Name: CLON-G ile Nötrofil Yaşam Süresinin Uzatılması ve In Vitro Spontan Ölüm Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Öğrenin, CLON-G ortamı kullanarak nötrofil ömrünü beş günden fazla uzatma ve akış sitometrisi ile konfokal mikroskopi ile canlılık analizi yapma yöntemini. Bu protokol, immünoloji araştırmalarında deneysel manipülasyon olanaklarını artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje, Haihe Hücre Ekosistemi İnovasyon Fonu Laboratuvarı (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Çin Tıp Bilimleri Akademisi (CAMS) Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Merkez Üniversiteler Özel Araştırma Fonu, Pekin Birliği Tıp Koleji (3332022062) ve Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (NO. 2021YJ0480) tarafından desteklenmiştir.

Boston Çocuk Hastanesi ve Deneysel Hematoloji Eyalet Anahtar Laboratuvarı (SKLEH) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tüm prosedürleri onayladı ve izledi. Şekil 1 , CLON-G ve in vitro ölüm testi ile nötrofil kültürlenmesinin bir akış şemasını göstermektedir.
1. CLON-G ile nötrofil ömrünün uzatılması
NOT: Belirtilen tüm işlemler ve malzemeler steril olmalıdır. Tüm çözeltilerin iyi karıştırıldığından ve eşit olarak dağıtıldığından emin olun.
<ol><li>CLON-G bileşenlerinin korunması<ol><li>973.7 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek 50 mg Q-VD-oph'u ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 mM'lik nihai konsantrasyona çözün ve karışım berraklaşana kadar sıvıyı pipetin. Aliquot tüp başına 50 μL ve -20 °C'de muhafaza edin. DİKKAT: DMSO zararlı bir kimyasal sıvıdır. Cilt teması, göz teması ve solumaktan kaçınmak için laboratuvar önlüğü, gözlük ve maske takın.</li>
		<li>Hsp70'i 4 ° C'de çözün ( Malzeme Tablosuna bakın) ve şişedeki içeriği aşağı doğru döndürün. Aliquot buz üzerinde tüp başına 1 μL Hsp70 ve -80 ° C'de koruyun. NOT: Hsp70 bir proteindir; Sabit tutmak için ultra soğuk depolama gereklidir. Donma-çözülme döngüsünden kaçının.</li>
		<li>Tüp başına 200 μM. Aliquot 500 μL'lik bir stok elde etmek için 1 mg DFO'yu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 7.61 mL RPMI 1640 ile çözün ve -20 ° C'de koruyun.</li>
		<li>0.1 g NAC'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 2.5 mL RPMI 1640 ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde çözün ve pH'ı NaOH ile 7-7.4'e ayarlayın. 200 mM NAC stoğu oluşturmak için RPMI 1640'ı 3,06 mL'lik son hacme ekleyin. 0,2 μm filtreleme ünitesi ile filtreleyin. Tüp başına 500 μL aliquot ve -20 ° C'de koruyun. NOT: NAC'ın bu yüksek konsantrasyonda çözülmesi kolay değildir ve vorteksleme çözülmesine yardımcı olabilir. RPMI 1640'taki fenol kırmızısı, pH'ın mükemmel bir göstergesidir; NAC yeni çözündüğünde, renk sarımsıdır; pembemsi hale gelene kadar ayarlayın. NAC stok çözeltileri −20 °C'de 1 aya kadar kararlıdır.</li>
		<li>10 mg Nec-1'leri ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1.8 mL DMSO ile 20 mM'ye çözün ve berraklaşana kadar karışımı pipetin. Aliquot tüp başına 50 μL ve -20 °C'de muhafaza edin. Işıktan koruyun.</li>
