar), hücrelerde yeni biyokütlelerin sentezlenmesi ve normal biyolojik fonksiyonların sürdürülmesi için yapı taşlarıdır. Örneğin, kanser hücrelerinin hızlı büyümelerini ve bölünmelerini sürdürmeleri için bol miktarda AAA kaynağı önemlidir. Bununla birlikte, hücrelerin yerinde metabolizmaları için AAA'lardan nasıl yararlandığını doğrudan görselleştirmek için minimum numune hazırlığı ile son derece spesifik, noninvaziv bir görüntüleme yaklaşımına yönelik artan bir talep vardır. Burada, döteryum oksit (D2O) sondalamasını uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) ile birleştiren ve DO-SRS'yi iki fotonlu uyarma floresansı (2PEF) ile entegre eden bir optik görüntüleme platformu geliştiriyoruz. Toplu olarak, DO-SRS platformu, tek HeLa hücre birimlerinde yeni sentezlenen proteinlerin ve lipitlerin yüksek uzamsal çözünürlüğünü ve özgüllüğünü sağlar. Ek olarak, 2PEF modalitesi, nikotinamid adenin dinükleotidi (NADH) ve Flavin'in otofloresan sinyallerini etiketsiz bir şekilde tespit edebilir. Burada açıklanan görüntüleme sistemi, çeşitli deneyler için esnek olan hem in vitro hem de in vivo modellerle uyumludur. Bu protokolün genel iş akışı, hücre kültürü, kültür ortamı hazırlama, hücre senkronizasyonu, hücre fiksasyonu ve DO-SRS ve 2PEF modaliteleri ile numune görüntülemeyi içerir.

PD2O içeren hücre kültürü ortamına 15x konsantrasyonda fazla AAA'ların eklenmesi, HeLa hücrelerinde yeni sentezlenen lipitlerin ve proteinlerin farklı C-D Raman bantlarını üretti (Şekil 2B). Önceki deneyler, 2x ve 5x gibi farklı konsantrasyon seviyelerinde gerçekleştirildi ve veriler sunulmamasına rağmen, 15x konsantrasyonu, yeni sentezlenen lipitlerin ve proteinlerin en belirgin C-D Raman bantlarını üretti. Spesifik olarak, lipid damlacıklarını (LD'ler) araştırarak, hem 15x Phe h...

