Name: İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Keşfedin insan safen ven endotel hücre izolasyonunu ve kontrollü kayma stresi ile gerilme uygulamalarını. Bu yöntem, mekanik kuvvetlerin endotelyal disfonksiyondaki rolünü anlamak için güvenilir bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JEK, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ve 2013/17368-0] ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ve 309179/2013-0) hibeleriyle desteklenmektedir. AAM, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9) hibeleriyle desteklenmektedir.

<ol><li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery%3A+the+intimal+hyperplastic+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li>
<li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+responses+to+mechanical+stress%3A+where+is+the+mechanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li>
<li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li>
<li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-%CE%BAB+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133(2020).</li>
<li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li>
<li>Girão-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493(2021).</li>
<li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li>
<li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery%3A+an+exploratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+II.+Representative+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li>
<li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413(2020).</li>
<li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt%2FeNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li>
<li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li>
<li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes%2C+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+%28KLF2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li>
<li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li>
<li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype%3A+implications+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

hSVEC'leri başarılı bir şekilde izole etmek için safen ven segmenti en az 2 cm olmalıdır. Küçük segmentlerin, hücreleri izole etmek için kollajenaz çözeltisini korumak için damarın uçlarını tutması ve bağlaması zordur. Azaltılmış luminal yüzey alanı, kültürü genişletmek için yeterli hücre vermez. ECs olmayanlarla kontaminasyon riskini en aza indirmek için, safen ven segmentinin manipülasyonu tüm prosedür boyunca çok nazik olmalıdır. Kanı çıkarmak için pipet uçlarını luminal yüzeylere sokarken ve kollajenaz çözeltisinin u...

Endotel hücre (EC) disfonksiyonu safen ven greft yetmezliğinde anahtar rol oynar1,2,3,4. Kayma stresinin ve siklik gerilmenin sürekli artışı, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) proinflamatuar fenotipini indükler3,4,5,6. Altta yatan moleküler yollar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve in vitro çalışmalar için standartlaştırılmış protokoller, bölgedeki yeni anlayışlar için çabalardan yararlanabilir. Burada, hSVEC'leri izole etmek, karakterize etmek ve genişletmek için basit bir protokolü ve bunların venöz ve arteriyel hemodinamik koşulları taklit ederek değişken seviyelerde kayma stresi ve siklik gerilmeye nasıl maruz bırakılacağını açıklıyoruz.
hSVEC'ler kollajenaz inkübasyonu ile izole edilir ve 8. pasaja kadar kullanılabilir. Bu protokol, mevcut diğer protokollere kıyasla damarın daha az manipülasyonunu gerektirir7, bu da düz kas hücreleri ve fibroblastlarla kontaminasyonu azaltır. Öte yandan, verimli EC ekstraksiyonuna sahip olmak için en az 2 cm'lik daha büyük bir kap segmenti gerektirir. Literatürde, büyük damarlardan alınan ECs'lerin mekanik uzaklaştırma ile de elde edilebileceği bildirilmiştir 7,8. Etkili olmasına rağmen, fiziksel yaklaşım düşük EC verimi ve daha yüksek fibroblast kontaminasyonu gibi dezavantajlara sahiptir. Saflığı arttırmak için, manyetik boncuklar veya hücre sıralama kullanarak ekstra adımlara ihtiyaç vardır, bu da boncukların ve antikorların elde edilmesi nedeniyle protokolün maliyetini arttırır7,8. Enzimatik yöntem, EC saflığı ve canlılığı ile ilgili daha hızlı ve daha iyi sonuçlara sahiptir 7,8.
Endotel disfonksiyonunu incelemek için en sık kullanılan EC'ler insan umbilikal ven endotel hücreleridir (HUVEC'ler). EC fenotipinin farklı damar yataklarında değiştiği bilinmektedir ve incelenen damarı temsil eden yöntemlerin geliştirilmesi esastır 9,10. Bu bakımdan, bir hSVEC'in izole edilmesi ve mekanik stres altında kültürlenmesi için bir protokol oluşturulması, ven grefti hastalığında hSVEC disfonksiyonunun katkısını anlamak için değerli bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin-% 0.02 EDTA çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>15 & mikro slayt I 0.4 Luer & nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dilaktat (DAPI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>25 mm & nbsp'lik 6 kuyulu eş eksenli yükleme istasyonu;</td><td>Flexcell Uluslararası Şirketi</td><td>LS-3000B25. Çıkarılabilir kuyulu VJW</td><td></td></tr><tr><td>8 kuyulu oda kaydırağı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit (Buzul)</td><td>Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>1 cm kalınlığında akrilik levha</td><td>Pleksiglas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31, FITC antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VE-kaderin antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Bioflex plakalar kollajen I</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk sütür EP 3.5 15 x 45 cm</td><td>Brasuture</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>Siklofilin ileri astar</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Özel tasarlanmış</td><td></td></tr><tr><td>Siklofilin ters astar</td><td>Thermo Fisher Scientific Özel</td><td>tasarlanmış</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 bazal ortam</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots takviyeleri</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000 gergi sistemi</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount sulu montaj ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum 5000 IU / mL</td><td>Blau Farmac & ecirc; utica</td><td>SKU 68027</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi pompa sistemi (Pompa + Akışkan Ünitesi)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>KLF2 ileri astar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Özel tasarlanmış</td><td></td></tr><tr><td>KLF2 ters astar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Özel tasarlanmış</td><td></td></tr><tr><td>KLF4 ileri astar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Özel tasarlanmış</td><td></td>KLF4</tr><tr><td>ters astar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Özel tasarlanmış</td><td></td></tr><tr><td>NOA 280 nitrik oksit analizörü</td><td>Sievers Instruments</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 ileri astar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Özel tasarlanmış</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 ters astar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Özel tasarlanmış</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon seti 15 cm, ID 1.6 mm, kırmızı, 10 mL rezervuarlar</td><td>Ibidi</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum İyodür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR yeşil PCR kiti</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K esnek platform&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mikro kiti&nbsp;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü cam (24 mm x 60 mm)</td><td>Knittel Glass</td><td>VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum nitrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV birinci iplikli sentez sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi leke %0.4</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885'ten</td><td></td> Tip II kollajenaz</tr></tbody></table>