		<li>250 μg G-CSF'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1,25 mL RPMI 1640 ile 200 μg/mL'ye çözün. Aliquot tüp başına 50 μL ve 4 °C'de muhafaza edin.</li>
	</ol></li>
	<li>2x CLON-G kültür ortamının hazırlanması<ol><li>Temel ortamı hazırlayın. RPMI 1640'ı temel bir ortam olarak% 20 FBS ve% 1 PS ile RPMI 1640 yapmak için 50 mL'lik bir tüpe 39.5 mL RPMI 1640, 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 0.5 mL kalem strep (antibiyotikler) ekleyin. NOT: Bu yüksek FBS konsantrasyonu, 5 günden fazla olabilen uzun süreli nötrofil kültürünü sağlamak için kullanılır. Kültürleme süresi 1-2 gün ise %10-%15 FBS yeterlidir.</li>
		<li>CLON-G bileşenlerinin tüm stok çözümlerini buz üzerinde çözün.</li>
		<li>Temel ortamdan 606 μL ekleyerek 1 μL Hsp70 ila 20 μM arasında seyreltin. Temel ortamdan 9 μL ekleyerek 200 μg/mL G-CSF'nin 1 μL'sini 20 μg/mL'ye seyreltin.</li>
		<li>15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 976 μL bazik ortam ekleyin. 1 μL 2x CLON-G ortamı yapmak için 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) ve 1 μL G-CSF (20 μg / mL) ekleyin. NOT: 2x CLON-G ortamı hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır. 2x CLON-G geçici olarak 4 °C'de saklanabilir. Artık 20 μM Hsp70 atılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Nötrofil kültürü<ol><li>Fare nötrofillerini, önceki bir rapor25'i takiben gradyan santrifüjleme ile izole edin. İzole edilmiş fare nötrofillerini temel ortamda (1 milyon hücre/100 μL) yeniden askıya alın. NOT: Nötrofilleri nazikçe kullanarak aktive etmekten kaçının. Tüm süreç boyunca köpüklenmeyi önleyin.</li>
		<li>24 kuyucuklu doku kültürlü olmayan kültür plakalarına 500 μL 2x CLON-G ortamı, 400 μL bazik ortam ve 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin (bkz. NOT: 2x CLON-G ortamındaki bileşenlerin yüksek konsantrasyonları nötrofillere zarar verebilir; Temel ortam olmadan bunları bir araya getirmekten kaçının. Doku kültürü olmayan kültür plağı, nötrofil yapışmasını önlemek için gereklidir.</li>
		<li>Kültür plakasını 37 °C ve %5 CO2 inkübatöre sorunsuz bir şekilde yerleştirin. NOT: Hücre ortamını 7 gün içinde değiştirmek gereksizdir. CLON-G bileşiminin nihai konsantrasyonları 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s ve 10 ng / mL G-CSF'dir.</li>
		<li>Kültürlenmiş nötrofilleri Wright Giemsa bileşik boyası ile lekeleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ışık mikroskobu ile analiz edin (Şekil 2A-D). Alternatif olarak, APC-CD11b ve PE-Cy7-Ly6G antikorları ile boyayın ve daha önce açıklandığı gibi akış sitometrisi (Şekil 2E-I) ile analiz edin26.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Nötrofillerin in vitro spontan ölüm testi
<ol><li>Akış sitometrisi analizi<ol><li>Kültür, nötrofilleri bazik ortamda 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 1 milyon hücre / mL yoğunluğunda izole etti. 24 kuyucuklu kültür plağı doku kültürü dışıdır. Kuyucuk başına 1 mL hücre ortamı ekleyin.</li>