İki foton uyarma floresan mikroskobu (2PEF) ile entegre olan döteryum-oksit (ağır suD2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu kullanılarak amino asitler tarafından düzenlenen hücrelerdeki metabolik aktiviteleri doğrudan görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Etiketsiz özelliği, yüksek kimyasal özgüllüğü ve hücre altı çözünürlüğü ile yeni bir görüntüleme tekniği sergiliyoruz. Metodolojimiz, yaşlanmada metabolik işlev bozukluğu ve kanser gibi hastalıklarla ilgili soruları yanıtlayabilir Raman görüntüleme, iki foton floresan ve ikinci harmonik üretimi ile birleştiğinde, minimum numune hazırlığı gerektiren ve hücre örneğine zarar vermeden yüksek hücre altı çözünürlük elde eden, tahribatsız ve etiketsiz bir görüntüleme teknolojisi sunar. Platformumuzun bir parçası olarak çeşitli görüntüleme yöntemleri çalıştırılmaktadır.Bireyler, sistemimizin ev yapımı olduğunu belirterek protokolümüzü ellerinden gelen en iyi şekilde takip etmelidir. Yol boyunca başarıyı sağlamak için kendi uygulamalarını geliştirmelidirler. İki ayrı tüpte, 15 mL'lik konik bir tüpte 10 miligram DMEM tozunu 4.7 mililitre çift damıtılmış su ile ölçüp karıştırarak başlayın.Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. Her iki tüp için, tüpü girdaplamadan ve ters çevirmeden önce 4.7 mL döteryum oksit, 0.5 mL FBS ve 0.1 mL penisilin ve streptomisin ekleyin. Daha sonra, bir tüpe fazla fenilalanin ve ikinci tüpe fazla triptofan tozu ekleyin ve tekrar karıştırın.Her iki tüpe sırasıyla mL başına 30 ve 95 mg metiyonin ve treonin ekleyin, ardından tüpü girdaplayın ve ters çevirin. Daha sonra, hazırlanan ortamı 0.22 mikrometre filtreli 25 milimetrelik bir şırınga filtresi ile filtreleyin. Konik tüpler içeren tüm ortamları Parafilm ile kapatın.Hazırlanan medyayı dört santigrat derecede saklayın. %10 FBS, %1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş standart DMEM kullanarak şifacı hücreleri bir kültür şişesinde tutun. Şifacı hücreleri% 80 veya daha yüksek hücre canlılığına ulaşana kadar bir ila 10 arasında bir bölünme oranında alt kültürleyin.Hücreleri tohumlamadan önce, sterilize edilmiş Poli-D-Lizin, laminin kaplı, yuvarlak 12 mm çaplı örtü astarlarını %70 Etanole batırın. Tüy bırakmayan mendiller kullanarak kapak fişlerini kurutun ve temiz kapak fişlerini plakanın uygun kuyularına yerleştirin. Hücreleri bir kez magnezyum ve kalsiyum iyonları olmadan PBS ile yıkayın.Yapışma hücrelerini şişeden ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra hücrelere %10 FBS, %1 penisilin ve streptomisin ile takviye edilmiş DMEM ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.Hücreleri, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyerek toplayın. Daha sonra,% 0.5 FBS ve% 1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş DMEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin. Işık mikroskobu altında bir hemositometre kullanarak tripan mavisi leke hücrelerini sayın ve 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına iki kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda tohumlayın.Plakayı hafifçe sallayarak hücreleri eşit olarak dağıtın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Sekiz saat sonra, eski kültür ortamını %50 döteryum oksit ve fazla fenilalanin veya %50 döteryum oksit ve fazla triptofan ortamı ile değiştirin.Hücreleri 36 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre geri koyun. Şimdi dokuz mm çapında görüntüleme boşlukları olan mikroskop slaytları hazırlayın. Kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 15 mikrolitre PBS yerleştirin ve hücreleri aynı çözelti ile durulayın.0,5 mL %4 metanol içermeyen paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve plakayı biyogüvenlik başlığının altında 15 dakika bekletin. Paraformaldehit çözeltisini aspire edin ve iki kez kalsiyum ve magnezyum demir ile takviye edilmiş PBS ile durulayın. Her oyuğa kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş bir mL PBS ekleyin.Kapak fişlerini her bir kuyudan dikkatlice çıkarmak için steril cımbız kullanın. Bunları ters çevirin ve hücreyi içeren tarafı PBS ile temas eden görüntüleme boşluklarına yerleştirin. Şeffaf oje kullanarak kapak kaymasının dış katmanını görüntüleme ara parçasıyla kapatın.Biyolojik numuneyi doğrudan objektif merceğin altındaki numune tutucuya yükleyin. Ardından, video kamerayı açmak için yazılımdaki kamera simgesine tıklayın ve 50X objektif lens ile ilgilenilen bir bölgeyi belirlemek için odak düzlemini ayarlayın. 