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Koroner arter baypas greft (KABG) cerrahisi iskemik miyokardın revaskülarize edilmesi için yapılan bir prosedürdür. Safen ven, arteriyel kanallara kıyasla azalmış uzun süreli açıklığa rağmen CABG kanalı olarak kullanılmaya devam etmektedir. Greft arteriyelizasyonu ile ilişkili hemodinamik stresin ani artışı, safen ven greftinin (SVG) düşük açıklığını etkileyebilecek vasküler hasara, özellikle de endotelle sonuçlanır. Burada, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi anlatılmaktadır. Kollajenaz sindirimi ile izole edilen hücreler tipik parke taşı morfolojisini gösterir ve endotel hücre belirteçleri CD31 ve VE-kadherini eksprese eder. Mekanik stres etkisini değerlendirmek için, bu çalışmada, arteriyalize SVG'ler üzerindeki iki ana fiziksel uyaranı, kayma stresini ve gerilmeyi araştırmak için protokoller kullanılmıştır. hSVEC'ler, kayma gerilmesi üretmek için paralel bir plaka akış odasında kültürlenir, akış yönünde hizalama ve KLF2, KLF4 ve NOS3'ün artan ekspresyonunu gösterir. hSVEC'ler ayrıca venöz (düşük) ve arteriyel (yüksek) gerilmeyi taklit eden kontrollü hücresel gerilmeye izin veren bir silikon membranda kültürlenebilir. Endotel hücrelerinin F-aktin paterni ve nitrik oksit (NO) sekresyonu buna göre arteriyel gerilme ile modüle edilir. Özetle, hemodinamik mekanik stresin endotel fenotipi üzerindeki etkisini incelemek için hSVEC'leri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Tipik olarak, yapışmış EC'ler ekstraksiyondan 3-4 gün sonra gözlenebilir. hSVEC'ler başlangıçta hücre kümeleri oluşturur ve tipik bir "parke taşı" morfolojisi gösterir (Şekil 1B). EC belirteçleri CD31 (Şekil 1C,D) ve VE-kadherini (Şekil 1D) ifade ederler. hSVEC'ler, kaplanmamış tedavi edilmiş bir hücre kültürü kabında kolayca çoğaltılabilir ve kültürdeki endotel fenotipini sekiz pasaja kadar korurlar.
<p class="...

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Safen ven, koroner arter bypass ameliyatı sonrası aniden arteriyel rahatsızlıklara maruz kalır. Mekanik strese adaptasyon tepkisini anlamak, ven grefti yetmezliğini önlemek için terapötik araçların tasarlanmasına yardımcı olabilir. Bu endotel hücre izolasyon protokolü çok basittir ve sadece kollajenaz ile inkübasyon gerektirir.Minimal damar manipülasyonu ile bu, düz kas hücreleri ve fibroblastlarla kontaminasyonun azalmasına neden olur. İnsan SVEC'lerinin izole edilmesi ve kayma stresi ve siklik gerilme altında kültürlenmesi protokolü, safen ven greft yetmezliği ile ilişkili endotel hücre disfonksiyonunda mekanik kuvvetlerin katkısını anlamak için gereklidir. Önceki endotel hücre kültürü, hücre ortamı takviyeleri açısından çok zordur.Bir kültürü, insan SVEC'lerini başarılı bir şekilde izole etmek için büyüme faktörleri eklemek zorunludur. Primer insan safen ven endotel hücrelerini veya insan SVEC'lerini izole etmek için, en az iki ila üç santimetre uzunluğunda safen ven segmenti toplayın. Steril bir laminer akış başlığı altında çalışarak, damar segmentini önceden ısıtılmış PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.Tüm kanı lümenin içinden çıkarmak için, bir pipete tutturulmuş ve PBS ile doldurulmuş bir pipet ucunu damarın bir ucuna yerleştirin ve yavaşça yıkayın. Yıkama akışı tamamen netleşene kadar yıkayın. Daha sonra damarın bir ucunu steril bir pamuk sütü ile kapatın.Kabı mililitre kollajenaz tip 2 çözeltisi başına bir miligram ile dikkatlice doldurun ve kabın diğer ucunu bir pamuk sütü ile kapatın. Kabı kollajenaz çözeltisi ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Ardından, diğer ucunu kesmeden önce kollajenaz çözeltisini toplamak için kabın bir ucunu 15 mililitrelik bir tüp üzerinde kesin.Tüpün içindeki tüm ayrılmış endotel hücrelerini kollajenaz ile toplamak için luminal yüzeyi bir ila iki mililitre PBS ile yıkayın. Tüpü oda sıcaklığında 400G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini ek bir heparin çözeltisi içeren üç ila dört mililitre tam endotel hücre ortamında tekrar askıya alın.Hücreleri, hacim başına %3 jelatin ağırlığı ile önceden kaplanmış 60 milimetrelik bir hücre kültürü kabında kaplayın. Hücreleri, ortamı değiştirmeden dört gün boyunca nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Bundan sonra, heparin takviyesi eklemeden ortamı her gün değiştirin.Kırmızı kan hücrelerinin çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında inceleyin. Ekstraksiyondan bir ila dört gün sonra, damar segmentinin boyutuna ve çapına bağlı olarak, insan SVEC'lerini faz kontrast mikroskobu ile görselleştirerek birleşme derecesini ve parke taşı morfolojisini değerlendirin. Hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaşana kadar her iki günde bir ortamı değiştirmeye devam edin.Akış odası sürgüsünü hacim başına %0,1 ağırlıkla kaplayın jelatin ve 37 santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin. Akışkan üniteyi ve 10 milimetrelik rezervuarlara sahip steril perfüzyon setini dengelemek için, bunları bir gecede nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Kesme gerilme deneyi için, tohum 200.000 endotel hücresi, jelatin kaplı akış odası slaytına 100 mikrolitre kültür ortamında askıya alınmıştır.Hücreleri kültür yüzeyine bağlamak için, hücreleri dört saat boyunca inkübe edin. Perfüzyon setini akışkan üniteye yerleştirin. Rezervuarları ve perfüzyon setini yaklaşık 12 mililitre önceden ısıtılmış tam endotel hücresi ortamı ile doldurun.Her iki rezervuarın seviyesini beş mililitrede dengelemek için perfüzyon setinden hava kabarcıklarını çıkarın. Akışkan üniteyi, inkübatördeki oda sürgüsü olmadan monte edilmiş perfüzyon setine yerleştirin ve elektrik kablosunu bilgisayar tarafından düzenlenen pompaya bağlayın. Pompa kontrol yazılımında önceden tanımlanmış protokolü çalıştırarak, rezervuarlardaki ve perfüzyon setindeki tüm hava kabarcıklarını çıkarın.Akışkan üniteyi, laminer akış başlığına monte edilmiş perfüzyon seti ile alın ve bir birleşme hücresi tek katmanına sahip kızakları takın. Tüm üniteyi inkübatördeki slaytlarla yerleştirdikten sonra, elektrik kablosunu pompaya bağlayın. Pompa kontrol yazılımında, kızak tipini seçerek ve ortamın viskozitesini ayarlayarak akışkan ünitesi kurulumunu ayarlayın.Akış parametrelerinde, kayma gerilimi değerini girin ve döngü süresini ve akış tipini ayarlayın. Ardından, denemeyi başlatmak için oynat düğmesini tıklayın. Slaytı, statik denetimler olarak akışa maruz kalmadan aynı ortamla muamele edilmiş hücrelerle tutmayı unutmayın.25 milimetrelik 6 delikli eşeksenli yükleme istasyonunun üst kısımlarına ve yanlarına silikon bazlı yağlayıcı uygulayın. Tohum 400.000 hücre, kollajen ile kaplanmış 6 kuyucuklu esnek tabanlı kültür plakalarının her bir kuyucuğuna üç mililitre halinde askıya alınmıştır. Hücreleri% 100 akıcılığa ulaşana kadar nemlendirilmiş havada inkübe edin.Germe protokolüne başlamadan önce, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın ve kuyucuk başına üç mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Taban plakasını inkübatördeki tüm yağlanmış yükleme istasyonlarıyla birlikte yerleştirin ve boruyu gerilim hücresi germe biyoreaktör sisteminin kontrolör ekipmanına uygun şekilde bağlayın. Her kültür plakasını biyoreaktör sistemi tarafından sağlanan bir kırmızı contaya takın.Sonra onları inkübatördeki taban plakasına koyun. Uygun vakum ve germe yükü elde etmek için dört kültür plakasını da taban plakasına yerleştirin. Oyun kumandası ekipmanını ve bilgisayar sistemini açın.FlexCell kontrol yazılımını açın ve uzama yüzdesi, dalga formu şekli, frekans ve zaman dahil olmak üzere istenen rejimi yapılandırın. Rejimi kurtarın. Vakum sistemini açın, ardından rejimi seçin ve germe işlemini çalıştırmak için bilgisayar ekranında başlat'ı tıklayın.Silikon membranın hareket ettiğini ve hücreleri gerdiğini kontrol edin. Yapıştırılan endotel hücreleri, ekstraksiyondan 4 ila 10 gün sonra gözlemlenebilir. Başlangıçta tipik bir parke taşı morfolojisi gösteren hücre kümeleri oluştururlar.EC belirteçleri CD31 ve VE-kadherini ifade ettiler. Kesme gerilmesi altında kültürlendiğinde hSVEC'ler akış yönünde hizalanır. 72 saat boyunca santimetrekare başına 20 dinin kayma gerilmesi, kesme uyaranının etkinliğini gösteren tipik mekanosensitif genlerin, KLF2, KLF4 ve NOS3'ün ekspresyonunu indükler.Döngüsel gerilme sonucu, insan SVEC'lerine uygulanan yoğunluğa bağlıydı. Düşük gerilme altındaki hücreler, statik hücrelere benzer kortikal bir F-aktin paterni gösterdi. Nitrik oksit salınımında 72 saate kadar bir değişiklik olmadan, arteriyel gerilme seviyelerimiz 24 saat sonra aktin hücre iskeletini yeniden şekillendirdi ve 72 saat sonra NO salınımını azalttı.Mekanik stres çalışmalarının yanı sıra, araştırmacılar izole edilmiş hücreleri endotel hücre fonksiyonu ve disfonksiyonu hakkındaki bilgileri genişletmek için çeşitli yöntemler uygulamak için kullanabilirler. Gösterilen protokolü takiben, kesme stresi ve gerilme altında başka herhangi bir endotel hücresi türünü incelemek mümkündür.

human-saphenous-vein-endothelial-cell-isolation-exposure-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Intimal hiperplazi (İH) ve ven greft yetmezliği gelişimine yol açan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma kontrollü akış ve basınç altında, insan damarları serpmek için bir ex vivo sistemini anlatmaktadır. Ayrıca dış hasırlı verimliliği fıtığın gelişimi değerlendirildi sınırlamak için.

İnsan Safen Ven Prosedürü Ex vivo Perfüzyon ve Dış Takviye

Farklı seviyelerde ve sıvı kesme paternlerinin endotelyal gen ekspresyonu, fenotipi ve hastalığa yatkınlığı modüle ettiği bilinmektedir. 'Kesme halkalarının' montajını ve kullanımını tartışıyoruz: tek yönlü, periyodik kesme gerilimi modelleri üreten bir model. Kesme halkalarının montajı kolaydır, ekonomiktir ve yüksek hücre verimi sağlayabilir.

Montaj ve &#39;Kayma Rings&#39; Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Burada, sıvı kesme stres altında endotel hücre kültür ve gen ifade analizi için iş akışı gösterilmektedir. Dahil aynı anda konut ve kontrollü bir ortamda ve eksojen başvuru RNA kullanım kantitatif PCR için birden çok akış odalarında takibi için fiziksel bir düzenlemedir.

Stres birden çok paralel-plaka akışı Chambers kullanarak yamultmak için maruz endotel hücrelerinin gen ifade Analizi

Bu protokolün amacı, kayma stresi ile mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı aktivasyonunu araştırırken kullanılmak üzere değiştirilmiş bir paralel plaka akış odasını tarif etmektir.

Iyi tanımlanmış kayma stres altında tek hücreli Iyon akımları elektrofizyolojik kayıtlar

Bu protokol, endotel hücre büyümesini yörüngesel çalkalayıcı modelini kullanarak kesme gerilme uygulaması için 6 kuyulu bir plakanın belirli bir bölgesiyle sınırlamak için bir kaplama yöntemini açıklar.

Mechanobiyolojik Çalışmalar için Orbital Çalkalayıcıda Endotel Hücrelerinin 6 Kuyu Plakalarında Parçalanması

Burada, patolojik ve fizyolojik sıvı kesme stres koşullarına maruz kalan endotel hücrelerinde yakınlık ligasyon testini (PLA) kullanarak birden fazla SMAD kompleksini aynı anda görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol oluşturuyoruz.

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Burada, insan aort duvarındaki düz kas hücrelerinin in vivo biyomekanik suşunu çoğaltmak için bir insan aort düz kas hücresi organı-on-a-chip modeli geliştirdik.

Aort Duvarındaki Biyomekanik Suşu Özetlemek İçin İnsan Aort Düz Kas Hücresi Organ-On-A-Chip Modelinin Yapımı

Burada açıklanan, endotel hücrelerini insan pluripotent kök hücrelerinden ayırt etmek için basit bir iş akışı ve ardından mekanik stimülasyonları için ayrıntılı bir protokoldür. Bu, endotel hücrelerinin gelişimsel mekanobiyolojisinin incelenmesine izin verir. Bu yaklaşım, mekanik stimülasyondan sonra kültür çipinden toplanan canlı hücrelerin aşağı akış testleriyle uyumludur.

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

Keşfedin insan safen ven endotel hücre izolasyonunu ve kontrollü kayma stresi ile gerilme uygulamalarını. Bu yöntem, mekanik kuvvetlerin endotelyal disfonksiyondaki rolünü anlamak için güvenilir bir temel sunar.

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Daha fazla video keşfet