		<li>200 mM CaCl2 yapmak için 1 g CaCl2'yi 45 mL salin ile çözün. 0,2 μm filtreleme ünitesi ile filtreleyin. 4 °C'de muhafaza edin.</li>
		<li>Boyama karışımını hazırlayın. 1,5 mL'lik bir tüpe numune başına 7 μL salin ekleyin ve numune başına her biri 1 μL'de 0,4 mg/mL FITC-Annexin-V, 0,5 mg/mL propidyum iyodür (PI) ve 200 mM CaCl2 çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın. Çözeltiyi hazırlandıktan hemen sonra kullanın.</li>
		<li>İyice karıştırmak için hücre ortamını yavaşça beş ila yedi kez pipetin, ardından istenen zaman noktalarında bir akış sitometri tüpüne 100 μL aktarın. NOT: Tüm süreç boyunca köpüklenmeyi önleyin.</li>
		<li>Vorteks sayma boncukları (bakınız Malzeme Tablosu) iyice karıştırmak için. İyi karıştırılmış sayma boncuklarının 10 μL'sini adım 2.1.4'teki gibi aynı akış sitometri tüpüne pipetleyin.</li>
		<li>Hazırlanan boyama karışımını (adım 2.1.3) akış sitometri tüpüne 10 μL ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan 5 dakika uzakta inkübe edin.</li>
		<li>Tüpe 100 μL salin ekleyin ve sayma boncuklarının ve hücrelerinin eşit dağılımını sağlamak için iyice karıştırın.</li>
		<li>Hücre ortamının akış sitometri analizini yapın. Hücreleri ~ 400 olay / s ile düşük bir hızda toplayın. APC-PE-Cy7- hücrelerini FSC-A ve SSC-A'ya ve orta FSC-A ve SSC-A konumlarına sahip sağlam hücreleri FITC-Annexin-V ve PE-PI'ye geçirin; Ek-V-PI− popülasyonu sağlıklı hücreler olarak sınıflandırılır. NOT: Aşağıdaki denklemler, numune başına toplam sağlıklı hücre sayısını ve nötrofillerin yaşayabilirliğini belirler: Numune başına toplam sağlıklı hücre sayısı27 = (1.000/sayma boncuk sayısı) × Ek-V−PI− popülasyon sayısı × 10 Nötrofillerin yaşayabilirliği = belirtilen zamanda toplam sağlıklı hücre sayısı/sıfır zamanındaki toplam sağlıklı hücre sayısı</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan görüntü testi<ol><li>Kültür, bazik ortamda 37 ° C'de 1 milyon hücre / mL yoğunluğunda nötrofilleri ve plaka başına 2 mL hücre ortamı olan konfokal bir plakada% 5 CO2'yi izole etti. NOT: Bir konfokal floresan mikroskobu en iyi görüntü kalitesine sahiptir, ancak 488/561/DIC kanallarına sahip herhangi bir floresan mikroskobu bu deneyi desteklemek için yeterlidir.</li>
		<li>Plakayı belirtilen zaman noktasında yavaşça çıkarın. Plakaya eşit olarak 0.4 mg / mL FITC-Annexin-V, 0.5 mg / mL PI ve 200 mM CaCl2'nin her biri 10 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca lekeleyin. NOT: Tüm süreç boyunca titremekten kaçının. Boyama maddelerini eşit ve nazikçe ekleyin.</li>
		<li>20x objektif lensli konfokal floresan mikroskobu kullanarak 488 (ek-V)/561 (PI)/DIC kanallarında floresan görüntüler yakalayın (bkz. 488 kanalın pozlama süresini 500 ms, 561 kanalın pozlama süresini 200 ms ve DIC kanalının 100 ms olarak ayarlayın. Her plaka için 5-10 rastgele alan seçin. Hücre tipleri daha önce yayınlanan rapor14'te tanımlanmıştır.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarlar, araştırmanın herhangi bir çıkar çatışması olmadan yapıldığını beyan ederler.

Nötrofiller doğuştan gelen ve adaptif bağışıklıkta hayati roller oynar ve homeostazları sıkı bir şekilde düzenlenir. Nötrofiller, insan periferik kanındaki en bol lökositlerdir ve sağlam ve hızlı bir ciroya sahiptirler. Sağlıklı bir yetişkin, kemik iliğinden günde 1 x 109 nötrofil / kg salgılayabilir28. Nötrofillerin ölümü bu nedenle bu alanın şaşırtıcı gizemlerinden biri haline geldi ve onları daha iyi anlamak için çok çaba sarf edildi. Kaspaz 29,30,31,32</...

Nötrofillerin bol miktarda sitoplazmik granül, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz, antimikrobiyal enzimler ve istilacı mikroplara karşı savunma yapan çeşitli organellerden oluşan bir cephanelik içerdiği bilinmektedir; Ek olarak, oldukça hareketlidirler ve iltihaplanma bölgesine alınan ilk hücrelerdir, yani nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ilk savunma hattıdır 1,2. Bu nedenle granülosit transfüzyon tedavisi, nötropeniye bağlı enfeksiyonlar için nötrofil bağışıklığını geçici olarak artırmak için umut verici bir klinik tedavi haline gelmiştir 3,4,5. Son keşifler, nötrofillerin birçok fizyopatolojik senaryoda çok yüzlü efektörler olarak da işlev gördüğünü açıkça göstermiştir6. Bir nötrofilin ortalama ömrü 24 saatten azdır ve bu nedenle, nötrofiller üzerine temel araştırmalar ve nötrofil çalışmalarının uygulanması, kararlı genetik manipülasyon ve uzun süreli depolama ile ilgili sınırlamalar nedeniyle son derece zordur 7,8,9,10,11 . HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler12 gibi bazı nötrofil fonksiyonlarını kısmen sergileyebilen bazı hücre hatları vardır. Bu hücre hatları etkili gen düzenleme ve kriyoprezervasyon sağlayabilir; Bununla birlikte, birincil nötrofillerden hala oldukça farklıdırlar ve bu nedenle nötrofil fonksiyonlarını sadık bir şekilde özetleyemezler13. Bu nedenle, bu alandaki araştırmaların çoğu hala taze izole edilmiş birincil nötrofillere dayanmaktadır. Alan hala nötrofillerdeki spesifik gen fonksiyonlarını araştırmak için pahalı ve zaman alıcı koşullu nakavt fareleri üretmeye dayanıyor, ancak şu anda hiçbir insan modeli mevcut değil.
Nötrofil ölümünde yer alan heterojen süreçleri ve bu süreçleri düzenleyen çoklu yolları keşfetmeye yönelik çabalarımızı ortaya koyduktan sonra,14,15, CLON-G (kaspazlar-lizozomal membran geçirgenliği-oksidan-nekroptoz inhibisyonu artı granülosit koloni uyarıcı faktör) olarak adlandırılan yeni bir tedavi yakın zamanda bildirilmiştir 16. KLON-G, Q-VD-oph (kinolil-valil-O-metilaspartyl-[-2,6-diflorofenoksi]-metil keton), Hsp70 (ısı şoku proteini 70), DFO (deferoksamin), NAC (N-asetilsistein), Nec-1'ler (nekrostatin-1'ler) ve G-CSF'den (granülosit koloni uyarıcı faktör) oluşur. Nötrofil spontan ölümüne, apoptoz, nekroptoz ve piroptoz dahil olmak üzere birçok yol aracılık eder. Q-VD-oph, kaspaz 1, kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 917'yi hedef alarak nötrofillerin pan-kaspaz inhibitörü olarak apoptozunu inhibe eder. Nötrofil nekroptozu, reseptörle etkileşime giren protein kinaz-1 (RIPK1) ve karışık soy kinaz etki alanı benzeri proteini (MLKL)18 içeren bir sinyal yoluna bağlıdır. Bir RIPK1 inhibitörü olarak, Nec-1'ler nötrofillerin nekrotozunu inhibe eder. Hsp70 ve DFO, nötrofil apoptozu19 ve piroptoz20'yi indükleyebilen lizozomal membran geçirgenliğini (LMP) inhibe edebilir. Reaktif oksijen türleri (ROS), LMP19 ve apoptoz21'e aracılık ederek ve sağkalım sinyallerini22'yi inhibe ederek nötrofil ölümünde hayati rol oynamaktadır. ROS birikimini azaltabilen bir antioksidan olarak NAC, nötrofil ölümünü geciktirir. Bir büyüme faktörü olarak, G-CSF nötrofil sağkalım sinyallerini aktive eder ve calpain kaynaklı apoptozu inhibe eder23,24. Aynı anda birden fazla nötrofil spontan ölüm yolunu hedefleyerek, nötrofil ömrü, işlevlerinden ödün vermeden etkili bir şekilde 5 günden fazla uzatılabilir. CLON-G tedavisi, nötrofil topluluğundaki araştırmaları hızlandırabilecek nötrofil koruma, taşıma ve gen manipülasyonu olanaklarını genişletir. Bu arada, nötrofil ölümü bilgisine dayanarak, hücre ölümü testleri için şu anda onaylanmış protokoller nötrofillerde beklenmedik hasara neden olabilir14, bu nedenle bu protokoller nötrofil çalışmaları için daha uygun olacak şekilde rafine edilmiştir. Bu rapor, CLON-G ile nötrofil kültürlemesi için ayrıntılı protokoller ve akış sitometrisi ve floresan görüntüleme kullanılarak fare nötrofillerinin in vitro hücre ölüm testini sunmaktadır. CLON-G hem fare hem de insan nötrofilleri üzerinde etkilidir; ancak, bu protokolü basitleştirmek için fare örnekleri burada gösterilmiştir. NAC konsantrasyonu, fare nötrofilleri için 1 mM ve insan nötrofilleri için 10 μM'dir. Hsp70 türe özgüdür ve bu nedenle nötrofilin kaynağına göre kullanılmalıdır. Bu protokol için, nötrofillerin periferik kandan mı yoksa kemik iliğinden mi izole edildiği ve nasıl izole edildiği önemli değildir.
Bu çalışma için, deneyler için yeterli nötrofil elde etmek için fare kemik iliğinden nötrofiller izole edilmiştir, çünkü kemik iliğinden yaklaşık 1 x 10 7-1.5 x 107 nötrofil elde edilebilirken, tek bir 8-12 haftalık C57BL / 6 faresinin (her iki cinsiyetten) periferik kanından sadece 1 x 106 nötrofil izole edilebilir. Gradyan santrifüjlemesi, FACS ayıklama veya MACS sıralamanın mekanik uyarımından kaynaklanan olası hasarı ve aktivasyonu önlemek için gerçekleştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mikro; m şırınga filtresi</td><td>Pall Corporation</td><td>4612</td><td>Filtrat hazırlanmış CLON-G bileşenleri.</td></tr><tr><td>1,5 mL mikro santrifüj tüpü</td><td>LABSELECT</td><td>MCT-001-150</td><td>Lab sarf malzemesi.</td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj Tüpleri</td><td>LABSELECT</td><td>CT-002-15</td><td>Lab sarf malzemesi.</td></tr><tr><td>24 kuyulu hücre kültürü plakası</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Nötrofil kültür plakası.</td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpleri</td><td>LABSELECT</td><td>CT-002-50</td><td>Lab sarf malzemesi.</td></tr><tr><td>Nötrofil ölümünün akış sitometrisi analizi için</td> <td>BD LSRII</td><td>BD</td><td></td> Cihazı.</tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>Annexin-V bağlanmasının yardımcı maddesi ve fosfatidilserine.</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Perkinelmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>Nötrofil ölümünün floresan analizi için cihaz.</td></tr><tr><td>Konfokal plaka</td><td>NEST</td><td>801001-20mm</td><td>Floresan görüntü tahlili için laboratuvar sarf malzemesi.</td></tr><tr><td>Boncuk sayma</td><td>Thermo Fisher</td><td>C36950</td><td>Nötrofil ölümünün akış sitometrisi analizinde miktar tayini.</td></tr><tr>CLON-G'nin <td>DFO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9533</td><td>Bileşeni. LMP inhibitörü.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Q-VD-oph ve Nec-1'ler için çözücü.</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>Nötrofil kültürü temel ortamının bileşeni. Beslenme kaynağı.</td></tr><tr><td>FITC-Annexin-V</td><td>BD</td><td>51-65874X</td><td>Annexin-V, yaşlı hücrelerin fosfatidilserisine bağlanabilir. Bu FITC kanalında.</td></tr><tr><td>Hsp70</td><td>Abcam</td><td>ab113187</td><td>CLON-G'nin Bileşeni. LMP inhibitörü.</td></tr><tr>CLON-G'nin <td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>bileşeni. Antioksidan.</td></tr><tr><td>NEC-1S</td><td>EMD Millipore</td><td>852391-15-2</td><td>CLON-G'nin Bileşeni. Nekrotoz inhibitörü.</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (PS)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>Nötrofil kültürü temel ortamının bileşeni. Hücreleri bakteri komtaminasyonundan korumak için antibiyotikler.</td></tr><tr><td>Propidium Iodür (PI)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td>Nötrofil ölüm testi için. DNA'ya bağlanan küçük bir floresan molekülü&nbsp; ancak sağlam bir plazma zarına sahip hücrelere pasif olarak geçemez.</td></tr><tr><td>Q-VD-oph</td><td>Selleck chem</td><td>S7311</td><td>CLON-G'nin Bileşeni. Pan-kaspaz inhibitörü.</td></tr><tr><td>Enjeksiyon için Rekombinant İnsan Granülosit Koloni Uyarıcı Faktör (CHO hücresi) (G-CSF)</td> <td>Chugai Pharma China</td> CLON-G'nin <td>GRANOSIT</td><td>Bileşeni.&nbsp; Akt yolu ile nötrofil sağkalımını teşvik edin.</td></tr><tr><td>Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler</td><td>Falcon</td><td>100-0102</td><td>Akış sitometrisi analizi için laboratuvar sarf malzemesi.</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>Nötrofil kültürü temel ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>Salin</td><td>LEAGENE</td><td>R00641</td><td>Nötrofil ölümünün akış sitometrisi analizi için çözelti.</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>FENG CHUAN</td><td>13-011-00029</td><td>NAC için pH ayarlaması.</td></tr><tr><td>Wright-Giemsa Leke Çözeltisi</td><td>Solarbio</td><td>G1020</td><td>Nötrofil sitospin boyama.</td></tr></tbody></table>

clon-g ile nötrofil yaşam süresinin uzatılması ve in vitro spontan Ölüm testi

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

Bir nötrofilin ortalama ömrü 24 saatten azdır, bu da nötrofiller hakkındaki temel araştırmaları ve nötrofil çalışmalarının uygulanmasını sınırlar. Önceki araştırmamız, çoklu yolakların nötrofillerin kendiliğinden ölümüne aracılık edebileceğini göstermiştir. Bu yolakları, kaspaz-lizozomal membran geçirgenliğini-oksidan-nekroptoz inhibisyonunu ve granülosit koloni uyarıcı faktörü (CLON-G) eş zamanlı olarak hedefleyerek, nötrofil fonksiyonunu önemli ölçüde tehlikeye atmadan nötrofil ömrünü 5 günden fazla uzatan bir kokteyl geliştirilmiştir. Aynı zamanda, nötrofil ölümünü değerlendirmek ve değerlendirmek için güvenilir ve istikrarlı bir protokol de geliştirilmiştir. Bu çalışmada CLON-G'nin nötrofil ömrünü in vitro olarak 5 günden fazla uzatabildiğini göstermiş, FACS ve konfokal floresan mikroskobu ile nötrofil ömrünün uzamasını sergilemiş bulunmaktayız. Bu rapor, CLON-G'nin hazırlanması için prosedürleri tanıtmakta ve nötrofillerin incelenmesi ve daha sonra nötrofil ölümünün sorgulanması için kullanılabilecek nötrofillerin in vitro spontan ölüm testini sergilemektedir, böylece nötrofil topluluğu için güvenilir bir kaynak sağlamaktadır.

CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin Wright-Giemsa boyalı morfolojisi (Şekil 2A-D) ve FACS fenotipleri (Şekil 2E-J) etkilenmedi. CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin 24 saatte yaşayabilirliği, akış sitometri analizine (Şekil 3) ve floresan görüntü analizlerine (Şekil 4) dayanarak yaklaşık% 90 + idi. Daha düşük canlılık, yanlış depol...

Bu protokol, nötrofil ömrünü 5 günden fazla uzatmak için CLON-G'nin hazırlanmasını detaylandırır ve akış sitometrisi ve konfokal floresan mikroskobu ile nötrofil ölümünü değerlendirmek için güvenilir bir prosedür sağlar.

CLON-G ile Nötrofil Yaşam Süresinin Uzatılması ve In Vitro Spontan Ölüm Testi

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

Protokolümüz, nötrofil fonksiyonlarından ödün vermeden nötrofil ömrünü beş günden fazla uzatmak için bir kokteyl ortamı sağlar. Ayrıca nötrofiller için güvenilir in vitro diyaliz sunar. CLON-G tedavisi, nötrofil topluluğundaki araştırmaları hızlandırabilecek nötrofil koruma, taşıma ve gen manipülasyonu olanaklarını genişletir.Başlamak için, 50 mililitrelik bir tüpe RPMI 1640 FBS ve kalem strep ekleyerek temel ortamı hazırlayın. Aynı zamanda, CLON-G bileşenlerinin tüm stok çözümlerini buz üzerinde çözün. Daha sonra HSP 70 ve 200 mikrogramlarını temel ortamda mililitre G-CSF başına seyreltin.976 mikrolitre bazik ortamı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Buna, makalede açıklandığı gibi bir mililitre 2x CLON-G ortamı hazırlamak için CLON-G bileşenlerini ekleyin. Daha sonra, izole edilmiş fare nötrofillerini temel ortamda askıya alarak nötrofil kültürünü hazırlayın.CLON-G ortamını ekleyin, ardından temel ortamı 24 iyi doku kültürlü olmayan plakaya ekleyin. Daha sonra hazırlanan hücre süspansiyonundan 100 mikrolitre ekleyin ve üç ila dört kez hafifçe pipetin. Kültür plakasını% 5 karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede inkübe edin.Kültürlenmiş nötrofilleri sitospin ile

neutrophil-lifespan-extension-with-clon-g-an-vitro-spontaneous-death

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokolü biz ölçmek için bir yöntem mevcut.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

50 yıldan fazla üreme canlılığını değerlendirmek için clonogenic testin uygulanabilirliği için kurulmuştur. Burada yapışık hücrelere clonogenic tahlil yapmak için genel prosedür göstermektedir.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

Model organizma Caenorhabditis elegans'ta mitokondriyal inhibitörlerin etkilerinin in vivo tespiti ve potansiyel arttırıcı bileşiklerin tanımlanması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonu modüle eden bileşikler için ilaç kütüphanelerini taramak için kullanılabilir.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Biz burada elde edilmesi ve nötrofil kaynaklı dev fagositler bir yeni özelliği alt popülasyonunu belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücreler taze insan kan nötrofillerinin kültüre geliştirmek ve fagositoz, Otofaji, gayet büyük bir boyut ve uzun ömrü ile karakterize edilir. Bu yöntem ayrıca, bu benzersiz nötrofil türevi alt popülasyonu araştırılması gereklidir.

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI'nin Gelişimi ve Kimlik İn Vitro

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Burada sunulan, mikrofabrikasyon çok kuyucuklu cihazlarda katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokoldür. Bu yaklaşım, bireysel hayvanların, aktivite, vücut büyüklüğü ve şekli, hareket geometrisi ve hayatta kalma dahil olmak üzere yaşlanma ve sağlıkla ilgili çeşitli fenotipler için yaşamları boyunca izlenmesini sağlar.

Çok Kuyulu Cihazlarda Katı Ortamda İzole Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Kültürü ve İzlenmesi

Burada, yaşam boyu fizyolojik parametre takibi ve floresan ölçümü için katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu kültür sistemi, hayvanların kaçmasını önlemek için tek solucan kuyularının etrafında bir palmitik asit bariyeri içerir ve patojenik bakteriler ve kimyasal stresörler de dahil olmak üzere önleyici müdahalelerin kullanılmasına izin verir.

Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel caenorhabditis elegans'ın uzun süreli kültürü

Bu protokol, her bir gen nakavtının ölüm düzenleyici etkisini ölçmek için MEDUSA analitik yönteminin nasıl kullanılacağını açıklar. Hassasiyeti optimize eden deneysel koşulların belirlenmesine ilişkin talimatlar ve analizin gerçekleştirilmesine ilişkin adım adım bir eğitim içerir.

Kemo-genetik Profilleme Verilerinde Ölüm Düzenleyici Genlerin Tanımlanması için MEDUSA

Bu protokol, Caenorhabditis elegans'ta embriyonik ölümlülük oranını nicelendirmek için basit ve düşük maliyetli bir prosedür sunar. Özel ekipman veya solucan toplama uzmanlığı olmadan popülasyonlar arasında embriyonik anormalliklerin doğrudan tespit edilmesini sağlar. Protokol, genetik mutasyonların, RNA girişimiyle yapılan gen çökerliklerinin ve diyetin etkilerini nicelendirmek için kullanılabilir.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik ölümcüllük oranının nicelendirilmesi

Öğrenin, CLON-G ortamı kullanarak nötrofil ömrünü beş günden fazla uzatma ve akış sitometrisi ile konfokal mikroskopi ile canlılık analizi yapma yöntemini. Bu protokol, immünoloji araştırmalarında deneysel manipülasyon olanaklarını artırır.

CLON-G ile Nötrofil Yaşam Süresinin Uzatılması ve In Vitro Spontan Ölüm Testi

Daha fazla video keşfet