100X objektif lense geçin.Video kamerayı kapatmak için durdur simgesine tıklayın. Ardından mm başına 1.800 satırlık bir ızgara seçin ve toplama aralığını 400 ila 3.150 santimetre ters olarak ayarlayın. Son olarak, en az gürültü ve en doğru spektrum için alım süresini 90 saniyeye, birikimi üçe ve gruplamayı dörde ayarlayın.Lazeri ısıtmak için başlat'a tıklayın. IX3CBH kontrol kutusunun ana şalterine ve ardından dokunmatik panel denetleyicisinin ana şalterine basarak başlayın. Ardından, ana lazer birleştirici FV31S tarağına bağlı LDOBIS6 lazer uzaktan kumanda için güç kaynağının AC adaptörünün ana anahtarını açın.Ayrıca alt lazer birleştirici FV31S tarağına bağlı LDOBIS6 lazer uzaktan güç kaynağının AC adaptörünü açın. Bundan sonra, SI fotodiyot dedektörünün ana anahtarlarına basın ve amplifikatörü kilitleyin. Lazer IR'yi 1031 nanometreye ayarlayın Pico zümrüt sistemini 720 ila 990 nm arasında ayarlanabilir dalga boyuna ayarlayın.Numuneyi yağın üzerine monte edin ve numunenin sabitlendiği mikroskop lamına büyük bir su damlası yerleştirin. Tarama boyutunu 512 x 512 piksel olarak seçin. Görüntüleri bir Olympus olarak alın ve kaydedin.OIR grafik dosyası. Sinyali 862.0 olarak ayarladıktan sonra bir arka plan görüntüsü alın ve kaydedin. Bekleme süresini piksel başına sekiz mikrosaniyeye ve piksel boyutunu 512 x 512 piksele ayarlayın.Lazer deklanşör gücü parametresini 150 miliwatt'a ayarlayın 3D görüntü rekonstrüksiyonu için, uyarılmış Raman kaybını 2.850 cm ters olarak ayarlayın. İstenen tek hücreler tanımlandıktan sonra, bu hücrelerin üst ve alt katmanlarını tespit etmek için üst odak düzleminden taramak için lazeri kaydedin. Döteryum oksit, problanmış, uyarılmış Raman saçılımı, CD sinyallerinin tek hücreler üzerindeki uzamsal dağılımını görselleştirmek için kullanıldı.Kontrol hücreleri orta derecede CD, lipid ve protein bantları sergiledi. Bununla birlikte, 15 x v ve 15 x yolculuk, daha güçlü CD lipid ve protein yasakları sergiledi. Kantitatif analiz, aşırı aromatik amino asitlerin lipid sentezini %10 ila %17 oranında yukarı regüle edebileceğini, ancak protein sentezini %10 oranında azaltabileceğini gösterdi Aromatik amino asitlerle muamele edilen hücrelerin metrik analizi, flavin bölü flavinde %50'lik bir artış ve doymuş lipide bölünen doymamış lipitte %10'luk bir artış gösterdi.Kontrol altındaki şifacı hücrelerde uyarılmış Raman 3D lipid damlacık hacmi projeksiyonu ve aşırı aromatik amino asit koşulları gösterilmiştir. 3D lipid damlacıklarının kantitatif analizleri, sayımlarda bir artış gösterdi, ancak aromatik amino asitlerle muamele edilen hücrelerde kontrole kıyasla boyutta bir azalma gösterdi. Raman ve iki foton floresan görüntüleme için görüntüleme parametreleri, en iyi görüntüleme kalitesini sağlamak için bir örnekten diğerine optimize edilmelidir.Bireyler, yaşlanma ve hastalıklardaki erken metabolik değişiklikleri aydınlatan kollajen yapısını incelemek ve nörodejenerasyon veya kanserin ilerlemesini anlamak için sistemimizi ikinci harmonik nesil ile birleştirebilir. Teknolojimiz, biyolojik sistemlerde lipid ve protein sentezini yüksek hücre altı çözünürlüğü ile görselleştiren bu türden bir ilk. Teknoloji, invaziv olmayan hastalık tespiti için kliniğe de çevrilebilir.

bioorthogonal-chemical-imaging-cell-metabolism-regulated-aromatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Bu protokol, birincil hücrelerde veya izole kemiklerde amino asit tüketimini değerlendirmek için yararlı olan radyoişaretli bir amino asit alım testi sunar.

Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bu protokol, endojen metabolik koenzimlerin, indirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotidin (FAD) floresan görüntülemesini ve analizini tanımlar. NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan görüntülemesi, hücresel metabolizmayı değerlendirmek için etiketsiz, tahribatsız bir yöntem sağlar.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Keşfedin: Aromatik amino asitler tarafından düzenlenen hücre metabolizmasını, uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ve iki foton floresans mikroskobu kullanarak canlı hücrelerde yüksek kimyasal özgüllük ve hücre içi çözünürlükle görüntüleyin.

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet